Dosage des Phnols et des Flavonodes

Totaux

I. Dosage des phnols Totaux

1-Principe :
Le dosage des phnols totaux se fait laide du Ractif de Folin-Ciocalteu (RFC), qui en
prsence de polyphnols et en milieu alcalin se rduit en oxyde de tungstne et de molybdne
donnant une couleur bleue.
Les composs phnoliques ragissent en en milieu basique (pH ~ 10) avec le RFC. En
effet, dans ces conditions, la dissociation d'un proton phnolique mne un anion phnolate,
qui est capable de rduire le RFC par des ractions rversibles impliquant le transfert dun ou de
deux lectrons. Cette raction conduit la formation despces chimiques de couleur bleue,
probablement le complexe (PMoW11O40)4-.
Le RFC pouvant tre rduit par beaucoup de composs non phnoliques (par exemple la
vitamine C, le Cu (I), etc.)], ce ractif nest donc pas spcifique aux composs phnoliques(1).
Le compos phnolique standard utilis dans cette mthode est l'acide gallique. Les
teneurs des phnols totaux sont calculs laide de lquation de la courbe dtalonnage de
lacide gallique.
2-Ractifs et Matriels :
Une solution de lchantillon de concentration 1 mg/ml prpare dans un mlange
mthanol/eau
Mthanol
leau ultra pure
Le ractif Folin-Ciocalteu (dilu 1/10 dans de leau ultra pure)
Le carbonate de sodium Na2CO3 (1M)
Lacide gallique
Micropipettes
Tubes
Bchers
Portoirs

3- Mthode exprimentale :
le ractif Folin-Ciocalteu (dilu 1/10 dans de leau ultra pure)

FC

FC + Poly

Jaune

Bleue

Exple : Vt =100ml et FC=1/10

Donc on met 10 ml de ractif de Folin dans un fiole de 100 ml puis on complte
jusquau trait de jauge.

la solution de carbonate de sodium Na2CO3 (1M) 4ml par tube, comment

calcule la masse(m) ?
On a M = 105,99g/mol et m = C*V*M ; avec M : masse molaire
Exemple: on a VT=50ml, m = 1M*5010-3ml*105,99g/mol
m = 5,30g dans 50ml deau ultra pure

Req : une masse de lextrait de 1 mg est dissoute dans un mlange

mthanol/eau (50:50) pour donner une concentration massique de 1 mg/ml: on doit la

dissoudre tout dabord dans le mthanol ensuite dans leau.
Daprs la mthode dcrite par Pourmorad et al. (2), une prise dessai de 0,5 ml dune
solution mre de concentration 1 mg/ml prpare dans un mlange mthanol/eau (50:50) est
mlange avec 5 ml de ractif Folin-Ciocalteu (dilu 1/10 dans de leau ultra pure) et 4 ml de
carbonate de sodium Na2CO3 (1M). Le mlange est agit puis laiss pendant 15 minutes
lobscurit et temprature ambiante. A la fin de la raction, la solution obtenue prsente une
coloration bleue fonce dont on mesure labsorbance la longueur donde 765 nm.
La teneur en phnols totaux est exprime par rapport un compos rfrence qui est
lacide gallique, dont la structure est reprsente sur la figure suivante.
OH
O
OH
HO
OH

Figure1. Structure chimique de lacide Gallique

Pour cela, une gamme talon de cet acide a t ralise avec 6 niveaux de concentrations
(0 ; 50 ; 100 ; 150 ; 200 ; 250 et 300 g/ml), puis la courbe dtalonnage donnant la variation de
labsorbance 765 nm en fonction de la concentration a t trace.
La lecture de labsorbance a t ralise laide dun spectrophotomtre UV/vis de marque
JASCO srie V350. Les teneurs en phnols totaux des diffrents extraits ont t dtermines
directement partir de la courbe dtalonnage (Figure 2) qui prsente un coefficient de
rgression proche de 1 (r = 0.9957).
[AG]g/ml
Vi l
VMeoh l

0
0
500

50
25
475

FC
Na2CO3

100
*
*

150
*
*

200
*
*

250
*
*

300
*
**

5ml
4ml

Exemple de calcul:
On a : Ci*Vi=Cf*Vf
Vi= Cf*Vf/Ci
Ci = 1000 g/ml
Cf = 50 g/ml
Vf = 500 l
Donc Vi= 25l
Mme dmarche pour lextrait MeOH avec les concentrations [0, 20, 40, 60, 80, 100,
150, 200, 250 et 300 g/ml].
Les valeurs sont exprimes en mg dquivalent acide gallique par gramme de matire
vgtale sche (mg EAG/g MS) ou en mg dquivalent acide gallique par gramme dextrait (mg
EAG/g extrait) (3).
Exemple : Lextrait mthanolique de la marjolaine prsente une teneur des phnols totaux
estime 215,92 mgGAE/g ou 57,86 mgGAE/gMS.

