Artculos breves

Hacia la evaluacin global

de la respuesta inmunolgica
Towards a Global Evaluation
of the Immune Response
M.a Arnzazu Rodrguez Caballero
Resumen
Los diferentes elementos celulares y solubles que componen el sistema inmunolgico actan de forma coordinada en la defensa del organismo. Las citocinas son protenas que ponen
en comunicacin las clulas de este sistema entre s y con otras clulas, contribuyendo directamente
a la coordinacin global de la respuesta inmunolgica. Para evaluar su estado funcional hemos desarrollado un mtodo rpido y sensible que permite identificar y caracterizar las clulas secretoras de
citocinas y, simultneamente, cuantificar los niveles de mltiples citocinas producidas por dichas clulas, en forma soluble, sin apenas alterar el microambiente celular.

Palabras clave
Sistema inmunolgico. TNF-. Citocinas. Citometra de flujo.

Abstract
The multiple cellular and soluble elements that compose the immune system respond as a whole in a coordinate manner for the defence of the organism. Cytokines are proteins that
promote the communication amongst immune cells themselves or amongst immune cells and other
cells, contributing to coordinate the global response of the immune system. To ascertain its functional status we have developed a rapid and sensitive method for the simultaneous identification and
characterization of cytokine-secreting cells and quantitation of the soluble cytokines produced by
those cells, without an appreciable alteration of cellular microenvironment.

Key Words
Immune system. TNF-. Cytokines. Flow Cytometry.

