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C lasificacin
del ensayo :
IC
Principio de la prueba
El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba esttica de toxicidad aguda (120 horas de exposicin) en el que se pueden
evaluar los efectos fitotxicos de compuestos puros o de mezclas complejas
en el proceso de germinacin de las semillas y en el desarrollo de las plntulas
durante los primeros das de crecimiento. Como puntos finales para la evaluacin de los efectos fitotxicos, se determina la inhibicin en la germinacin y
la inhibicin en la elongacin de la radcula y del hipocotilo (figura 4.1). Es
importante destacar que durante el perodo de germinacin y los primeros das
Este ensayo apareci publicado originalmente en G. Castillo (ed.). 2004. Ensayos toxicolgicos y mtodos
de evaluacin de calidad de aguas. Estandarizacin, intercalibracin, resultados y aplicaciones. IDRC,
IMTA, Canad. 202 pp. Se reproduce con la autorizacin de la editorial.
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Intercalibrados
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Hipocotilo
Radcula
Semilla
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Material
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Equipo
Cmara oscura de temperatura controlada (22 2 C).
Reactivos
Agua dura reconstituida (APHA, 1992). Para su preparacin se recomienda
utilizar reactivos grado ACS y agua destilada en vidrio o de calidad Millipore
Super Q. La forma de preparacin de esta agua se muestra en ensayo de toxicidad aguda con el cladcero Daphnia Magna de este documento.
Organismos de prueba
En este ensayo se usan semillas de lechuga de la especies L. sativa L variedad
mantecosa.
Obtencin, control y conservacin de las semillas
La obtencin de las semillas de lechuga se realiza en semilleras locales,
procurando que sean semillas sin curar (sin fungicidas o plaguicidas), con
buen poder germinativo y baja variabilidad en la elongacin de la radcula e
hipocotilo.
Verificacin de la viabilidad de las semillas
Previo a la implementacin de la prueba, es recomendable verificar que cada
lote nuevo de semillas que se utilice tenga un porcentaje de germinacin
superior al 90%, sincronizacin en la germinacin y baja variabilidad de
la elongacin de la radcula e hipocotilo (coeficiente de variacin < 30%).
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Procedimiento de prueba
Preparacin de las diluciones
Para realizar una curva dosis respuesta se recomienda preparar un mnimo
de 5 o 6 diluciones de la muestra o compuesto a estudiar de manera que se
obtengan valores de toxicidad intermedios entre el 100 y 0%. Para las muestras
ambientales se recomienda el uso de un factor de dilucin de 0.3 o 0.5 para
la preparacin de la serie de diferentes concentraciones. El uso de un factor
de 0.3 permite evaluar la toxicidad considerando el intervalo entre el 100% y
1% de la muestra realizando 5 diluciones (100, 30, 10, 3 y 1%). Al aplicar un
factor de dilucin de 0.5, es necesario utilizar mayor nmero de diluciones
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Tipo de ensayo
Temperatura
Calidad de luz
Volumen de la solucin de prueba
Agua de dilucin
Nmero de semillas por rplica
Nmero de rplicas
Duracin de la prueba
Efecto medido
Resultado final
Aceptabilidad de los resultados
Control positivo
Esttico
20 2 C
Oscuridad
4 mL
Agua dura reconstituida
20
3
120 horas
Inhibicin en la elongacin de la radcula
e hipocotilo. Inhibicin en la germinacin
CE50 o CI50 o % inhibicin
Germinacin > 90%
Control positivo y negativo de acuerdo
con los valores admitidos en las cartas control
Zn (II) a partir de ZnSO4
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22 2 C
Oscuridad
Control negativo
(agua dura
reconstruida)
4 mL de
inhibicin
120 h
Control positivo
Zn (II)
Control positivo
Zn (II)
Diluciones de la muestra
120 h de exposicin
Ensayo esttico
(mm)
(mm)
Efecto en la germinacin
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Figura 4.4. Estadios por los que atraviesa la semilla Lactuca sativa
durante el ensayo de germinacin y elongacin
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4
2
3
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Antes de retirar las plntulas de las cajas Petri para evaluar el efecto en
los puntos finales anteriormente mencionados, es importante realizar una
observacin detallada del estado general de las mismas y del crecimiento de la
radcula sobre el papel de filtro. Informar cualquier indicador de fitotoxicidad
o de crecimiento anormal en las plntulas tratadas y en los controles (pices
radiculares con necrosis, pelos absorbentes poco desarrollados, radculas
con crecimiento ensortijado, necrosis en los cotiledones, etc.). La necrosis
(presencia de tejido muerto) se evidencia como manchas localizadas de
coloracin parda, blanca o marrn. Al evaluar el efecto en la germinacin,
consignar adems aquellas semillas con germinacin anormal (emergencia
de cotiledones o cotiledones e hipocotilo solamente, pero sin emergencia de
la radcula) o con desarrollo de hongos.
Un procedimiento factible de realizar para facilitar la medicin de la
radcula e hipocotilo, es proceder a congelar las cajas Petri correspondientes
a todos los tratamientos y descongelarlas a medida que se van midiendo
(no conservar el material luego de ser descongelado). De esta manera las
plntulas descongeladas adquieren una consistencia blanda, favoreciendo la
medicin. Si se procede a evaluar el efecto sobre las plantas descongeladas es
importante proceder de igual manera con todas las rplicas de la prueba. Este
procedimiento reduce la variabilidad en las medidas, principalmente cuando el
crecimiento de las radculas es ensortijado o no es parejo. Por otro lado, antes
de congelar el material se debe realizar previamente la observacin general de
efectos fitotxicos en las plantas vivas al finalizar el perodo de exposicin.
Expresin de resultados
Se realizan los siguientes clculos:
Promedio y desviacin estndar de la elongacin de la radcula y del hipocotilo de las plntulas de cada repeticin
Porcentaje de inhibicin del crecimiento de la radcula y del hipocotilo
con el promedio de elongacin para cada dilucin respecto del promedio
de elongacin del control negativo
Porcentaje de inhibicin en la germinacin
Con los datos anteriores, se elabora la grfica dosis-respuesta, colocando
en la ordenada el porcentaje de inhibicin y en la abscisa la concentracin.
Mediante un mtodo grfico o el uso de programas estadsticos, se calcula
la concentracin que produce el 50% de inhibicin (CI50/CE50) para cada
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Bibliografa
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