WaldemarPacheco deOliveiraFilho Revisado

I
UNIVERSIDADE DE SO PAULO
INSTITUTO DE QUMICA DE SO CARLOS
PROGRAMA DE PS-GRADUAO
UTILIZAO DE CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA PARA

A DETERMINAO DE ANTIOXIDANTES SINTTICOS EM
BIODIESEL: UMA ABORDAGEM METROLGICA
WALDEMAR PACHECO DE OLIVEIRA FILHO
Tese apresentada como requisito

parcial obteno do ttulo de Doutor.
Programa de Ps-Graduao em Qumica
Analtica e Inorgnica,
Laboratrio de Qumica Ambiental,
Instituto de Qumica de So Carlos,
Universidade de So Paulo.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Olmpia de Oliveira
Rezende
Exemplar revisado
O exemplar original encontra-se em acervo
reservado na Biblioteca do IQSC-USP
SO CARLOS
2013
II
III
Ao Senhor, por ter tornado possvel a concluso deste

trabalho.
IV
Agradecimentos
Danielle, pelo amor e convvio dirio, e por fazer parte de minha vida junto
com o Joo Felipe.
Dra. Maria Olmpia de Oliveira Rezende, pela amizade, compreenso,
orientao presente e segura.
Ao Dr. Fbio da Silva Vinhado, pelo auxlio em vrias etapas deste trabalho.
Aos Drs. Marcos Roberto Monteiro e Igor Renato Bertoni Olivares, pela
contribuio efetiva e dissipao de dvidas decorrentes durante o trabalho.
Mrcia Valria de Souza Alves, Marcela Ganem Flores, Maria do Socorro
Maia Quintino e Vinicius Leandro Skrobot, pelo apoio fundamental para o
desenvolvimento deste trabalho.
Aos colegas do Centro de Pesquisas e Anlises Tecnolgicas da Agncia
Nacional do Petrleo, Gs Natural e Biocombustveis, pela amizade e pelo
excelente convvio.
Aos colegas do Laboratrio de Qumica Ambiental do Instituto de Qumica de
So Carlos, da Universidade de So Paulo, pela ajuda e pelo companheirismo.
Ao meu pai, me e irm, pelo incentivo e ajuda em momentos difceis.
Dilza Peixoto Batista Paiter, pelo amor e pelas oraes.
Aos membros da Igreja Crist Maranata do Lago Norte-DF, pelas oraes e
pelos momentos de alegria.
ANP e ao IQSC-USP, pelo suporte operacional e financeiro.
V
RESUMO
O biodiesel um combustvel renovvel composto por steres alqulicos
obtidos a partir de leos vegetais e/ou gorduras animais. um produto que
devido a sua composio, susceptvel a reaes de oxidao,
comprometendo assim sua qualidade e a adequao ao uso. Como preveno
de problemas decorrentes de sua oxidao, e tambm para adequao do
produto aos requisitos de qualidade, produtores de biodiesel tm utilizado
rotineiramente antioxidantes sintticos em seus processos de obteno de
biodiesel. Estudos recentes tm apontado o TBHQ (tert-butil hidroquinona)
como antioxidante sinttico de melhor desempenho para biodiesel, mas alm
deste antioxidante, produtores nacionais tm adotado tambm o BHT (butil
hidroxitolueno). Entretanto, ainda no h mtodo analtico difundido entre os
agentes econmicos envolvidos com a cadeia do biodiesel para a quantificao
dos antioxidantes sintticos para produtos finalizados. Esta determinao, em
princpio, pode ser uma ferramenta importante em estudos que confrontam a
oxidao do biodiesel com a concentrao de determinado antioxidante que
tenha sido adicionado quando da sua produo, ao longo de perodos de
armazenamento; tambm em estudos que avaliem possveis impactos
ambientais causados pela utilizao desses produtos, que apresentam
toxicidade comprovada e possuem teores controlados pelo Ministrio da Sade
para a indstria alimentcia. Dentre as tcnicas analticas utilizadas no
desenvolvimento de mtodos para quantificao dos antioxidantes sintticos,
destacam-se a voltametria (especificamente para TBHQ) e cromatografia
lquida, mas ainda sem apresentarem um potencial de uso em larga escala
pelos agentes de mercado. Neste trabalho, foi utilizada cromatografia em fase
gasosa para o desenvolvimento de um novo mtodo para a quantificao de
TBHQ e BHT usados pelos produtores de biodiesel. Inicialmente, foram feitos
testes com os antioxidantes fornecidos por um produtor, para verificao de
seu uso como padres de calibrao, por meio de cromatografia gasosa com
deteco por espectrmetro de massas. Em seguida, realizou-se o
desenvolvimento do mtodo propriamente dito, por cromatografia gasosa com
detector de ionizao por chama. O mtodo ento foi otimizado, verificando-se
possveis limitaes em relao s amostras analisadas, e ento validado,
conforme parmetros previstos em protocolos internacionais. Na validao
foram empregados mtodos estatsticos pertinentes ao mtodo desenvolvido, e
os resultados de validao foram criticamente analisados segundo critrios de
aceitao previamente estabelecidos. Destaque para valores de recuperao
que oscilaram entre 92% e 106%. Foi tambm estimada a incerteza de
medio, ao longo da faixa de trabalho, utilizando conceitos apresentados em
guias internacionais de estimativa de incerteza de medio. Foi verificado que
o modelo de regresso linear escolhido pode ter impacto direto nos valores de
incerteza de medio, que oscilaram entre 1% e 40% dependendo da regio da
faixa de trabalho. O mtodo ento foi testado quanto sua aplicabilidade, em
amostras comerciais, e relacionando-se os resultados obtidos com os valores
de estabilidade oxidao dessas amostras. Aqui, o TBHQ tambm
apresentou o melhor desempenho para adequao do biodiesel s
especificaes de qualidade, confirmando os dados disponveis na literatura.
VI
ABSTRACT
Biodiesel is a renewable fuel composed by alkyl esters generated from

