Vous êtes sur la page 1sur 24

LES PROTEINES

LES PROTEINES SEQUENÇAGE DES PROTEINES

SEQUENÇAGE DES PROTEINES

Détermination de la structure d'un peptide

La détermination de la structure primaire d'un

peptide est conduite en deux étapes :

1) détermination de la composition en aminoacides

2) détermination de l'ordre des enchaînements des résidus

Ces deux étapes ont comme point commun l'hydrolyse de la liaison peptidique.

Détermination de la composition en Acides Aminés

Hydrolyse de la liaison peptidique

La liaison peptidique est très stable, son hydrolyse spontanée est quasiment nulle.

Hydrolyse chimique complèteest très stable, son hydrolyse spontanée est quasiment nulle . Hydrolyse chimique spécifique Hydrolyse enzymatique

spontanée est quasiment nulle . Hydrolyse chimique complète Hydrolyse chimique spécifique Hydrolyse enzymatique

Hydrolyse chimique spécifique

Hydrolyse enzymatiquetrès stable, son hydrolyse spontanée est quasiment nulle . Hydrolyse chimique complète Hydrolyse chimique spécifique

Détermination de la composition en Acides Aminés Hydrolyse chimique complète

hydrolyse Acide totale

HCl 6M à 100°c pendant au moins 24heures: rupture des liaisons peptidiques aboutissant à un hydrolysat.

l'aminoacide acide tryptophane est entièrement détruit, et les amides (Asn, Gln) sont hydrolysées en ammoniac et acides correspondants (Asp, Glu).

Hydrolyse alcaline par chauffage.

Destruction de tous les acides aminés sauf le TRP.

Analyse du mélange obtenu par chromatographie sur une résine échangeuse d’ions ( Qualitative et Quantitative) .

détermination de l'ordre des enchaînements

des résidus

Identification des aminoacides terminaux N terminaux

Méthode de Sanger (FDNB)

des enchaînements des résidus Identification des aminoacides terminaux N terminaux Méthode de Sanger (FDNB)

Le NDFB forme, avec la fonction N terminale, un dérivé( peptide dinitrophénylé) avec libération d'acide fluorhydrique. L'hydrolyse de la protéine libère ensuite les AcA dont l’AcA N terminal sous forme de α dinitrophenyl aminoacide de couleur jaune :

qui peut être identifié par chromatographie ou électrophorèse, et dosé par spectrophotométrie à 360nm.

La présence de lysine dans le peptide va perturber cette méthode puisque la chaîne latérale de ce résidu porte un groupe -NH2 qui

réagira avec le FDNB.

détermination de l'ordre des enchaînements

des résidus

Identification des aminoacides terminaux N terminaux

Méthode de dansylation (chlorure de dansyl )

des résidus Identification des aminoacides terminaux N terminaux Méthode de dansylation (chlorure de dansyl )

Le chlorure de 1-diméthyl-amino-naphtalène-5-sulfonyle (DANS) réagit avec le NH2 terminal et donne un dérivé (dansyl-amino-acide) décelable par sa fluorescence jaune. La réaction est 100 fois plus sensible: composé sulfonamide très fluorescent permettant une plus grande sensibilité dans la détection.

Utilisée pour doser les acides aminés par HPLC.

La présence de lysine dans le peptide va perturber cette

méthode puisque la chaîne latérale de ce résidu porte un groupe -NH2 qui réagira avec le DNS-Cl.

détermination de l'ordre des enchaînements

des résidus

Identification des aminoacides terminaux

N terminaux

Méthode enzymatique (Exopeptidases /Aminopeptidases)

L'enzyme n'hydrolyse que la première liaison peptidique.

Cinétique de libération : Ordre de l’enchainement.

Méthode non précise: affinité enzyme-substrat:

Ex : Leucine aminopeptidase hydrolyse les liaisons N.t de tous les AcA sauf Proline.

détermination de l'ordre des enchaînements

des résidus

Identification des aminoacides terminaux C terminaux

Méthode enzymatique (Carboxy-peptidasepeptidases)

L'enzyme n'hydrolyse que la derniére liaison peptidique.

Méthode enzymatique (Carboxy-peptidasepeptidases) L'enzyme n'hydrolyse que la derniére liaison peptidique.

Carboxy-peptidase A ( la plus utilisée): extraite du pancréas :

attaque les liaisons Ct sauf celle du glycocolle et AcA basique .