La autora es Licenciada en Ciencias Qumicas y desarrolla su trabajo en el Centro de Investigaciones del Cncer
de Salamanca, bajo la direccin del Dr. Alberto Orfao. El mtodo que describe ha sido desarrollado en colaboracin con el Dr. Andrs Garca Montero y ha sido premiado con el Exceptional Student Award en el XXI Congreso
de la International Society for Analytical Cytology (ISAC), celebrado el pasado mes de mayo en San Diego
(California, EE.UU.).
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Ante cualquier agente extrao que entre en contacto con el organismo, ya sea de origen interno (por ejemplo, clulas tumorales) o externo (agentes infecciosos),
el sistema inmunolgico pone en marcha una respuesta basada en el reconocimiento previo
de ese agente extrao. El mantenimiento de esta defensa activa implica mltiples tipos celulares y distintos componentes solubles, que deben actuar de forma coordinada para que la
respuesta producida sea efectiva y adecuada. Ha de planearse la atraccin de las clulas
necesarias al lugar de la alteracin y regular la duracin y amplitud de la respuesta inmunolgica, encauzndola de manera que no sea una respuesta escasa y, por tanto, deficiente, ni
desmesurada, que podra resultar lesiva para el propio organismo como ocurre en las enfermedades alrgicas y autoinmunes.
En el control de estos procesos intervienen mltiples molculas solubles con accin inmunomoduladora, entre las que las citocinas y quimiocinas juegan un papel destacado formando junto a sus receptores, solubles y celulares, una compleja red de comunicacin intercelular.
Por tanto, para una evaluacin global y eficaz del estado funcional del sistema inmunolgico es importante conocer, por un lado, qu clulas estn respondiendo y, por otro, qu
seales estn transmitiendo a otras clulas para que la respuesta sea coordinada y efectiva.
El patrn de produccin de citocinas se ha utilizado frecuentemente para evaluar el estado funcional del sistema inmunolgico. Para su determinacin se ha analizado desde la
expresin del ARN mensajero hasta las tasas sricas. Para conocer qu clulas producen estas
citocinas, en los ltimos aos, se han desarrollado tcnicas de citometra de flujo que detectan la expresin de las citocinas en el citoplasma, o en una matriz artificial creada sobre la
membrana de clulas individuales; alternativamente, se pueden emplear tcnicas de ELISPOT.
Sin embargo todas estas tcnicas, al inhibir o limitar la secrecin de las citocinas, alteran la
red de comunicacin celular, distorsionando la imagen que captamos del funcionamiento del
sistema inmunolgico.
Con el fin de poder disponer en un momento concreto de informacin sobre la respuesta
inmunolgica, frente a estmulos especficos o inespecficos y con la mnima distorsin,
hemos desarrollado un nuevo mtodo para evaluarla. ste proporciona informacin sobre las
clulas respondedoras y, simultneamente, permite determinar cuantitativamente la respuesta de stas en relacin con las tasas secretadas de mltiples citocinas u otras protenas
solubles.
Para poder identificar especficamente aquellas clulas que activamente secretan citocinas,
nos decidimos por evaluar la expresin de TNF- como el marcador especfico universal, ya
que es una de las citocinas ms ubicuas (expresada en mltiples tipos celulares incluidas las
clulas del sistema inmunolgico productoras de citocinas) y de liberacin ms temprana tras
la activacin celular. Esta citocina se expresa como protena transmembrana, siendo necesaria para su liberacin la accin proteoltica de una metaloproteasa de membrana, TACE
(TNF- converting enzyme). Para la deteccin de las clulas productoras de TNF- indujimos
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una inhibicin especfica de la accin de este enzima, lo que ocasiona la acumulacin progresiva de TNF- en la membrana plasmtica. El inhibidor sinttico utilizado no afecta a la
liberacin del resto de citocinas y la dosis empleada an permite que la secrecin vare entre
un 5% y un 10% del total de TNF- producido por las clulas estimuladas. Este hecho, unido
a que los anlisis pueden realizarse en muestras de sangre total conservando los componentes autlogos celulares y sricos, permite mantener la red natural de interacciones entre
clulas y citocinas, a la vez que dota a este mtodo de gran sencillez y rapidez.
Para identificar las clulas que expresan TNF- se utiliza un anticuerpo monoclonal especfico frente al mismo, conjugado con un fluorocromo muy sensible (ficoeritrina), que ser
detectado mediante citometra de flujo. Esta tcnica, junto con la utilizacin de anticuerpos
monoclonales especficos que permiten la identificacin de distintas subpoblaciones celulares, facilita la creacin de espacios multidimensionales dnde distintos tipos celulares ocupen diferentes posiciones, lo que permite identificar y caracterizar individualmente los subtipos celulares exactos que secretan activamente citocinas. Al mismo tiempo, y en la misma
medicin, podemos cuantificar las citocinas secretadas mediante un novedoso sistema de
inmunoensayo en suspensin. Esta tcnica de inmunoensayo utiliza como sustrato de captura especfico para cada citocina una poblacin diferente de microesferas fluorescentes,
diferenciables entre s por su emisin de luz roja. Las caractersticas de emisin de luz de estas
microesferas, en otra longitud de onda (FL2), varan segn la cantidad de citocina capturada
e identificada por un conjunto de segundos anticuerpos tcnica de sndwich que incluye reactivos especficos de cada citocina conjugados con un mismo fluorocromo-ficoeritrina. Mediante comparacin con curvas de calibrado basadas en la medicin de cantidades
conocidas de cada citocina en forma soluble podemos determinar su concentracin exacta.
Al ser los distintos tipos de microesferas, especficas para cada citocina, perfectamente distinguibles entre s (en funcin de la fluorescencia roja intrnseca de cada una) y de las clulas (por su tamao) podemos realizar el anlisis simultneo de las subpoblaciones celulares
que producen citocinas, y la cuantificacin de mltiples citocinas secretadas al medio en una
nica medicin.
La especificidad y sensibilidad de este sistema de anlisis se ha probado en muestras de
volumen pequeo tan slo 10-25 l de sangre perifrica, activadas in vitro con diferentes
estmulos, observndose patrones diferentes de activacin celular y secrecin de citocinas
segn el estmulo utilizado. El lipopolisacrido, una endotoxina bacteriana, provoca la secrecin de citocinas de patrn inflamatorio por parte de los monocitos, con concentraciones
superiores a 3.000 pg/ml, tanto de interleucina (IL)1 como para la IL8 e IL6. Por otra parte,
un estmulo genrico de linfocitos T (PMA e ionomicina), nos permiti cuantificar el nmero
absoluto de linfocitos T activados y detectar un patrn de secrecin predominante de tipo
Th1: Interfern- (IFN-) e IL2. Ambos estmulos, muy genricos, provocaban activaciones
superiores a un 50% de todas las clulas, ya fueran monocitos o linfocitos T, asociados a la
secrecin de grandes cantidades de citocinas. Al emplear estmulos ms especficos de una
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subpoblacin celular concreta, como lisados de citomegalovirus, comprobamos que en individuos seropositivos (que han estado en contacto con el virus en algn momento de su vida)
en los que existen linfocitos T circulantes de memoria especficos de citomegalovirus, en muy
baja frecuencia (<1%), esta nueva tcnica permita detectar el pequeo porcentaje de clulas activadas a la vez que cuantificar la produccin de IFN- e IL6. La respuesta observada en
individuos con serologa para CMV positiva fue constantemente superior a la encontrada en
individuos seronegativos, en los que el sistema inmunolgico no ha contactado o respondido nunca frente a tal virus. Estos hallazgos corroboran la alta sensibilidad y especificidad del
mtodo.
Las aplicaciones que este nuevo mtodo de evaluacin funcional de la respuesta inmunolgica pueda tener en un futuro es muy amplia. Comprende entre otras la posibilidad de evaluar la respuesta inmunolgica especfica frente a agentes infecciosos, clulas tumorales y
alrgenos concretos. Actualmente, se est investigando su posible utilidad en la monitorizacin de la respuesta inmunolgica frente a vacunas tanto en modelos animales (ratones)
como en estudios piloto de vacunacin antitumoral.

Bibliografa recomendada
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