vegetable oils and/or animal fats. Its a susceptible product to oxidation
reactions because its composition, thus compromising their quality and use.
Currently, biodiesel manufacturers have used synthetic antioxidants in
production processes, as prevention to oxidation problems, also as product
adjustment to quality requirements. Recent studies have indicated TBHQ (tertbutyl hydroquinone) as the synthetic antioxidant with the best performance for
biodiesel, but beyond this antioxidant, national manufacturers have also
adopted the BHT (butylated hydroxytoluene). However, there is not a currently
analytical method widespread among the economic agents involved in the chain
of biodiesel for the quantification of synthetic antioxidants to finished products.
At first, this determination can be an important tool to make advance to studies
which check the relationship between biodiesel oxidation and the used
antioxidant concentration, added in biodiesel production, at long biodiesel
storage times. This determination, in principle, can be an important tool in
studies which compare the oxidation of biodiesel with the concentration of a
particular antioxidant which has been added at the time of its production, over
periods of storage, also in studies to assess possible environmental impacts the
use of these products, which have proven toxicity levels and possess controlled
by the Ministry of Health for the food industry. Among the analytical techniques
used in the development of methods for quantification of synthetic antioxidants,
stand out voltammetry (specifically for TBHQ) and liquid chromatography, but
still without presenting a potential for widespread use by the market agents. In
this work, the gas chromatography was used as a new method development for
TBHQ and BHT antioxidants (available in biodiesel manufacturers)
determination. Initially, tests with antioxidants provided from a manufacturer
were carried out, to verify their using as calibration standards conditions,
performed by gas chromatography with mass spectrometer detector. Then,
there was the development of the method itself, by gas chromatography with
flame ionization detector. Then the method was optimized, verifying possible
limitations on samples, and validated according to international protocols
parameters provided. In this validation, statistical methods compatible to
developed method were applied, and the validation results were critically
analyzed according to previously established acceptance criteria. Recovery
data between 92% and 106% are detached. In addition, the measurement
uncertainty was estimated, using presented concepts in according with
international guides of measurement uncertainty calculation. The impact of the
adopted linear regression model in measurement uncertainty values was
verified, as been a notable influence. These values stayed between 1% and
40%, depending of the test method work range. Finally, the new method was
verified about its applicability, being carried out for commercial samples, and
checking their obtained results and Oxidation Stability values relationship. Here,
TBHQ also presented the best antioxidant performance for biodiesel suitability
to quality requirements, in agreement with available data in literature.
VII
SUMRIO
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE TABELAS
XII
LISTA DE QUADROS
XIV
LISTA DE FIGURAS
XV
1. Introduo
2. Objetivos do Trabalho
3. Reviso Bibliogrfica
3.1 O biodiesel
3.1.1 Produo
3.1.2 Controle de qualidade do biodiesel
3.1.3 Histrico do biodiesel no Brasil
16
3.1.4 O processo de oxidao do biodiesel
24
3.2 Antioxidantes
29
3.2.1 Uso de antioxidantes em biodiesel
29
3.2.2 Metodologias desenvolvidas para determinao de antioxidantes

sintticos em biodiesel
34
3.3 Cromatografia em Fase Gasosa
39
3.3.1 Generalidades
39
3.3.2 Instrumentao
41
3.3.3 Mtodos de derivatizao
46
3.3.4 Cromatografia Gasosa e o biodiesel
47
3.4 Validao de mtodos
49
3.4.1 Metrologia e Validao
49
3.4.2 Incerteza de Medio
54
4. Experimental
57
4.1 Material
58
4.1.1 Reagentes e solventes
58
4.1.2 Solues
58
4.1.2.1 Solues estoque de antioxidantes sintticos
58
4.1.2.2 Solues de calibrao preparadas a partir das solues

estoque
59
4.1.2.3 Preparo de solues de amostras
60
VIII
4.1.3 Vidrarias e instrumentos volumtricos
60
4.1.3.1 Vidrarias
60
4.1.3.2 Instrumentos volumtricos
61
4.1.4 Balana
61
4.1.5 Instrumentao analtica
61
4.1.5.1 Aparelhagem utilizada nos experimentos de

caracterizao dos antioxidantes sintticos
61
4.1.5.2 Aparelhagem utilizada nas demais etapas experimentais
62
4.2 Metodologia
62
4.2.1 Caracterizao dos antioxidantes sintticos
62
4.2.2 Desenvolvimento do mtodo proposto
64
4.2.3 Otimizao do mtodo
69
4.2.4 Validao do mtodo
69
4.2.5 Incerteza de medio
72
4.2.6 Aplicabilidade do mtodo
74
5. Resultados e Discusso
75
5.1 Caracterizao dos antioxidantes sintticos
75
5.2 Desenvolvimento do mtodo proposto
79
5.3 Otimizao do mtodo
81
5.4 Validao do mtodo
85
5.4.1 Exatido
85
5.4.2 Preciso
85
5.4.3 Fidelidade Repetibilidade de reas
85
5.4.4 Fidelidade Repetibilidade de tempos de reteno
85
5.4.5 Linearidade
87
5.4.6 Limite de Deteco
96
5.4.7 Limite de Quantificao
101
5.4.8 Sensibilidade
103
5.4.9 Seletividade
103
5.4.10 Estabilidade
103
5.4.11 Intervalo de aplicao
105
5.5 Incerteza de medio
105
5.6 Aplicabilidade do mtodo
128
6. Concluso
134
IX
7. Referncias Bibliogrficas
137
ANEXO 1 Trabalhos publicados
145
ANEXO 2 Equaes Complementares utilizadas nas

regresses lineares
151
ANEXO 3 Equaes utilizadas nos testes estatsticos para

definio do mtodo de regresso
153
ANEXO 4 Parmetros de qualidade para algumas amostras

