PRCTICA N2

TINCIN GRAM
I.

OBJETIVO

Efectuar correctamente la preparacin de un frotis bacteriano e identificar bacterias mediante la

tincin Gram, haciendo uso conjunto del microscopio.
II.

FUNDAMENTO TERICO

La tincin de Gram es un mtodo de identificacin de bacterias mediante una tincin especfica.

Esta tcnica fue desarrollada en 1884 por el mdico Dans Hans Christian Joachim Gram, y
actualmente es un mtodo utilizado universalmente. Sobre la base de su reaccin a la tincin de
Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, gram positivas y gram negativas.
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar
su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica.
Un microorganismo grampositivo debe presentar una pared celular sana. El mismo
microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gramnegativo. Esto indica
la importancia de la pared para la retencin o escape del colorante.
Aspectos cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo
tiene poca afinidad con las clulas.
2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas
grampositivas. El proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso
del tiempo para obtener resultados satisfactorios.
3) Cultivos ms viejos de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal.
El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una sustancia insoluble en
agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos
cuya pared celular solamente est formada por la membrana celular y en su interior una capa de
peptidoglucano, con este tipo de microorganismos se crea una barrera que el complejo cristal
violeta-yodo formado en su interior no puede atravesar y por tanto es capaz de retenerlo ante la
influencia del solvente orgnico. A los microorganismos que presentan este tipo de pared celular se
le conoce como Gram Positivos.

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Figura N 1. Pared celular de microorganismos Gram positivos

Pero existe otro tipo de clulas, cuya pared celular est integrada de manera similar a la antes
descrita, con la diferencia que posee una capa externa de lipopolisacarido. La respuesta de este tipo
de pared celular ante la influencia del solvente orgnico es el rompimiento de la misma por poseer
afinidad con el solvente, es decir, la membrana de lipopolisacarido es soluble en solventes
orgnicos; con el rompimiento se libera el complejo cristal violeta-yodo que se haba formado. A
los microorganismos con este tipo de pared celular se les conoce como Gram negativos.

Figura N 2. Pared celular de microorganismos Gram negativos

Luego se agrega la sustancia safranina con el fin de identificar aquellos microorganismos Gram
negativos, es decir, los que liberaron el complejo. Al agregar esta sustancia, los Gram Negativos se
teirn de color rojo y las Gram positivas de quedarn con la tonalidad violcea.

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Imagen N 3. Esquema de Tincin Gram

Al finalizar esta prueba experimental lo que se busca es identificar al microscopio dos tipos de
microorganismo: los Gram positivos (los que dan la prueba positiva) y los Gram negativos (que dan
la prueba negativa) y todo depende et tipo de pared celular que los microorganismos tengan, ya sea
para retener o no los complejos colorantes al que se ven sometidos.
Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo de laboratorio junto con el microscopio se
vuelven herramientas claves para la identificacin de referencias morfolgicas de la clulas
bacterianas (cocos, bacilos) se basan justamente en la tincin de GRAM.
Ejemplos de bacterias que pueden ser usadas en Ia tincin de Gram:
Cocos Gram-positivos

Racimos: forma tpica de Staphilococcus sp, como S. Aureus

Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp. Como S. Pneumoniae.
Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp.

Bacilos Gram-positivos

Gruesos: forma tpica de Clostridium sp, como C. Perfringens, C. Septicum.

Finos: forma tpica de Listeria sp.
Ramificados: forma tpica de Actinomycetes y Nocardia como Aisraelli.
Diplococos: forma usual de Neisseria como N Meningitidis.

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Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp. Que puede ser gram-positivo, gramnegativo
o variable.

Bacilos Gram-negativo

Bacilos finos: forma usual de enterobacterias como E. Coli.

Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp. como H. lnfluenzae.
Curvados: forma usual de Vibrio sp. como V. Cholerae, Campylobacter sp.
Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp.

III.

MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales
Mechero Bunsen
Pizeta plstica
Asa bacteriolgica
Lmina porta objeto
Microscopio ptico
Cubeta plstica

IV.

Reactivos:
Azul de metileno 1% en agua destilada
Cristal violeta
Safranina
Mordiente de yodo o lugol
Etanol
Cultivo bacteriano

PROCEDIMIENTO

A. TCNICA DE PREPARACIN DE FROTIS BACTERIANO

1.
2.

3.
4.

Recoger por medio de un asa de platino en anillo, una

porcin del cultivo lquido proporcionado.
Extenderlo sobre un porta objetos de vidrio, previamente
limpiado con algodn impregnado con alcohol 70, formar
una pelcula
Dejar secar a temperatura ambiente
Flamear al calor con un mechero

B. COLORACIN SIMPLE CON AZUL DE METILENO

1.
2.
3.
4.
5.

Aplicar azul de metileno al frotis, en forma que permanezca una capa de coloracin sobre el
porta objetos horizontal, puesto con el frotis hacia arriba.
Dejar reposar, durante un minuto.
Lavar con agua destilada el porta objetos.
Quitar el exceso de agua y dejar secar
Examinar al microscopio

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C.

COLORACIN DE GRAM
1. Aplicar al porta objetos con el frotis una
solucin de cristal violeta y mantener por
un minuto.

2. Enjuagar con agua.

3. Aplicar yodo durante un minuto.

Enjuagar con agua y decolorar

rpidamente con alcohol-acetona.
Inmediatamente despus enjuagar con agua.

5. Teir con colorante (safranina durante

un minuto)

6. Enjuagar, quitar el exceso de agua

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4.

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7. Secar para quitar la humedad.

8. Observar al microscopio.

9. CUESTIONARIO
a. La tincin Gram es clasificada como una tincin diferencial, Para qu sirven este tipo de
tinciones?
b. En qu consiste una tincin simple?
c. Escriba algunos ejemplos de bacterias Gram positivos y Gram negativos y dnde pueden
encontrarse.
d. Existe alguna relacin entre el tipo de morfologa y la tincin Gram?
e. Mencione al menos dos tinciones diferenciales aparte de la tincin de Gram y diga para qu
se utilizan.

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