ANLISIS DE VITAMINAS POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA

EFICACIA O HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

I. INTRODUCCION
El anlisis de las vitaminas en los alimentos es un gran desafo para los analistas
dado que se asocia con problemas significativos. Muchos de estos problemas han
sido eliminados gracias a los recientes avances en la tecnologa y el desarrollo de
nuevos enfoques analticos. Analizar vitaminas en los alimentos no es, a pesar de
los recientes avances, una tarea fcil y se necesita experiencia y los
conocimientos adecuados para producir resultados repro-ducibles, que sean
exactos y vlidos
Para el anlisis de vitaminas liposolubles en la leche existe diversas tcnicas
como cromatografa de papel , en capa fina ,mtodos colorimtricos y
espectrofotomtricos , pero es indudable que la HPLC es la tcnica ms adecuada
,especifica y rpida ,para el anlisis de vitaminas liposolubles , a pesar de su costo
alto . La ventaja de la HPLC se manifiesta en que es posible separar los
derivados de cada vitamina de las sustancias interferentes .Tienen aplicacin
tanto la cromatografa en fase reversa como la de fase normal , siendo este
ltimo utilizado en la separacin de vitaminas .

En cuanto a la deteccin de analitos, los detectores utilizados en HPLC deben ser

dispositivos capaces de medir una propiedad diferencia entre un lquido (fase
mvil) y un slido ( analitos disueltos ). Uno de los detectores ms utilizados es de
arreglo de diodos, ultrevioleta-visible (DAD UV VIS).este tipo de detectos mide la
absorbancia del analito , adems posee buena sensibilidad y rango lineal , que
permite detectar analitos e el orden de nanogramos y en amplio rango de
concentraciones .
La vitamina E que se encuentra en la naturaleza abarca una serie de compuestos
denominados tocoferoles y tocotrienoles. Estos compuestos tienen diferentes
actividades biolgicas y por lo tanto es importante que sean cuantificados
individualmente si ha de determinarse la actividad biolgica de la vitamina E. Entre
las fuentes ms ricas de vitamina E estn los cereales, germen de cereales y la
mayora de las semillas oleaginosas, nueces y aceites a partir de ellos. La
vitamina E tambin se encuentra en los vegetales con hojas (lechuga, espinaca,
repollo, puerro), en la grasa animal y tambin en la leche, mantequilla y queso. El
representante ms importante del grupo de la vitamina E es -tocoferol. En los
alimentos procesados, la vitamina E puede ser suplementada como -tocoferol o
acetato de -tocoferol.
a) Frmula y propiedades
Frmula emprica

-tocoferol C29H50O2
(P. molecular 430,7)
Acetato de -tocoferol C31H52O3
(P. molecular 472,8)
-tocoferol C28H48Oa
(P. molecular 416,7)
r-tocoferol C28H4g02
(P. molecular 416,7)
5-tocoferol C27H46O2
(P. molecular 402,6)
Espectro de absorcin
-tocoferol
Max. a 292 nm; mn. a. 255 nm
(etanol)
Acetato de -tocoferol
Mx. a 284 nm; mn. a. 254 nm
(etanol)
E 1%-lcm en metanol para:
-tocoferol 76 (292 nm)
-tocoferol 89 (296 nm)
Y-tocoferol 91(298 nm)
6-tocoferol 87 (298 nm)
Estabilidad
El acetato de -tocoferol es relativamente estable en atmsfera de oxgeno; es
hidrolizado por la humedad en presencia de lcalis o cidos fuertes liberando tocoferol, el cual es rpidamente oxidado por el aire.
Unidades biolgicas
Para propsitos dietticos, la actividad de la vitamina E es expresada como
equivalentes de RRR--tocoferol (-ET). 1 -ET es la actividad de 1 mg de RRR-atocoferol. Para estimar el total de -ETs de dietas mixtas que contienen slo
formas naturales de vitamina E, se pueden aplicar los siguientes factores de
conversin (8).
1 mg de RRR--tocoferol es equivalente a:

1,1 mg de RRR-acetato de -tocoferol

3,3 mg de RRR--tocotrienol
2,0 mg de RRR--tocoferol
1,36 mg de -tocoferol slo racmico
4,0 mg de RRR-y-tocoferol
1,49 mg de acetato de -tocoferol slo
racmico
100,0 mg de RRRA tocoferol
FUNDAMENTO HPLC
La sustancia pasa a travs de una columna con una fase estacionaria y por el
bombeo de un lquido a alta presin. La elucin depende de la polaridad del
analito y del tipo de columna que se utiliza, as como del detector.
La variacin de la polaridad de la fase mvil a lo largo de la separacin es uno de
los parmetros que se aplica para mejorar la eficiencia de la separacin .
II. MTODO
El mtodo anteriormente utilizado para la determinacin de la vitamina E en los
alimentos era una reaccin de cloruro frrico que se reduca a iones ferrosos, los
que forman un complejo de color rojo con ajaMipiridina, o batofenantrolina (4,7difenil-1,10-fenantrolina).
Se realizaba la reaccin denominada Emmerie-Engel en extractos purificados
cromatogrficamente despus de saponificar las muestras y que era interferida por
muchos componentes. Produca complejos ms bien inestables y el tiempo de
manejo complicaba el procedimiento, el cual requera mucho trabajo.
Se utiliz la cromatografa de gas por algn tiempo pero muy pronto se
reconocieron las ventajas de HPLC, tambin considerando la posibilidad de
separar simultneamente a, , y, y 5-tocoferol con esta tcnica que estaba
emergiendo.
Muestras de aceites y grasas que contienen tocoferoles no esterificados
Muestras de aceites y grasas con bajo contenido de agua y que contienen
tocoferoles no esterificados pueden procesarse muy fcilmente: Aproximadamente
2 g de muestra son pesados exactamente hasta el mg ms cercano dentro de un
matraz aforado de 25 ml. Se agrega n-hexano u otro solvente apropiado y se
disuelve con agitacin. La sonicacin de la solucin puede apoyar el proceso de
disolucin. El volumen es completado hasta el aforo con el mismo solvente. Esta
solucin de la muestra puede utilizarse slo en el sistema cromatogrfco de fase
normal. Puede ser necesario diluir ms esta solucin antes de la cromatografa o
utilizar un menor peso de la muestra.

La margarina o mantequilla se tratan de una manera similar. Es necesario separar

la grasa de estas muestras antes de la etapa de dilucin. Esto puede realizarse
por ejemplo: mezclando la muestra con sulfato de sodio anhidro, agregando nhexano y, tratando la mezcla en un bao ultrasnico. Los slidos son filtrados y
lavados extensamente con n-hexano. Se remueve el solvente utilizando un
evaporador rotatorio y un vaco parcial a una temperatura que no exceda 50C, y
el residuo es disuelto en un volumen definido de n-hexano y cuantificado por
HPLC de fase normal.
Saponificacin y extraccin
El procedimiento ms comn para la determinacin de tocoferoles incluye la
saponificacin alcalina de las muestras seguida por la extraccin del material no
saponificable con un solvente orgnico apropiado. Cualquier ster de a-tocoferol
que pueda haberse agregado como un suplemento a los alimentos ser convertido
a t-tocoferol por este procedimiento. Se saponifica 2-10 g de la muestra
preferentemente bajo nitrgeno utilizando una mezcla de etanol o metanol, agua,
un antioxidante tal como el cido ascrbico, hidroquinona, piro-galol o BHT e
hidrxido de potasio acuoso. Los tocoferoles son muy sensibles al oxgeno en un
ambiente alcalino. Por lo tanto, el alcohol y el antioxidante deberan agregarse a la
muestra antes de la adicin de la solucin de hidrxido de potasio necesario para
la saponificacin y tiene que tenerse cuidado en remover todo el oxgeno del
recipiente de reaccin. A continuacin se muestra un ejemplo de la proporcin de
estos reactivos.

Proporcin de reactivos para saponificacin

Peso de la
muestra
2-5 g

Alcohol

Acido
ascrbico

Hidrxido de potasio

50 ml (metanol)

0,25 g

5 ml (50%)

150ml (etanol)

1,0 g

50 ml (60%)

100ml (etanol)