comerciais de biodiesel utilizadas neste trabalho
157
X
LISTA DE ABREVIATURAS
A/D ANALGICO / DIGITAL
ABNT ASSOCIAO BRASILEIRA DE NORMAS TCNICAS
ANP AGNCIA NACIONAL DO PETRLEO, GS NATURAL E
BIOCOMBUSTVEIS
AOM ACCELARATED OXIDATION METHOD
ASTM AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS
B100 BIODIESEL
B20 MISTURA CONSTITUDA DE 20% DE BIODIESEL EM LEO DIESEL
FSSIL
B6 MISTURA CONSTITUDA DE 6% DE BIODIESEL EM LEO DIESEL
FSSIL
BHA BUTIL HIDROXIANISOL
BHT BUTIL HIDROXITOLUENO
CEIB COMISSO EXECUTIVA INTERMINISTERIAL DE BIODIESEL
CG CROMATOGRAFIA GASOSA
CGL CROMATOGRAFIA GS-LQUIDO
CGS CROMATOGRAFIA GS-SLIDO
CITAC COOPERATION ON INTERNATIONAL TRACEABILITY IN
ANALYTICAL CHEMISTRY
CLAE CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA
CLC CURVA LIMITE DE CONFIANA
CLP CURVA LIMITE DE PREVISO
CTAB CETYLTRIMETHYLAMMONIUM BROMIDE
CV COEFICIENTE DE VARIAO
D/A DIGITAL / ANALGICO
DIC DETECTOR DE IONIZAO POR CHAMA
EM ESPECTROMETRIA DE MASSAS
EN EUROPENNE NORME
EUA ESTADOS UNIDOS DA AMRICA
GC GAS CHROMATOGRAPHY
GUM GUIDE OF UNCERTAINTY MEASUREMENT
HT HIGH TEMPERATURE
XI
IA NDICE DE ACIDEZ
IEC INTERNATIONAL ELECTROTECHNICAL COMMISSION
IEO INDUCED ELECTRON OXIDATION
IP NDICE DE PERXIDOS
ISO INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
LCI LIMITE DE CONFIANA INFERIOR
LCS LIMITE DE CONFIANA SUPERIOR
LD LIMITE DE DETECO
LII LMPIDO E ISENTO DE IMPUREZAS
LP LIMITE DE PREVISO
LPI LIMITE DE PREVISO INFERIOR
LPS LIMITE DE PREVISO SUPERIOR
LQ LIMITE DE QUANTIFICAO
MME MINISTRIO DE MINAS E ENERGIA
MMQO MTODO DOS MNIMOS QUADRADOS ORDINRIO
MMQP MTODO DOS MNIMOS QUADRADOS PONDERADO
MS MASS SPECTROMETRY
MSTFA N-N-TRIMETILSILILTRIFLUOROACETAMIDA
NBR NORMA BRASILEIRA
NIST NATIONAL INSTITUTE OF STANDARDS AND TECHNOLOGY
P-DSC CALORIMETRIA DIFERENCIALDE VARREDURA SOB PRESSO
PFC PONTO DE FULGOR CALCULADO
PG PROPIL GALATO
PNPB PROGRAMA NACIONAL DE PRODUO DE BIODIESEL
RBC REDE BRASILEIRA DE CALIBRAO
RCLA REATORES CONTNUOS DE LEITO AGITADO
RELACRE ASSOCIAO DE LABORATRIOS ACREDITADOS DE
PORTUGAL
RSSOT RAPID SMALL SCALE OXIDATION TEST
S10 LEO DIESEL COM TEOR MXIMO DE ENXOFRE DE 10 mg/kg
TBHQ TERT-BUTIL HIDROQUINONA
TMS TRIMETILSILIL
UV ULTRAVIOLETA
VVC VALOR VERDADEIRO CONVENCIONAL
XII
LISTA DE TABELAS
1. Composio percentual em cidos graxos para algumas
matrias-primas
2. Parmetros de qualidade para o biodiesel
10
3. Especificaes do biodiesel
15
4. Mtodos de cromatografia gasosa em anlises

de biodiesel
48
5. Parmetros gerais para validao de mtodos
52
6. Reagentes e solventes
58
7. Solues estoque de antioxidantes sintticos
59
8. Solues de calibrao
59
9. Preparo de solues para leitura de amostras
60
10. Condies de operao CG-EM
63
11. Condies de operao
66
12. Protocolo de validao
72
13. Teor de gua nas amostras utilizadas inicialmente no

desenvolvimento da metodologia
83
14. Teor de gua para o novo conjunto de amostras
84
15. Resultados da validao
86
16. Teste Jacknife para TBHQ
89
17. Teste Jacknife para BHT
90
18. Teste Ryan-Joiner para TBHQ
91
19. Teste Ryan-Joiner para BHT
91
20. Teste de Durbin-Watson para TBHQ
92
21. Teste de Durbin-Watson para BHT
92
22. Teste de Brown-Forsythe para BHT
94
23. Limites de deteco e quantificao
101
24. Quantificao de amostras com concentrao prxima ao LD

e ao LQ
102
25. Recuperaes para concentraes prximas ao LQ
102
26. Comparao dos coeficientes angulares
103
27. Estimativa da Estabilidade
104
28. Repetibilidade do preenchimento do balo volumtrico
113
XIII
29. Repetibilidade de volume da micropipeta
118
30. Ensaio de repetibilidade
123
31. Resultados de Concentrao e de Estabilidade Oxidao
129
32. Resultados
131
XIV
LISTA DE QUADROS
1. Determinao de antioxidantes em biodiesel incerteza das
massas
111
2. Determinao de antioxidantes em biodiesel incerteza do

volume do balo para soluo estoque
112
3. Determinao de antioxidantes em biodiesel incerteza da

Concentrao da soluo estoque
116
4. Determinao de antioxidantes em biodiesel incerteza do

Volume pipetado de soluo estoque
117
5. Determinao de antioxidantes em biodiesel incerteza da

massa do padro 1
120
6. Determinao de antioxidantes em biodiesel incerteza

combinada dos padres
121
7. Determinao de antioxidantes em biodiesel incerteza final
122
XV
LISTA DE FIGURAS
1. Reao de Transesterificao
2. Grfico quantitativo de converso em uma reao progressiva de

transesterificao
3. Fluxograma esquemtico de processo empregado para a produo de

biodiesel
4. Mapa evidenciando a estratgia do governo de explorar o potencial de

matria-prima para produo do biodiesel por regio
18
5. Cadeia de produo e distribuio de biodiesel no Brasil
19
6. Evoluo da produo de biodiesel no Brasil
20
7. Infraestrutura da produo de Biodiesel no Brasil - 2011
20
8. Evoluo das matrias-primas utilizadas para a produo de

biodiesel
21
9. Planta de usina produtora de biodiesel
21
10. Ricinoleato de metila, constituinte majoritrio do biodiesel

