Curso de Inmunologa General - Laboratorio

Semestre 2015-1

Ejercicio Experimental 10.

Proyecto prctico
Determinacin de los ttulos de anticuerpos contra OVA por ELISA.

Metodologa de ELISA
1. Placas para ELISA de 96 pozos (Corning Inc. No. Cat. 3590) se fijarn
10microgramos por pozo en un volumen de 100 L de solucin amortiguadora de
carbonatos pH=9.5. Se incubarn 40 min a 37 C y toda la noche a 4C.
2. Despus del tiempo de incubacin se desechar el contenido de los pozos invirtiendo
la placa rpidamente y con fuerza sobre un contenedor de desechos con 10 mL de
hipoclorito de sodio al 5% en agua.
3. Se lavarn sumergiendo las placas en un contenedor con solucin de lavado (AguaTween 20 al 0.1%) y al sacar la placa se sostiene con una mano y se darn cuatro
golpes fuertes con la palma de la otra mano en cada uno de los cuatro costados de
la placa. Se desechar el contenido en el contenedor por inversin de la placa como
en el punto anterior.
4. Sobre un papel absorbente se colocarn las placas invertidas para que escurra el
exceso de lquido.
5. Posteriormente se bloquearn las placas adicionando a cada pozo 100L de solucin
de bloqueo (PBS-Leche descremada 5%) y se incubarn durante 1 hora a 37 C.
6. Se lavarn las placas 4 veces como en el punto 3 y se escurrirn como en el punto 4.
7. Se etiquetan las placas con el nombre del antgeno, fecha, grupo equipos
responsables. Se envolvern las placas en plstico autoadherible y se refrigerarn a
4C hasta su uso.
8. Los sueros a evaluar se descongelan en hielo.
9. En una placa de dilucin se adicionarn 100 L por cada pozo de solucin de
bloqueo y solo a los de la primera columna se le adicionarn 195 L.
10. A cada pozo de la primera columna se adicionarn 5L de suero y se registrar el
nmero de suero en la hoja de control.
11. Cada experimento debe contar con un control positivo de titulo conocido, un control
negativo, un control de una fila sin antgeno, un control sin suero y un control sin
segundo anticuerpo. Todos ellos deben estar registrados en la hoja de control
12. A partir de la primera dilucin se harn diluciones seriadas 1:2 tomando 100 L de
la primera fila y se colocndolos en la segunda. Se homogeneiza con la pipeta sin
hacer burbujas subiendo y bajando un volumen aproximado de 50 L. Una vez
M.A.M.

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homogeneizado se toman 100 L de la segunda fila y se pasan a la tercera,
repitiendo la homogeneizacin hasta completar las filas.
13. Las diluciones se transfieren a una placa de ELISA en la cual se fijaron los
antgenos respetando el orden de los pozos. Se etiqueta la placa de ELISA
perfectamente con la fecha y los datos del experimento, adems de asignarle un
nmero a cada placa.
14. Se incubarn una hora a 37 C.
15. Despus de la incubacin las placas se lavarn y escurrirn 4 veces como en los
puntos 3 y 4.
16. Posteriormente se agregar a cada pozo 100L del segundo anticuerpo conjugado
con peroxidasa de rbano (HRP) diluido 1:1000 en solucin de bloqueo.
17. Se incubar durante 1 hora a 37 C .
18. Al finalizar el tiempo de incubacin las placas se lavarn y escurrirn 4 veces como
en los puntos 3 y 4.
19. Se adicionarn 100L de solucin de revelado (perxido de hidrgeno al 15% en
amortiguador de citratos pH=5.6) y se incubarn durante 10 minutos exactos en
oscuridad.
20. Despus de la incubacin se agregarn a cada pozo 10L de H2SO4 2 N para
detener la reaccin.
21. Posteriormente se determinar la densidad ptica en el lector para placas de ELISA
(Dynex Technologies Modelo MRXII) a una longitud de onda de 490nm
22. La densidad ptica de los controles negativos se promedia y el resultado se
multiplica por tres para determinar el ttulo.
Anlisis de resultados.
1. Una vez obtenidas las lecturas de absorbancias para cada placa y obtenidos
los ttulos de anticuerpos, se graficarn colocando en el eje de las ordenadas el
ttulo de anticuerpos expresado en forma logartmica de base dos multiplicado
por la dilucin inicial (-log2 X 40) contra los das posteriores a la inmunizacin.
2. Se determinar si existe capacidad adyuvante al comparar los ttulos de
anticuerpos inducidos por la administracin nica de los antgenos frente a los
inducidos con la administracin de los antgenos y los adyuvantes evaluados.
3. Se comparar la capacidad adyuvante inducida entre las diferentes moleculas
evaluadas a travs de la observacin de un aumento en los ttulos de
anticuerpos especficos en aquellos grupos en los cuales se co-administraron
los antgenos y las diferentes adyuvantes frente al grupo de conejos en los
cuales se administr nicamente el antgeno.

M.A.M.