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las dos condiciones, de manera similar a como se hace con los microarreglos, identificando los
spots que varan para luego determinar su identidad con espectrometra de masa de distintas
formas, segn si conocemos o no el Genoma de la muestra estudiada.
Si conozco el Genoma
Esprectrometra de Masa (MS): Se basa en el registro de las molculas fragmentadas, el cual se
obtiene gracias a que la muestra es bombardeada con distintas fuentes de Ionizacin, las que
calientan un haz de material del compuesto a analizar hasta vaporizarlo e ionizar los diferentes
tomos, produciendo entonces el haz un patrn especfico en el detector que otorga los datos
para analizar el compuesto. Como primer paso se fragmenta la protena en pptidos ms
pequeos, esto mediante enzimas proteolticas como tripsina o Quimiotripsina. Luego se
determina la masa de cada pptido para identificar a qu corresponde cada uno.
Para determinar la masa de los pptidos experimentalmente, se utiliza el mtodo MALDI-TOF, que
permite determinar la masa molecular de los distintos pptidos Ionizados segn el tiempo de
vuelo dentro una cmara. Si se aumenta el espacio que recorre la muestra, ms molculas pueden
volar, y as registrar ms pptidos, lo que se traduce en identificar ms protenas.
Los programas que trabajan con MS pueden hacer un peptidoma in silico a partir del proteoma, el
cual se obtiene al traducir todos los posibles Marcos Abiertos de Lectura (ORFs) que estn
presentes en el Genoma. Lo que se hace entonces es comparar las masas obtenidas para los
pptidos con MALDI-TOF, con las masas determinadas informticamente para cada posible
pptido, y basndonos en que no hay dos pptidos distintos con la misma masa, se puede asignar
cada una de las masas obtenidas a un pptido determinado en el computador, y de esta forma
asignarlo a una protena en particular.
Qu pasa si hay 2 proteinas
con iguales Aminocidos pero
en distinto orden, de forma que
tengan la misma masa?
Tendra que tener los mismos
Aas, la misma masa, el mismo
punto Isoelctrico para que
hayan caido en el mismo spot.
De todas formas se tiene esto
en cuenta mediante un false
discory rate que da cuenta de
la razn de falsos positivos. Hay
clculos para evitar esto, pero
igual puede pasar aunque sea
extremadamente raro.
Qu pasa si se modifican los
Todo lo anterior casi ni se usa ( es de los 70s), debido a que tienen el gran problema de la
reproducibilidad, principalmente por culpa del Gel. Adems de que no permite hacer un anlisis
muy holstico ya que permite analizar 3 o 4 protenas, cuando para un estudio a gran escala se
necesitan cientos.
DIGE
Est basado en un
microarreglo. El proteoma de
una condicin se marca con
un fluorforo, y el de la otra
condicin se marca con otro.
Entonces se mezclan para
correrlos juntos en un gel.
Luego las muestras son
exitadas segn lo requerido
para cada fluorforo y luego
se analiza lo que nos interese.
El problema con esta tcnica
es que los fluorforos para
protenas no son ni tan
estables ni tan reproducibles
como con el DNA.
ejemplo biotina. La biotina se une a las cadenas pesadas o livianas que constituyen el linker entre
la proteina y la biotina. Luego se separan las protenas unidas a la columna y se degradan con
peptidasas para identificarlas por MS.
La diferencia entre ICAT e ICPL es que el primero debe tener cisteinas para unir el linker
que corresponde a la cadena liviana o pesada, en cambio el ICPL no necesita de cisteinas, sino que
reconoce todo.
La gracia es que se pueden identificar los pptidos que corresponden a cada muestra por
esta diferencia de masa. Debido a que la resolucin es muy alta, podemos saber si las muestras
estan en la misma relacin o no, y de esta forma podemos hacer protemica cuantitativa que
permite hacer una gran variedad de anlisis, como saber cuales protenas cambiaron su expresin.