de mamona
24
11. Equipamento Rancimat
27
12. Grfico obtido no ensaio Rancimat de uma amostra de biodiesel
28
13. Alguns antioxidantes sintticos
29
14. Espectro obtido em estudo por espectrofotometria UV-Visvel
32
15. Curvas de nvel utilizadas para demonstrar graficamente a

eficincia do TBHQ
32
16. Cromatograma ilustrado em Tagliabue et al
34
17. Reao de oxidao de hidroquinona para quinona
35
18. Voltamogramas cclicos evidenciando que o uso de surfactante

melhora o sinal eletroqumico para determinao
35
19. Voltamogramas evidenciando que o CTAB o surfactante que

melhor potencializa o sinal de oxidao do TBHQ
36
20. Voltamogramas, para adio-padro na quantificao de TBHQ em

biodiesel
36
21. Voltamograma com potencial selecionado para aplicar a

quantificao
22. Cromatogramas obtidos por cromatografia em fase gasosa em
37
XVI
mtodo para aplicao em leos vegetais
38
23. Cromatograma tpico obtido por separao dos componentes A e B

por Cromatografia em Fase Gasosa
40
24. Componentes bsicos de um sistema cromatogrfico
42
25. Esquema bsico de um detector de ionizao por chama
45
26. Diagrama de Ishikawa utilizado na estimativa de incerteza da

Determinao do Ponto de Fulgor Calculado para biodiesel
56
27. Reao geral de silanizao do TBHQ com MSTFA
65
28. Esquema-resumo da metodologia proposta
68
29. Cromatograma de corrente inica total obtido no experimento

CG-EM para TBHQ comercial
75
30. Cromatograma de corrente inica total obtido no experimento

CG-EM para TBHQ comercial
76
31. Espectro de massas para pico em 9,34 minutos no cromatograma

da Figura 29
76

da Figura 29
77

da Figura 30
77

da Figura 30
77

da Figura 30
78

da Figura 30
78
37. Cromatograma obtido para amostra de biodiesel livre de

antioxidantes
79
38. Cromatograma obtido para amostra de biodiesel fortificada com

TBHQ
80
39. Cromatograma obtido para amostra de biodiesel fortificada com

BHT
80
40. Regio de cromatograma com destaque para o pico

correspondente antioxidante TBHQ, para amostra de biodiesel
com 982 mg/kg de teor de gua e 509 mg/kg de gua
84
XVII
41. Grfico de resduos obtido para TBHQ
88
42. Grfico de resduos obtido para BHT
89
43. Grfico de Durbin-Watson para TBHQ
93
44. Grfico de Durbin-Watson para BHT
93
45. Curva analtica obtida por MMQP para TBHQ
95
46. Curva analtica obtida por MMQO para BHT
96
47. Utilizao do mtodo do cruzamento das curvas de previso e analtica,

para a obteno dos limites de deteco e quantificao
97
48. Relao entre os desvios-padro das reas e a massa de

antioxidante para TBHQ
100
49. Estimativa da estabilidade
104
50. Diagrama de Ishikawa para a metodologia proposta
106
51. Relao entre a incerteza expandida e a concentrao de

antioxidante
125
52. Regresso de quarto grau entre a incerteza expandida e o valor da

concentrao de antioxidante TBHQ
126
53. Regresso de segundo grau entre a incerteza expandida e o valor

da concentrao de antioxidante BHT nas amostras utilizadas para
verificao da aplicabilidade do mtodo
127
54. Concentrao encontrada de TBHQ em amostras comerciais e suas

respectivas Estabilidades Oxidao
130
55. Concentrao encontrada de BHT em amostras comerciais e suas

respectivas Estabilidades Oxidao
130
56. Cromatogramas na regio do pico de TBHQ de amostras

Quantificadas
133
57. Cromatogramas na regio do pico de BHT de amostras

Quantificadas
133
1. INTRODUO
O biodiesel um biocombustvel produzido a partir de leos vegetais
e/ou gorduras animais. Sendo assim, existe um grande conjunto de matriasprimas que possibilitam a produo de biodiesel. Estas matrias-primas
incluem leos como de soja, caroo de algodo, palma, amendoim,
colza/canola, girassol, aafro, coco, dentre outros, alm de gorduras
(usualmente sebo bovino), bem como leos de descarte, como leos usados
em frituras1.
Por se tratar, em sua composio majoritria, de alquil steres de cidos
graxos, o biodiesel susceptvel oxidao quando exposto ao ar, e os
produtos dessa oxidao, em ltima anlise, afetam a qualidade do
combustvel. Em funo disso, a estabilidade (ou resistncia, nesse caso)
oxidao tem sido objeto de vrias pesquisas2-11. Um parmetro nas
especificaes de qualidade12-15 para a estabilidade oxidao foi includo, e o
mtodo utilizado para avaliar a estabilidade oxidao emprega o
equipamento Rancimat16.
Para garantir que o biodiesel produzido atenda aos requisitos definidos
nessas especificaes de qualidade, comumente nos processos de produo
so usados antioxidantes sintticos11. Ocorre, porm, que aps a sua
comercializao por parte da usina produtora, ou seja, aps a sua certificao
de qualidade, o biodiesel pode ficar armazenado por meses at ser misturado
ao leo diesel de origem fssil, na proporo estabelecida por legislao
vigente17-18. Durante esse perodo de armazenamento, dependendo das
condies de exposio ao ar e calor, pode haver comprometimento da
qualidade do combustvel no que diz respeito sua oxidao. Considerando
que cerca de 80 % do biodiesel nacional proveniente de leo de soja17, que
uma matria-prima que gera um biodiesel ainda mais vulnervel quanto
oxidao, e que os compostos antioxidantes sintticos possuem certa
toxicidade19, de grande utilidade a disponibilidade de metodologias analticas
confiveis que determinem teores de antioxidantes sintticos aps a produo
de biodiesel. Com essas metodologias, pode-se facilmente avaliar a
2
concentrao de antioxidante sinttico em funo do tempo de armazenamento
do produto, por exemplo.
Os laboratrios que so responsveis por certificao de biodiesel no
Brasil devem cumprir uma srie de exigncias acerca da qualidade de seus
resultados de ensaio20. Tais exigncias seguem como referncias diretivas
internacionais baseadas em normas de qualidade para laboratrios de ensaio e
calibrao21. Dentro dessas diretivas, est a devida validao de mtodos, que
ao serem propostos devem cumprir etapas especficas para serem validados.
Assim sendo, a proposio de um mtodo analtico para determinao de
antioxidantes sintticos em biodiesel, como qualquer outro mtodo a ser
utilizado em laboratrios de certificao, deve ser devidamente validado.
2. OBJETIVOS DO TRABALHO
Este trabalho tem como objetivo principal propor um mtodo de
determinao dos dois antioxidantes sintticos mais utilizados na indstria de
biodiesel no Brasil - o TBHQ (tert-butil hidroquinona) e o BHT (butil
hidroxitolueno) - e a validao intralaboratorial desse mtodo, dando um
enfoque metrolgico ao trabalho. Dentro desse objetivo principal, so propostas
as seguintes etapas:
1) Desenvolvimento de uma metodologia para identificao e
quantificao dos antioxidantes sintticos de interesse, utilizando
cromatografia em fase gasosa com deteco de ionizao por chama,
verificando condies que permitam um desempenho satisfatrio;
2) Aplicao da metodologia considerando o biodiesel comercializado no