absorbance
765 nm
1,4
1,2
1,0

y = 0,0052x + 0,0258
R2 = 0,9957

0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0

50

100

150

200

250

300

concentration Ac.gallique(g/ml)

Figure 2. Courbe dtalonnage de lacide gallique

II. Dosage des flavonodes totaux

1-Principe :
Le dosage des flavonodes totaux est bas sur un test colorimtrique utilisant le
trichlorure daluminium AlCl3. En effet, il a t dmontr que ce ractif forme des complexes
acides stables soit avec le carbonyle (C=O) en position C-4, soit avec le groupe hydroxyle en C3 ou C-5 des flavones et des flavonols.
Par ailleurs, AlCl3 peut galement former des complexes acides labiles avec les
groupements orthodihydroxyles ventuellement prsents sur le noyau A et/ou B des
flavonodes.
Chang et al (4) ont montr que les complexes forms par lAlCl3 avec 15 composs
flavonoliques rfrences prsentent une absorption maximale des longueurs donde variant
entre 415 et 440 nm. La teneur des flavonodes totaux peut tre calcule partir de lquation
de la courbe dtalonnage dun flavonode pris comme rfrence.
Nous avons choisi de raliser le dosage laide dun compos standard, savoir la
querctine. Ce dernier appartient la classe des flavonols, son structure chimique est prsente
dans la Figure 3.

Figure3. Structure chimique de la Querctine

2-Ractifs et Matriels :

 Une solution de lchantillon de concentration 1 mg/ml (prpare dans

le mthanol)
Mthanol
leau ultra pure
le trichlorure daluminium (AlCl3, 6H2O)
Lactate de sodium (1M)
Querctine
Micropipettes
Tubes
Bchers
3-Mthode exprimentale :

(AlCl3, 6H2O) (10%)

1mg dans 10ml deau ultra pure

lactate de sodium (1M) comment calculer la masse(m) ?

Exple : pour V= 20ml on a m = M*V*C

= 82,03 g/mol *20 10-3 ml* 1M
= 1.64g dans 20ml
Les flavonodes totaux ont t dtermins suivant la mthode dcrite par Pourmorad et al
(2) avec quelques modifications. Ainsi 0,5 ml dune solution de concentration 1 mg/ml de
lextrait on ajoute 1,5 ml de mthanol, 0,1 ml d (AlCl3, 6H2O) 10%, 0,1 ml dactate de
sodium (1M) et 2,8 ml deau ultra pure. Le mlange est agit vigoureusement puis laiss
pendant 30 minutes lobscurit. La lecture de labsorbance a t ralise 430 nm. La courbe
dtalonnage de la querctine a t ralise dans les mmes conditions avec 6 niveaux de
concentration (0, 20, 40, 60, 80,100 et 120g/ml).
La courbe dtalonnage (figure 4) prsente un coefficient de rgression proche de 1 (r =
0.9967).
Ce tableau prsente les tapes de prparation de la gamme talon de la querctine.
(Querctine g/ml)
Vi de la sol mre
(l)
VMeOH (l)
mthanol
AlCl3
Actate de sodium

0
0

20
10

40
20

80
40

100
50

120
60

500

490

480

460
1 .5 ml
0.1ml
0.1ml

450

440

Eau ultra pure

2.8ml

Les teneurs en flavonodes totaux sont exprimes en mg dquivalent querctine par

gramme de matire vgtale sche (mg EQ/g MS) ou en mg dquivalent querctine par
gramme dextrait (mg EQ/g extrait)
Exemple : La teneur des flavonodes totaux est exprime en quivalent querctine, et a t
estime 23,70 mg EQ /g ou 6,35 mg EQ/g MS dans la Marjolaine.
absorbance
430nm
1,2
1,0
0,8
y = 0,010x
R = 0,996

0,6
0,4
0,2
0,0
0

20

40

60

80
100
120
concentration de la querctine
(g/ml)

Figure4. Courbe dtalonnage de la Querctine

Mesure de lactivit antioxydante

I-Activit antiradicalaire contre le DPPH
1-Principe
Lactivit antiradicalaire est mesure par la dgradation du DPPH, ou le 2,2diphnyle-1-picrylhydrazyl, qui est un radical synthtique qui peut tre solubilis et stabilis
dans le mthanol, donnant une coloration violette en solution et absorbant ainsi dans le domaine
visible la longueur donde 515 nm (5).