Como ejemplo de esto ltimo tenemos trabajos en donde se ha logrado obtener una gran
variedad de proteinas que cambiaron su expresin en relacin al Wild Type. Con todos los datos
obtenidos uno puede analizar que estn alteradas a nivel metablico, adems de los posibles
factores transcripcionales involucrados. Es as como se buscaron protenas con comportamientos
contrarios (que aumenta en una condicion y disminuye en otra). As en el caso particular del
profesor, se vi que en clulas ppx el ciclo de Krebs est disminuido, al contrarios de las
mutantes ppk. Adems se osberv que algunas de las proteinas involucradas eran las que eran
reguladas por un determinado factor transcripcional (ArcA). Luego se vi que pasaba con las
proteinas reguladas por este factor, se cuantific ArcA y se dio cuenta de que la regulacin del
ciclo de Krebs y la respiracin eran dependientes de ArcA.
Como evidencia de eficacia de estas tcnicas se tiene el uso de una muestra de 2x109
clulas de E.coli. Se agregaron 100fmol (30 copias/clula) de una protena y se identific por
espectrometra, encontrandose la protena que se haba agregado. Esto da cuenta de la
sensibilidad que poseen los anlisis protemicos.
Protein Chip
Se usan Chips que tienen proteinas pegadas. Esto se marca con una tinsin, de manera de
poder identificar cuando se unen las protenas a una molcula particular (ej Calmodulina). Es as
como podemos determinar que proteinas unen a la molcula particular y as caractrizar el dominio
de unin a esta. Adems permite determinar protenas que nose conocan que tenian la capacidad
de unir a la molcula que se est analizando.
Si bien se debe demostrar que estas protenas se unen, los resultados son bastante
exactos ya que el proceso es muy minucioso (por ejemplo en los lavados).
Sistematics proteomics (tipo sistema doble hbrido)
Bajo el fundamento de que para que dos protenas interaccionen, deben acercarse, se
analiza la interaccin entre dos protenas al unir una a un dominio de activacin de un factor
transcripcional, y la otra al dominio de union al DNA del factor transcripcional, de modo que
cuando las protenas a analizar interactan, se acercan los dominios del factor transcripcional, y se
transcribe el gen correspondiente que normalmente es un reportero para dar cuenta de la
expresin.
Este sistema ha sido usado ampliamente en levaduras para determinar que protenas
interactuan. Y es bajo este concepto del doble hbrido que se realiz un trabajo con una matriz
inmensa de 6000 v/s 192 protenas de levadura. Entonces se clonaron las 192 protenas fusionadas
a dominios de union en levaduras A, y se tenan adems las 6000 protenas unidas a dominios de
activacin en levdura y se utiliz como reportero un gen de resistencia. As se hizo un catastro
de las interacciones de estas protenas. Sin embargo esto tiene el problema de que no todas las
protenas interaccionan de a pares, por lo tanto si queremos saber cuales son los complejos que
interactan debemos utilizar otro medio. Entonces para esto uno usa un anticuerpo para una de
las protenas. Se inmunoprecipita de modo de obtener el complejo completo y luego se corre en
un gel y se identifica por espectrometra de masa.
Con este mtodo se identific el complejo de poly-A polimeraza, primero utilizando un
anticuerpo de una de las protenas, y luego otros anticuerpos para el resto de las protenas
esperando obtener el mismo complejo. As se lograron identificar protenas que antes se
desconoca que formaban parte del complejo.
Conclusiones
Con todas estas tcnicas que hemos visto, tanto protemica, transcriptmica y genmica,
es posible detectar y otorgar una funcin a las protenas desconocidas, adems de con quienes
interactan. Como ejemplo tenemos la inmunoprecipitacin de mas de 200 complejos en S.
cerevisiae, de modo de obtener mapas de todos los complejos proteicos y las protenas que los
componen. Adems hay otro estudio en el que se tomaron 150 proteinas de esta levadura a las
que se les desconoca su funcin y se inmunoprecipitaron para determinar si formaban complejos.
Se hicieron doble-hibridos para determinar cuales protenas interactan con cuales. Tambin se
hicieron constructos con protenas fluorescentes para determinar la localizacin subcelular.
Finalmente se hicieron anlisis informticos para determinar los dominios y todo eso. Es as como
se logr otorgar una funsin del 70% de estas protenas con funsin desconocida.
Con todo estos conocimientos, debemos entender que, una vez que tenemos el genoma
secuanciado, podemos hacer uso de el para conocer todas las funciones de las roteinas de una
clula y con quines interactuan para realizar dicha funcin.