pas e as condies tcnicas das usinas produtoras e dos laboratrios de
certificao de biodiesel;
3) Devida validao da metodologia, seguindo linhas gerais de protocolo

de validao aceitas internacionalmente, incluindo estimativa de incerteza
de medio adequada.
3.. REVISO BIBLIOGRFICA
3.1
O biodiesel
3.1.1 Produo
O biodiesel composto de alquil steres de cidos graxos, e sua

obteno resultado de uma reao qumica denominada transesterificao.
Nesta reao, leos vegetais e/ou
e
gordura animal reagem na presena de um
catalisador (usualmente uma base) com um lcool (usualmente metanol) para
produzir os alquil steres correspondentes (para o caso do metanol, os steres
metlicos) da mistura de cidos graxos que encontrada no leo vegetal ou na
gordura animal de origem. A Figura
igura 1 apresenta a reao de transesterificao.
Figura 1 Reao de transesterificao. R1, R2 e R3 representam as cadeiass de cidos graxos.
21
O lcool empregado para a produo de biodiesel geralmente o metanol (R4 = CH3) .

[Retirado de GERIS, R; DOS SANTOS, AC; AMARAL, BA; MAIA, IS; CASTRO, VD; CARVALHO, JRM.
Qumica Nova 30,5, 1369-1373

1373 (2007)
(2007 22]
Diacilgliceris e monoacilgliceris so formados como intermedirios

durante a reao de transesterificao.
transesterificao A Figura 2 demonstra qualitativamente
a relao entre converso e tempo de reao para um processo em que didi e
monoacilgliceris esto representados como intermedirios
intermedirios de reao.
Aspectos quantitativos desta figura, como a concentrao final dos vrios tipos
4
de glicerdeos e a concentrao mxima que di- e monoacilgliceris podem
atingir durante o processo, podem variar consideravelmente de reao para
reao, dependendo das condies em que ela realizada. A escala da Figura
2 tambm pode variar se a concentrao (em mol/L) dos componentes
empregada em substituio taxa de converso.
Figura 2 Grfico quantitativo de converso em uma reao progressiva de transesterificao,
indicando as concentraes relativas do leo vegetal (triacilgliceris), di- e monoacilgliceris
intermedirios, bem como steres metlicos produzidos. Detalhes mais precisos podem variar
1
de reao para reao, conforme mencionado no texto .
Vrias revises bibliogrficas relacionadas transesterificao como

