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LES PROTEINES

SEQUENAGE DES PROTEINES

Dtermination de la structure d'un peptide


La dtermination de la structure primaire d'un
peptide est conduite en deux tapes :
1) dtermination de la composition en aminoacides
2) dtermination de l'ordre des enchanements des rsidus
Ces deux tapes ont comme point commun l'hydrolyse
de la liaison peptidique.

Dtermination de la composition en Acides Amins


Hydrolyse de la liaison peptidique
La liaison peptidique est trs stable, son hydrolyse
spontane est quasiment nulle.
Hydrolyse chimique complte

Hydrolyse chimique spcifique

Hydrolyse enzymatique

Dtermination de la composition en Acides Amins


Hydrolyse chimique complte
hydrolyse Acide totale
HCl 6M 100c pendant au moins 24heures: rupture des
liaisons peptidiques aboutissant un hydrolysat.
l'aminoacide acide tryptophane est entirement dtruit, et les
amides (Asn, Gln) sont hydrolyses en ammoniac et acides
correspondants (Asp, Glu).
Hydrolyse alcaline par chauffage.
Destruction de tous les acides amins sauf le TRP.
Analyse du mlange obtenu par chromatographie sur une
rsine changeuse dions ( Qualitative et Quantitative) .

dtermination de l'ordre des enchanements


des rsidus
Identification des aminoacides terminaux
N terminaux
Mthode de Sanger (FDNB)

Le NDFB forme, avec la fonction N terminale, un driv( peptide


dinitrophnyl) avec libration d'acide fluorhydrique.
L'hydrolyse de la protine libre ensuite les AcA dont lAcA N
terminal sous forme de dinitrophenyl aminoacide de couleur
jaune :
qui peut tre identifi par chromatographie ou lectrophorse, et
dos par spectrophotomtrie 360nm.
La prsence de lysine dans le peptide va perturber cette mthode
puisque la chane latrale de ce rsidu porte un groupe -NH2 qui
ragira avec le FDNB.

dtermination de l'ordre des enchanements


des rsidus
Identification des aminoacides terminaux
N terminaux
Mthode de dansylation (chlorure de dansyl )

Le chlorure de 1-dimthyl-amino-naphtalne-5-sulfonyle
(DANS) ragit avec le NH2 terminal et donne un driv
(dansyl-amino-acide) dcelable par sa fluorescence jaune.
La raction est 100 fois plus sensible: compos sulfonamide
trs fluorescent permettant une plus grande sensibilit dans
la dtection.
Utilise pour doser les acides amins par HPLC.

La prsence de lysine dans le peptide va perturber cette


mthode puisque la chane latrale de ce rsidu porte un
groupe -NH2 qui ragira avec le DNS-Cl.

dtermination de l'ordre des enchanements


des rsidus
Identification des aminoacides terminaux
N terminaux
Mthode enzymatique (Exopeptidases /Aminopeptidases)
L'enzyme n'hydrolyse que la premire liaison peptidique.
Cintique de libration : Ordre de lenchainement.

Mthode non prcise: affinit enzyme-substrat:


Ex : Leucine aminopeptidase hydrolyse les liaisons N.t de
tous les AcA sauf Proline.

dtermination de l'ordre des enchanements


des rsidus
Identification des aminoacides terminaux
C terminaux
Mthode enzymatique (Carboxy-peptidasepeptidases)
L'enzyme n'hydrolyse que la dernire liaison peptidique.