1,0 g + 0,04 g 12 g + 20 ml de
Na2S
agua

10 g

5-10 g

El tiempo normal de saponificacin es de 15-45 minutos con temperaturas que

fluctan de 80 a 100C (reflujo).
Los tocoferoles son extrados de la mezcla de saponificacin por medio de un
solvente adecuado, por ejemplo, ter dietlico, tertbutil metil ter, n-hexano, 3 a 4
veces con volmenes que fluctan de 50-150 ml. Los extractos combinados son
lavados a pH neutro con agua (2-4 veces, 50-150 ml).
Evaporacin y dilucin
Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la evaporacin
utilizando un evaporador rotatorio bajo un vaco parcial y a una temperatura que
no exceda 50C. Deben tomarse medidas para remover restos de agua tales como
secar con sulfato de sodio, o destilacin azeotrpica con etanol o tolueno o el uso
de papel filtro para separacin de fases.
El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase mvil u otro solvente
compatible con HPLC de tal modo de obtener una concentracin apropiada para la
inyeccin dentro de la columna de HPLC. Esta la solucin final de la muestra.
HPLC
Principalmente, pueden utilizarse dos modos de cromatografa (fase normal y fase
reversa) para la cuantificacin de los tocoferoles. El sistema de fase normal tiene
claras ventajas dado que todos los vitmeros son separados mientras que los
sistemas de fase reversa no separan -tocoferol de y-tocoferol.
La deteccin se realiza preferentemente mediante fluorescencia debido a su
mayor selectividad as como tambin por los menores lmites de deteccin
obtenidos si se compara con UV. A partir de las mltiples posibilidades para lograr
buenas separaciones, a continuacin las condiciones de dos procedimientos de
trabajo. Los estndares y soluciones estndares deberan controlarse
espectromtricamente en relacin a la pureza y utilizar la concentracin corregida
para el clculo. Es importante mencionar claramente las unidades utilizadas para
informar los resultados por ejemplo, en mg -tocoferol/100 g de alimento.
Condiciones de los sistemas de cromatografa para tocoferoles

Columna

Sistema de fase normal

(FN)

Sistema de fase reversa

(FR)

Acero inoxidable; 125x4,0 nm

Acero inoxidable; 125x4,0 nm

Fase
estacionaria

Lichrosorb Si 60 (Merck);
5 m

Hypersil ODS (Shandon);

5 m

Fase mvil

n-Hexano: Dioxano (97:3)

Metanol: H2O (98:2)

Flujo

l,0 ml/min

0,5 ml/min

Presin

35 bar

60 bar

Volumen de
inyeccin

20-50 l

20 l

Deteccin

Fluorescencia; Em: 292 nm

Ex: 330 nm

UV: 285 nm

Tiempo de
retencin
(aprox. en min)

-tocoferol
-tocoferol
tocoferol
-tocoferol

-tocoferol
-tocoferol
tocoferol
-tocoferol

Estndar

aprox. 10 g/ml -tocoferol

aprox. 10 g/ml -tocoferol

Clculo

Mtodo estndar externo;

Recuento de rea o altura

Mtodo estndar externo;

Recuento de rea o altura

5,4
8,7
9,7
14,9

12,0
10,5
8,7
5,4

CUANTIFICACION
Se prepararon Curvas Estndar de retinol y tocoferol en etanol. Las
concentraciones Stock de las vitaminas se calcularon basadas en la Ley de
Lambert y Beer usando el coeficiente de extincin de retinol de 1835 a 325 nm y el

de tocoferol de 75.8 a 290 nm para corregir la pureza de las vitaminas. Las curvas
estndar se utilizaron para calcular la concentracin de cada vitamina en las
muestras analizadas. Para calcular los valores de retinol y tocoferol de GSS a
equivalentes a retinol y tocoferol se us un factor recuperacin / volumen
ajustado (retinol o tocoferol srico / retinol o tocoferol de GSS), que fue calculado
del set de muestras analizadas. La mediana de estas relaciones se us para
ajustar la concentracin de retinol y tocoferol de GSS a valores equivalentes de
retinol y tocoferol en la muestra .
A=logI0I=cl(1)
Donde l es la longitud de la cubeta en cm, c representa la concentracin de soluto
en mol/l y es la absortividad molar (coeficiente de extincin molar) medido en
l/mol.cm.

Bibliografa
Lpez Laura B, Baroni Andrea V., Rodrguez Viviana G, Greco Carola B,
Costa Sara Macas, Rodrguez de Pece Silvia et al . Desarrollo y validacin
de un mtodo por HPLC para la determinacin de niveles de vitamina A en
leche materna. Su aplicacin a una poblacin rural de Argentina. ALAN .
2005 Jun; 55(2): 140-143. Disponible en:
http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S000406222005000200006&lng=es.
2 Julio Serrano .Implementacion de un mtodo cromatografico (hplc / dad )
para la determinacin y cuantificacin de vitaminas liposolubles en leche
.Universidad Nacional Sartander .Bucaranga .2008.
3 Willy Schep.Anlisis de vitaminas en alimentos , FAO cap 17 .
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