processo para a produo de biodiesel j foram publicadas na literatura23-27. Da
mesma forma, a busca em otimizar a transesterificao tem sido motivo para
numerosos artigos cientficos. Geralmente, a transesterificao pode ser
realizada por catlise cida ou bsica. No entanto, em catlise homognea,
5
catalisadores alcalinos (hidrxidos de sdio e de potssio; ou os alcxidos
correspondentes)
proporcionam
processos
muito
mais
rpidos
que
catalisadores cidos28.
Em princpio, a transesterificao uma reao reversvel, embora
durante a produo de steres alqulicos de leos vegetais, isto , o biodiesel,
a reao reversa no ocorra ou seja consideravelmente negligencivel porque
o glicerol formado na reao no miscvel no produto, levando a um sistema
de duas fases. A cintica de transesterificao do leo de soja com metanol foi
definida como de pseudoprimeira ordem ou de segunda ordem29. No entanto,
dados cinticos divulgados foram investigados e diferenas importantes foram
identificadas. A cintica de reao do metanol com leo de girassol, por
exemplo, a uma razo molar metanol: leo de 3:1 foi demonstrada como de
segunda ordem no incio da reao, mas a velocidade da reao decresceu
medida que o glicerol foi sendo gerado no meio reacional30. Foi demonstrado
que a reao imediata (reao em que todas as trs posies do triacilglicerol
reagem virtualmente ao mesmo tempo para fornecer trs molculas de steres
alqulicos e uma de glicerol) originalmente proposta29 como parte da reao
improvvel, que a cintica de segunda ordem no foi seguida, e que o
fenmeno de miscibilidade tem uma importncia significativa no processo31. O
motivo que o leo vegetal de origem e o metanol so muito miscveis. O
fenmeno da miscibilidade resulta em uma fase acelerada na formao dos
steres metlicos, como indicado quantitativamente na Figura 2. A formao de
glicerol a partir dos triacilgliceris procede por etapas atravs dos di- e
monoacilgliceris, com uma molcula do alquil ster de cido graxo sendo
formada em cada etapa. A partir da observao de que diacilgliceris atingem
sua concentrao mxima anteriormente aos monoacilgliceris, foi deduzido
que a ltima etapa, correspondente formao de glicerol a partir dos
monoacilgliceris, procedida mais rapidamente do que a formao de glicerol
a partir dos diacilgliceris32.
A qumica descrita fornece os alicerces para a produo industrial de
biodiesel. Por outro lado, o processamento e a qualidade do biodiesel esto
fortemente relacionados. Os processos utilizados para refinar as matriasprimas e convert-las em biodiesel determinam se o combustvel ir atender s
especificaes tcnicas necessrias. A Figura 3 apresenta um diagrama
6
esquemtico do processo envolvido na produo de biodiesel a partir de
matrias-primas contendo um baixo teor de cidos graxos livres. Estas incluem
leo de soja, canola (colza) e alguns tipos de leos de fritura oriundos de
restaurantes e atividades afins. O lcool, o catalisador e o leo so combinados
em um reator e agitados por aproximadamente 1 h a 60 C. Plantas de
pequeno porte geralmente utilizam reatores de batelada33, mas a maioria das
plantas de grande porte (acima de 4 milhes de litros / ano) utiliza processos
de fluxo contnuo envolvendo RCLA (Reatores Contnuos de Leito Agitado) ou
reatores de fluxo pistonado (plug flow). A reao muitas vezes efetuada em
duas etapas em que aproximadamente 80 % do lcool e do catalisador so
adicionados no primeiro estgio RCLA. Depois, o produto derivado deste reator
passa por um processo de remoo do glicerol formado na reao, antes de
dar entrada no segundo reator RCLA. Os 20 % remanescentes de lcool e
catalisador so adicionados nesse segundo reator. Este sistema d condies
de se atingir uma reao completa com o potencial de poder empregar menos
lcool que os processos realizados em uma nica etapa1.
1
Figura 3 Fluxograma esquemtico do processo empregado para a produo de biodiesel .
7
Aps a reao, o glicerol quase totalmente removido dos steres
metlicos. Devido baixa solubilidade do glicerol na fase ster, esta separao
geralmente ocorre com rapidez e pode ser obtida em decantadores ou pelo
emprego de uma centrfuga. O excesso de metanol tende a se comportar como
solvente e pode diminuir a eficincia da separao. No entanto, este excesso
de metanol no geralmente removido do meio, devido possibilidade de
reverso da reao de transesterificao. gua tambm pode ser agregada ao
meio reacional depois que a transesterificao est completa para melhorar a
separao do glicerol33-34.
Observando a Figura 3, aps a etapa de separao do glicerol, os
steres metlicos sofrem uma etapa de neutralizao e passam ento por um
seqestrador de metanol, geralmente um processo de separao a vcuo ou
um evaporador de filme lquido descendente (falling film), antes mesmo da
etapa de lavagem aquosa. O cido adicionado ao produto para neutralizar
qualquer catalisador residual e quebrar qualquer quantidade de sabo que
tenha se formado durante a reao. Sabes reagiro com o cido para formar
sais solveis em gua e cidos graxos livres, de acordo com a seguinte
equao:
R-COONa
Sabo de sdio
HA
cido
R-COOH
cido graxo
NaA
Sal
Os sais sero removidos durante a etapa de lavagem aquosa e os

cidos graxos livres permanecero no biodiesel. A etapa de lavagem aquosa
tem o objetivo de remover qualquer quantidade residual de catalisador, sabes,
sais, metanol ou glicerol livre do produto final. A neutralizao antes da
lavagem aquosa reduz a quantidade de gua necessria para o processo e
minimiza a tendncia formao de emulses, quando a gua de lavagem
adicionada ao biodiesel. Aps o processo de lavagem, qualquer gua residual
removida do biodiesel por um processo de evaporao a vcuo.
A fase glicernica que deixa o decantador, geralmente, contm apenas
50 % de glicerol. Esta fase tambm contm algum metanol excedente e a
maior parte do catalisador e sabes formados no processo. Nesta forma, o
glicerol tem baixo valor de mercado e sua disposio pode ser relativamente
8
difcil. O seu contedo em metanol o classifica como um efluente txico e
perigoso. A primeira etapa no refino do glicerol usualmente orientada
adio de cido para quebrar os sabes em cidos graxos livres e sais. Os
cidos graxos livres no so solveis no glicerol e vo flotar superfcie da
mistura, de onde podem ser removidos e reciclados. Tais cidos podem ser
reaproveitados no processo atravs de uma esterificao35. Os sais que
permanecem no glicerol podem ento precipitar da soluo, apesar de tal fato
depender fortemente
da
composio
qumica
do
meio.
Uma
opo
freqentemente considerada para o processo a utilizao de hidrxido de

potssio como catalisador da reao e cido fosfrico para a etapa de
neutralizao, de forma que o sal formado seja o fosfato de potssio, que pode
ser utilizado como fertilizante. Aps acidificao e separao dos cidos graxos
livres, o metanol presente no glicerol removido por evaporao a vcuo, ou
outro tipo de evaporao. Nesta etapa, o glicerol deve apresentar uma pureza
de aproximadamente 85 % e pode ser tipicamente vendido para uma unidade
de refino. O processo de refino do glicerol eleva a sua pureza a 99,5-99,7 %,
empregando processos de destilao a vcuo ou de troca inica1.
O metanol, que removido dos steres metlicos e do glicerol, apresenta
a tendncia de absorver a gua que possa ter sido formada no processo. Esta
gua dever ser removida em uma coluna de destilao antes que o metanol
possa ser retornado ao processo. Esta etapa mais complicada se o lcool
utilizado na reao formar um azetropo com gua, como o etanol ou o
isopropanol. Neste caso, uma peneira molecular dever ser utilizada para
remover a gua.
Como mencionado anteriormente, a escolha da matria-prima de
grande relevncia para as caractersticas de um biodiesel final. Algumas
matrias-primas possuem em sua composio maior presena de cadeias
curtas (at 12 tomos de carbono), denominadas luricas, tm como exemplo
palmiste (caroo da palma), coco e babau. Outras j possuem composio
mais comum, com cadeias carbnicas predominantes com tamanho mdio
(entre 14 e 18 tomos de carbono), com insaturaes ou no. A tabela 1
apresenta de forma resumida a composio, em termos de tamanho de
cadeias carbnicas, de cidos graxos para as matrias-primas mais utilizadas
para a produo de biodiesel.
TABELA 1 COMPOSIO PERCENTUAL EM CIDOS GRAXOS PARA

ALGUMAS MATRIAS-PRIMAS*
leo/
Gordura
10:0 12:0
14:0
16:0
16:1
18:0
18:1
18:2
18:3
Soja
0,1
0,1
6-13
2-5
20-30 50-60 5-11
Milho
1-2
8-13
2-5
19-49 34-64
Algodo
0,1
0-2
20-29
1-4
13-35 40-57
0,6
Canola
4,3
1,3
59,9
21,1
13,2
Sebo (bovino)
0,1
1-5
0,9
Girassol
6-11
3-6
16-29 52-74
Palma (polpa)
0,1
1,0
42,8
4,5
30-45
9-26
0,2
Palma (caroo)
51
17
13
Coco
12
44,6
16,8
8,2
10
Babau
10
45
17
10
2,8-8 23-37
14-29 37-50
(*) C10:0 corresponde a uma cadeia de 10 tomos de carbono sem insaturaes.