Carboxy-peptidase B : extraite du pancréas : attaque les liaisons

Ct des AcA basiques .

détermination de l'ordre des enchaînements

des résidus

Identification des aminoacides terminaux

C terminaux

Méthode chimique (Hydrazinolyse)

Un traitement à l'hydrazine(H2N-NH2) à 100°C hydrolyse toutes

les liaisons peptidiques, et libère des hydrazides de tous les AA

sauf le C terminal, qui se présente comme un AA libre normal. Il est alors facile à isoler et à identifier. Nécessite moins d’une micromole de peptide mais ne permet de

déterminer qu’un seul résidu Ct .

et à identifier. Nécessite moins d’une micromole de peptide mais ne permet de déterminer qu’un seul

la dégradation récurrente d'Edman

formation d'un PTC-peptide à pH 9. Par un changement de pH (légèrement acide), il y a cyclisation et libération d'un dérivé PTH-aminoacide et d'un peptide amputé de son aminoacide

N-terminal.

En répétant ces cycles : action du PTC à pH 9 pour donner un PTC-peptide puis libération du PTH-aminoacide par passage à un pH acide, et du peptide (n-1) amputé du côté N-terminal, on

a, à chaque cycle, la libération de l'aminoacide suivant dans la

séquence du peptide original. L’AcA peut être isolé et identifié par chromatographie.

Des appareils (séquenceur) sont capables d'effecteur ces cycles automatiquement. Toutefois l'analyse est techniquement limitée à de séquences dont le nombre d'aminoacides est inférieur à 60.

détermination de l'ordre des enchaînements

des résidus

Dégradation des peptides en fragments

Hydrolyse chimique spécifique

- le bromure de cyanogène (BrCN) hydrolyse la liaison peptidique du côté carboxyle de la méthionine .

- le 2-nitro-5-thiocyanobenzoate (NTCB) hydrolyse la liaison peptidique du côté amine de la cystéine.

- Hydroxylamine(NH2OH): coupe entre Asn-Gly.

- N-Bromosuccinimide: hydrolyse la liaison peptidique du côté

carboxyle de la Tyrosine et Tryptophane.

détermination de l'ordre des enchaînements

des résidus

Dégradation des peptides en fragments

Hydrolyse enzymatique : endo-peptidases

L'enzyme hydrolyse des liaisons peptidiques internes entre deux aminoacides i, (i+1).

Il peut être spécifique du résidu en position i ou (i+1).

L'hydrolyse d'un peptide par une endopeptidase donnera plusieurs fragments peptidiques : si on a m coupures (m liaisons peptidiques hydrolysées), le peptide sera dégradé en (m+1) fragments peptidiques.

Exemples d’endo-peptidases

Enzyme

Coté N-t

Coté C-t

Particularité

Trypsine

Lys et Arg

Sauf si Pro en N-t

Chymotrypsine

Tyr, Try et Phe

Protéase stapylo

Asp et Glu

Pepsine

Tyr, Try et Phe

clostriparine

Arg

Thermolysine

Leu, Ile et Val

Séquençage des Protéines ayant Plusieurs Chaines Polypeptidiques

Deux chaines ou plus

- Agents dénaturants : Urée ou le chlorhydrate de guanidine .

Chaines liées par des ponts disulfures

Réduction par le B-mercapto-éthanolde guanidine . Chaines liées par des ponts disulfures Oxydation par l’acide performique : transforme la

Oxydation par l’acide performique : transforme la Cystéine et la cystine en acide Cystéique. la Cystéine et la cystine en acide Cystéique.

HO-COOH Acide performique SO3H Deux Acides cystéique
HO-COOH Acide performique SO3H Deux Acides cystéique

HO-COOH

Acide performique

SO3H

SO3H
SO3H
SO3H
HO-COOH Acide performique SO3H Deux Acides cystéique

Deux Acides cystéique

2[ HS-CH2-CH2OH ] B-mercapto-éthanol Deux cystéine S-CH2-CH2OH S-CH2-CH2OH
2[ HS-CH2-CH2OH ] B-mercapto-éthanol Deux cystéine S-CH2-CH2OH S-CH2-CH2OH

2[ HS-CH2-CH2OH ]

B-mercapto-éthanol

2[ HS-CH2-CH2OH ] B-mercapto-éthanol Deux cystéine S-CH2-CH2OH S-CH2-CH2OH

Deux cystéine

S-CH2-CH2OH

S-CH2-CH2OH

Technique d’électrophorèse diagonale

Utilisée pour déterminer la position des liaisons disulfures.

Clivage spécifique de la protéines : les disulfures

restent intactes.

Electrophorèse puis exposition aux vapeurs d’acide performique qui clive les disulfures et les convertis

en résidus d’acide cystéique.

2 ème électrophorèse perpendiculaire .

 R-CH2-COO-  R-CH2-COO- après exposition auxElectrophorèse vapeurs de l’acide performique
 R-CH2-COO-
 R-CH2-COO-
après exposition auxElectrophorèse
vapeurs de l’acide performique

1 ère direction avant exposition à l’acide performique

techniques récentes

Technique du DNA recombinant

La séquence des quatre types de base du DNA (A, T, G, C)

révèle directement la séquence des AcA de la protéine

codée par le gène ou la molécule de RNA messager correspondante

spectrométrie de masse