02/04/2015

CLONAGEM

Professor: Gonzalo

Conceito bsico: todas as clulas contm o genoma completo.

msculo

pele

neurnio

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Identidade celular: conjunto de genes ligados/desligados.

msculo

pele

neurnio

CLONAGEM
Qualquer fragmento de DNA que contenha
um gene de interesse pode ser clonado;
Em biologia molecular clonagem tem dois
sentidos:
Se refere ao ato de produzir vrias cpias
idnticas de uma molcula de DNA
amplificao de uma sequncia de DNA em
particular.
Se refere ao isolamento de uma fita de DNA
especfica, a partir do resto do DNA da clula
este isolamento facilitado fazendo-se vrias
cpias do material de interesse.

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CLONAGEM
Pode ser vista de vrias maneiras:
A mais simplista envolve a insero de um
fragmento de DNA particular no DNA genmico
purificado de um elemento gentico que se auto
replica ( vrus ou plasmdeo);

Um fragmento de DNA, contendo um gene

humano, pode ser ligado a um cromossomo
de vrus bacteriano, e a nova molcula de
DNA
recombinante
pode ento,
ser
introduzida na clula bacteriana.

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Partindo de uma molcula de DNA
recombinante, que infecta uma clula, o
mecanismo normal de replicao do vrus
pode produzir mais de 1012 molculas de
DNA viral em menos de um dia.
Um vrus ou plasmdeo assim utilizado
conhecido como VETOR DE CLONAGEM, e o
cDNA propagado pela insero nele
chamado CLONADO.

CLONAGEM
Para isolar um gene especfico, inicia-se
construindo uma biblioteca de DNA uma
coleo abrangente de fragmentos clonados
de DNA de uma clula, de um tecido ou de
um organismo;
As bibliotecas podem ser construdas com
um vetor plasmideal e esto geralmente
presentes em uma populao de clulas
bacterianas;

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Atualmente a maioria das clonagens
realizada em vetores plasmidiais.
O vetor plasmideal mais amplamente
utilizado para clonagem de genes so
pequenas molculas circulares de DNA fita
dupla, derivadas de plasmdeos maiores ,
que ocorrem naturalmente em clulas
bacterianas;

CLONAGEM
Para ser utilizado como vetor de clonagem ,
os crculos de DNA plasmideal purificados
so primeiro clivados com uma nuclease de
restrio para criar molculas de DNA
linear.

As molculas de DNA recombinantes

contendo o inserto de DNA estranho,
so ento covalentemente ligados com a
enzima DNA ligase.

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CLONAGEM
As clulas crescem
e se dividem,
duplicando em nmero a cada 30 minutos,
os plasmdeos recombinantes tambm
replicam para produzir um enorme nmero
de cpias de DNA (estranho).

Tecnologia do DNA
recombinante e Clonagem
Conjunto de tcnicas para manipulao de cidos
nucleicos;
Clonagem de fragmentos de DNA em plasmdios de
bactrias;
Seqnciamento de DNA;
Amplificao de uma seq. Especifica de DNA pela
tcnica da reao em cadeia da polimerase (PCR);
Construo de bibliotecas genmicas e de cDNAs;
Vetores de expresso (procariotos e eucariotos);
Plantas transgnicas;
Animais transgnicos;

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Plasmdeos
Plasmdeos so molculas circulares de DNA
pequenas (de 2.000 a 200.000 pares de bases)
encontradas em muitas bactrias

Enzimas de restrio

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CLONAGEM
Vrios plasmdeos bacterianos carregam
genes para a resistncia a antibiticos, uma
propriedade que pode ser utilizada para
selecionar aquelas que foram transfectadas
com sucesso;
Se a bactria crescer na presena do
antibitico, somente as clulas contendo o
plasmdeo sobrevivem;
Forma-se assim uma colnia de bactrias,
transfecatas com um plasmdeo.

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CLONAGEM

CLONAGEM

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CLONAGEM
Por muitos anos os plasmdeos foram
utilizados para transfectar fragmentos de
DNA de mil a trinta mil pares de
nucleotdeos;
Os fragmentos maiores so mais difceis de
clonar;
Devido
a
essa
dificuldade
alguns
pesquisadores
comearam
a
utilizar
cromossomos artificiis de leveduras (
yeast artificial chromossomes YACs ), que
conseguem lidar com pedaos grandes de
DNA;

CLONAGEM
Hoje, so utilizados vetores plasmideais ,
baseados no plasmdeo F de E. coli, que
ocorre naturalmente;
So utilizados para fragmentos de DNA de
300 mil a 1 milho de pares de
nucleotdeos;
O plasmdeo F e o cromossomo bacteriano
artificial ( bacterial artificial chromossome
BAC ) est presente em apenas uma ou
duas cpias por clula de E. coli.

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CLONAGEM
O fato dos BACs serem mantidos em to
baixos nveis no interior das clulas
contribui para manter estveis grandes
sequncias de DNA clonadas;
Com apenas poucos BACs menor a
chance de alguns fragmentos recombinates
se misturarem pela recombinao com
sequncias presentes em outras cpias do
plasmdeo;

CLONAGEM
Por estas habilidades de aceitar
grandes insertos e por serem
facilmente manipulados, os BACs so
agora o vetor preferido para construir
bibliotecas de DNA de organismos
complexos
incluindo
aqueles
representando o genoma humano e
o de camundongo.

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ALGUMAS APLICAES DA
CLONAGEM

O Potencial da Clonagem Teraputica

Clulas-Tronco

Tecidos/Clulas para Terapia

Medula ssea

Neurnios

Clulas do
Msculo Cardaco

Clulas do
Pncreas

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Clonagem teraputica
vulo enucleado
ncleo
embrio
4 clulas

clula adulta

blastocisto

clulas ES
diferenciao
em novo tipo celular
transplante

neutrfilos
Precursor
mielide

lifcitos T

Precursor
linfide
clulas
lifcitosBB

Clula tronco
hematopoitica

Clula tronco
pluripotente

Precursor
eritride

eritrcitos

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CLULAS TRONCO ADULTAS

clulas tronco
mesenquimais
(medula ssea)

cartilagem

adiposas
osso

mscular

hematop.
astrcitos

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