Carboxy-peptidase A ( la plus utilise): extraite du pancras :


attaque les liaisons Ct sauf celle du glycocolle et AcA basique .
Carboxy-peptidase B : extraite du pancras : attaque les liaisons
Ct des AcA basiques .

dtermination de l'ordre des enchanements


des rsidus
Identification des aminoacides terminaux
C terminaux
Mthode chimique (Hydrazinolyse)
Un traitement l'hydrazine(H2N-NH2) 100C hydrolyse toutes
les liaisons peptidiques, et libre des hydrazides de tous les AA
sauf le C terminal, qui se prsente comme un AA libre normal.
Il est alors facile isoler et identifier.
Ncessite moins dune micromole de peptide mais ne permet de
dterminer quun seul rsidu Ct .

la dgradation rcurrente d'Edman


formation d'un PTC-peptide pH 9. Par un changement de pH
(lgrement acide), il y a cyclisation et libration d'un driv
PTH-aminoacide et d'un peptide amput de son aminoacide
N-terminal.
En rptant ces cycles : action du PTC pH 9 pour donner un
PTC-peptide puis libration du PTH-aminoacide par passage
un pH acide, et du peptide (n-1) amput du ct N-terminal, on
a, chaque cycle, la libration de l'aminoacide suivant dans la
squence du peptide original. LAcA peut tre isol et identifi
par chromatographie.
Des appareils (squenceur) sont capables d'effecteur ces
cycles automatiquement. Toutefois l'analyse est
techniquement limite de squences dont le nombre
d'aminoacides est infrieur 60.

dtermination de l'ordre des enchanements


des rsidus Dgradation des peptides en fragments
Hydrolyse chimique spcifique
- le bromure de cyanogne (BrCN) hydrolyse la liaison
peptidique du ct carboxyle de la mthionine .
- le 2-nitro-5-thiocyanobenzoate (NTCB) hydrolyse la liaison
peptidique du ct amine de la cystine.

- Hydroxylamine(NH2OH): coupe entre Asn-Gly.


- N-Bromosuccinimide: hydrolyse la liaison peptidique du ct
carboxyle de la Tyrosine et Tryptophane.

dtermination de l'ordre des enchanements


des rsidus Dgradation des peptides en fragments
Hydrolyse enzymatique : endo-peptidases
L'enzyme hydrolyse des liaisons peptidiques internes entre
deux aminoacides i, (i+1).

Il peut tre spcifique du rsidu en position i ou (i+1).

L'hydrolyse d'un peptide par une endopeptidase donnera


plusieurs fragments peptidiques : si on a m coupures (m
liaisons peptidiques hydrolyses), le peptide sera dgrad en
(m+1) fragments peptidiques.

Exemples dendo-peptidases
Enzyme

Cot C-t

Particularit

Trypsine

Lys et Arg

Sauf si Pro en N-t

Chymotrypsine

Tyr, Try et Phe

Protase stapylo

Asp et Glu

Pepsine

Cot N-t

Tyr, Try et Phe

clostriparine
Thermolysine

Arg
Leu, Ile et Val

Squenage des Protines ayant Plusieurs


Chaines Polypeptidiques
Deux chaines ou plus
- Agents dnaturants : Ure ou le chlorhydrate
de guanidine .
Chaines lies par des ponts disulfures
Rduction par le B-mercapto-thanol
Oxydation par lacide performique : transforme
la Cystine et la cystine en acide Cystique.

HO-COOH

Acide performique

SO3H

Deux Acides cystique

2[ HS-CH2-CH2OH ]

B-mercapto-thanol

S-CH2-CH2OH
S-CH2-CH2OH

Deux cystine

Technique dlectrophorse diagonale


Utilise pour dterminer la position des liaisons
disulfures.
Clivage spcifique de la protines : les disulfures
restent intactes.
Electrophorse puis exposition aux vapeurs dacide
performique qui clive les disulfures et les convertis
en rsidus dacide cystique.
2me lectrophorse perpendiculaire .

Electrophorse aprs exposition aux


vapeurs de lacide performique

R-CH2-COO-

R-CH2-COO-

1re direction avant exposition lacide performique

techniques rcentes
Technique du DNA recombinant
La squence des quatre types de base du DNA (A, T, G, C)
rvle directement la squence des AcA de la protine
code par le gne ou la molcule de RNA messager
correspondante
spectromtrie de masse