C18:1 corresponde a uma cadeia de 18 tomos de carbono com uma insaturao.
Fonte: Associao Brasileira de Engenharia Automotiva
Como se pode perceber pelos dados da Tabela 1, a variao entre as

composies de matrias-primas grande, resultando tambm numa grande
diferena de composio entre os tipos de biodiesel que podem ser produzidos.
Aqueles que possuem uma composio mais saturada (exemplo da palma e do
sebo, ricos em C16:0 e C18:0), tendem a apresentar propriedades benficas
estabilidade oxidao, porm problemas de congelamento em temperaturas
mais baixas. Aqueles que possuem uma composio mais insaturada (exemplo
da soja e da canola, ricas em C18:1 e C18:2), tendem a no terem problemas
com baixas temperaturas, mas so mais vulnerveis oxidao. Mais adiante
o assunto da oxidao do biodiesel ser tratado com mais detalhes.
3.1.2 Controle de qualidade do biodiesel

O principal critrio para a qualidade do biodiesel o atendimento a um
padro apropriado. Geralmente, a qualidade do combustvel pode ser
influenciada por diversos fatores, incluindo a qualidade da matria-prima, a
10
composio em cidos graxos do leo vegetal ou gordura animal de origem, o
processo produtivo, o emprego de outros materiais no processo e parmetros
posteriores produo.
Quando as especificaes so atendidas, o biodiesel pode ser utilizado
na maioria dos motores a diesel modernos, sem neles exigir qualquer
modificao, e sem oferecer comprometimento da durabilidade e da
confiabilidade do motor. Mesmo quando utilizado em mistura com diesel de
petrleo, o biodiesel deve atender s especificaes, independentemente dos
teores empregados. Enquanto algumas propriedades das especificaes, como
nmero de cetano e densidade, refletem as propriedades das substncias que
compem o biodiesel, outras propriedades fornecem uma indicao da
qualidade obtida no proecesso de produo, como teor de ster e glicerdeos.
A Tabela 2 lista os parmetros de qualidade previstos na especificao
brasileira14 e de que forma cada parmetro est relacionado com a qualidade
do biodiesel, tomando como base possveis danos ao consumidor, motores e
ao meio ambiente quando do no-atendimento s especificaes15,36.
TABELA 2 PARMETROS DE QUALIDADE PARA O BIODIESEL
Parmetro
Aspecto
Massa especfica a
20 C
Danos ao consumidor e aos

motores
Indica a uniformidade do
combustvel, bem como a
iseno de impurezas grosseiras
geradas no processo produtivo
ou contaminao e/ou
degradao quando estocado por
longos perodos. Tais impurezas
ou contaminao podem levar ao
entupimento precoce de filtros.
Valores de densidade
divergentes daqueles da
especificao levam a uma
significativa variao na massa
de combustvel injetada, o que
dificulta a obteno de uma
mistura ar/combustvel
balanceada, podendo levar o
motor a perder potncia e
aumentar o consumo de
combustvel, em caso de uma
mistura rica e formao de
depsitos no caso de uma
mistura pobre.
Danos ao Meio
Ambiente
Mau funcionamento
dos bicos injetores,
formao de
depsitos ricos em
carbono na cmara
de combusto e
aumento das
emisses.
Aumento das
emisses de gases
poluentes e
particulados no meio
ambiente.
11
TABELA 2 PARMETROS DE QUALIDADE PARA O BIODIESEL (continuao)
Parmetro
Viscosidade
Cinemtica a 40 C

motores
Valores de viscosidade fora da
faixa especificada podem levar a
perda de potncia, alm de
serem inadequados aos
tamanhos e ao tipo dos sistemas
de injeo dos motores.
Teores de gua acima do

previsto na especificao podem
causar crescimento
microbiolgico durante o
armazenamento, antes e depois
Teor de gua
da mistura com leo diesel,
causando entupimento de filtros,
aumento da acidez (por reaes
de hidrlise) e conseqente
corroso s partes do motor.
Indica o potencial do combustvel
em formar partculas insolveis,
inicialmente invisveis. Valores
acima da especificao
configuram um produto com
Contaminao Total
grande tendncia de formao de
partculas insolveis, ou
presena de sabes e
sedimentos, gerando
entupimento de filtros.
Essa caracterstica um
importante indicativo de
segurana ao consumidor no que
Ponto de Fulgor
tange ao manuseio,
armazenamento e transporte.
Teor de ster
Indica a pureza do biodiesel,

acusando presena de outras
substncias que no so steres
alqulicos. Teores acima do
especificado dessas substncias
podem causar aumento da
acidez do produto, corroso,
queimas incompletas e formao
de depsitos, causando tambm
entupimento de filtros.
Danos ao Meio
Ambiente
Aumento das
emisses de gases
poluentes e
particulados no meio
ambiente.
Mau funcionamento
aumento da
formao de
depsitos de
carbono e,
conseqente
aumento das
emisses.
Mau funcionamento
aumento da
formao de
depsitos de
carbono e,
conseqente
aumento das
emisses.
No se aplica.
Mau funcionamento
aumento da
formao de
depsitos de
carbono e,
conseqente
aumento das
emisses.
12
Parmetro
Cinzas Sulfatadas
Enxofre Total
Sdio + Potssio

motores
Teores de cinzas elevados
indicam presena de abrasivos
slidos, sabes e catalisadores
remanescentes. Essas
substncias podem promover
desgaste no sistema de injeo e
em outras partes do motor, alm
de formao de depsitos.
Teores elevados de enxofre no