Figure5. Structure chimique de la DPPH

En contact dantioxydants, la couche lectronique de ce radical est

sature, (il sagit dune rduction, qui se traduit par un transfert dun atome dhydrogne
sur latome dazote du radical DPPH) ce qui a pour rsultat sa dcoloration (la
solution qui vire vers le jaune).
Cette proprit permet de suivre la capacit de lextrait de la plante
piger ce radical.
Exprimentalement, la raction consiste mettre la solution de DPPH en prsence de
diffrentes concentrations dun extrait susceptible davoir un effet antiradicalaire et de mesurer
la capacit de ce dernier rduire le radical DPPH en DPPH-H selon la raction suivante :
DPPH + AH
Avec (AH) un compos antioxydant (5).

DPPH-H +A

Limportance de la dcoloration, qui provoque la diminution de labsorbance 515 nm,

est proportionnelle au pouvoir antiradicalaire de lextrait test.
2-Ractifs et Matriels :
DPPH (0,1 mM)
Extrait mthanolique du Marjolaine
TROLOX
BHT
Mthanol
Tubes
Micropipettes
Portoirs
3-Mthode exprimentale :
Comment calculer la masse de DPPH ?
Le DPPH est une poudre
C= 10-4M
M= 394.32g/mol
La masse de DPPH : m = nombre de mole*masse molaire= n*M= C*V*M
V : volume total de DPPH qui sera utilis
Req : la solution de DPPH est prpare fraichement dans le MeOH dans le mme jour
de la ralisation du test.
Comment calculer la concentration de TROLOX (800 mol/l)?
Masse de trolox= nombre de mole* masse molaire
800 mol est quivalent 800.106 mol
m trolox= 800.106 * 250.29=0.200 g dans un litre pour avoir concentration molaire 800
mol/l
Exemple : pour une concentration [Trolox]= 800mol/l on prend 1mg dans 5ml MeOH.
Lactivit antiradicalaire de DPPH a t dtermine en se basant sur les essais dcrits
par W. Binsan et al. (2008) (6), avec quelques modifications. Ainsi 1 ml de lextrait tester,
on ajoute 2 ml de la solution mthanolique de DPPH de concentration 0,1 mM. Aprs agitation
vigoureuse, le mlange est incub pendant 1 heure lobscurit et temprature ambiante, puis
labsorbance est mesur 515 nm par un spectrophotomtre UV vis (JASCO-V530). Une

solution contenant 1 ml de mthanol et 2 ml de DPPH considre comme blanc analytique est

prpare en parallle.
Lestimation de lactivit antiradicalaire est exprime par la valeur du pourcentage
dinhibition (%I) calcul laide de la formule suivante (7):
%I = [(Abs0 Abs1)/Abs0)] x100
Avec Abs0 : absorbance du blanc analytique.
Abs1 : absorbance de la solution en prsence dextrait.
La courbe donnant la variation du (%I) en fonction des diffrentes concentrations de
lextrait (0, 10, 20, 40, 60,80 et 100 g/ml), permet de dterminer lactivit antiradicalaire ou
EC50 (Efficient Concentration 50%), dfini comme tant la quantit dextrait ncessaire pour
diminuer de moiti la concentration initiale de DPPH (7).
Les rsultats peuvent galement tre exprims par rapport aux molcules rfrences, le
Trolox et la BHT, avec les gammes de concentrations respectives de (0, 2.5, 5, 10, 15, 20 et 25
g/ml) et (0, 15, 25, 40, 60, 80 et 100 g/ml).
Ce tableau prsente les diffrentes dilutions pour lextrait MeOH et on adopte la mme
dmarche pour le Trolox et le BHT.
(Ext
MeOH)g/ml
Vi (l)
VMeoh (l)
VDPPH (ml)

10

20

0
1000

10
990

20
980

40

60

80

100

40
60
960
940
2(pour chaque tube)

80
920

100
900

absorbance
(515nm)
0,8
0,7
0,6

y = -0,029x + 0,749
R = 0,988

0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0

10

15

20

25 Concentration(ug/ml)
30

Figure6. Variation de la densit optique de DPPH en fonction des concentrations

massiques de Trolox

absorbance(51
5nm)

0,8
0,7

0,6
0,5

y = -0,007x + 0,749
R = 0,988

0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0

20

40

60

80

100
120
Concentration(Umol/l)

Figure7. Variation de la densit optique de DPPH en fonction des concentrations molaires de Trolox

% d'inihibition
de DPPH
100
90
80
marjolai
ne

70
60

BHT

50
40
30
20
10
0
0

20

40

60

80

100
120
concentrations des extraits (g/ml)

Figure 8. Pourcentage dinhibition (%) de DPPH en fonction des diffrentes

concentrations de lextrait brut de la marjolaine compare avec le BHT