combustvel podem comprometer
o desempenho do sistema de
controle de emisses dos
motores.
Teores acima da especificao

indicam presena de abrasivos
slidos, sabes e catalisadores
remanescentes do processo de
produo. Essas substncias
podem promover desgaste no
sistema de injeo e em outras
partes do motor, alm de
formao de depsitos.
Clcio + Magnsio
Teores acima da especificao

indicam presena de sabes
responsveis pelo travamento da
bomba de injeo. Tambm
podem causar os mesmos danos
citados para sdio + potssio.
Fsforo
Alta concentrao de fsforo

pode comprometer conversores
catalticos usados em sistemas
de controle de emisses.
Danos ao Meio
Ambiente
Mau funcionamento
aumento da
formao de
depsitos de
carbono e,
conseqente
aumento das
emisses.
As emisses ricas
em enxofre
contaminam a
atmosfera
contribuindo com
chuvas cidas.
Mau funcionamento
aumento da
formao de
depsitos de
carbono e,
conseqente
aumento das
emisses.
Mau funcionamento
aumento da
formao de
depsitos de
carbono e,
conseqente
aumento das
emisses.
Descontrole dos
sistemas de injeo,
gerando aumento
significativo das
emisses.
13

motores
de corroso quando em contato
com peas de cobre ou ligas
contendo cobre presentes no
Corrosividade ao
motor. Em caso de valor fora de
cobre
especificao, o produto ser
muito cido, gerando desgaste
prematuro dos componentes do
motor, e aumento do consumo de
combustvel.
em entupir filtros a baixas
temperaturas. Valores altos
Ponto de
podem acarretar em solidificao
entupimento de filtro
do produto no tanque,
a frio
comprometendo todo o
funcionamento do motor.
Parmetro
ndice de acidez
Glicerol livre
Glicerol Total,
Monoacilgliceris,
Diacilgliceris e
Triacilgliceris
Determina o nvel de cidos

graxos livres presentes no
biodiesel, formados durante a
produo. ndices altos podem
acarretar em corroso de partes
do motor e formao de
depsitos.
Altos nveis de glicerina livre

podem causar formao de
depsitos no injetor, obstruo do
sistema e acmulo de glicerina
no fundo do tanque.
Valores acima da especificao

indicam que o produto pode
causar formao de depsitos
nos injetores, levar a problemas
de operao no motor em dias
frios e provocar entupimento de
filtros.
Danos ao Meio
Ambiente
Mau funcionamento
de vrias partes do
motor, causando
aumento significativo
das emisses.
No se aplica.
Mau funcionamento
de vrias partes do
motor, causando
aumento significativo
das emisses.
Mau funcionamento
aumento da
formao de
depsitos de
carbono e,
conseqente
aumento das
emisses.
Mau funcionamento
aumento da
formao de
depsitos de
carbono e,
conseqente
aumento das
emisses.
14
Parmetro
Metanol ou Etanol
Estabilidade
Oxidao a 110 C

motores
Essa caracterstica est
diretamente relacionada ao ponto
de fulgor, sendo indicativa de
segurana no manuseio,
armazenamento e transporte. O
metanol presente no biodiesel
remanescente da reao de
transesterificao.
Indica o grau de oxidao do
produto, bem como sua
resistncia em oxidar-se.
Produtos resultantes da oxidao
do biodiesel formam vrios
polmeros cidos, que, por sua
vez, causam depsitos no
sistema, obstruo e falhas.
Danos ao Meio
Ambiente
O metanol uma
substncia
extremamente txica
ao corpo humano.
Mau funcionamento
aumento da
formao de
depsitos de
carbono e,
conseqente
aumento das
emisses.
Dentre os parmetros de qualidade citados, pode-se observar que

dependendo do pas, h a exigncia de determinado parmetro e em outro,
no. Ou at mesmo o parmetro ser exigido em diferentes pases, mas com
limites exigidos diferentes. A Tabela 3 apresenta um comparativo entre trs
especificaes, a brasileira14, a americana, descrita na norma ASTM (American
Society for Testing and Materials) D675115, e europia13. Observando os dados
da Tabela 3, verifica-se que a especificao brasileira mais prxima da
europia. Isso favorece possveis exportaes do biodiesel nacional. A
especificao europia a de referncia mundial, visto que mercados
asiticos, africanos e sul-americanos a tm como base para suas
especificaes nacionais. Alm disso, o biodiesel possui um maior tempo de
uso na Europa, quando comparado aos outros continentes. Porm, a
especificao americana tambm relevante, haja vista o forte empenho da
ASTM no aperfeioamento contnuo dos mtodos de anlise e nas prprias
especificaes, com intuito de satisfazer as necessidades do mercado
americano, com suas peculiaridades de clima e logstica. A especificao
europia de certa forma limita a obteno de biodiesel de matrias-primas
diversificadas, de fato favorecendo a produo a partir de leo de canola.
15
TABELA 3 ESPECIFICAES DO BIODIESEL
Parmetros
Brasil
E.U.A.
Europa
Aspecto
LII*
Massa Especfica a 15 C, kg/m3
Massa Especfica a 20 C, kg/m3
850-900
Viscosidade Cinemtica a 40 C, mm2/s
3,0-6,0
Ponto de Fulgor, C, mn.
100
93
101
gua, mg/kg, mx.
350/200**
500
gua e sedimentos, %vol., mx.
0,05
Contaminao Total, mg/kg, mx.
24
24
Cinzas Sulfatadas, %massa, mx.
0,02
0,02
0,02
Enxofre, mg/kg, mx.
10
15
10
Corrosividade ao Cobre (3h a 50 C), mx.
Ponto de Entupimento de filtro a frio, C, mx.
Regional
Nmero de Cetano, mn.
Anotar
47
51
360
0,3
Resduo de Carbono, % massa, mx.
0,05
0,05
ndice de Acidez, mgKOH/g, mx.
0,50
0,50
0,50
ndice de Iodo, g/100g, mx.
Anotar
120
Metanol e/ou Etanol***, %massa, mx.
0,20
0,20
0,20
Glicerol livre, %massa, mx.
0,02
0,02
0,02
Glicerol Total, %massa, mx.
0,25
0,24
0,25
Monoacilglicerol, %massa, mx.
0,80
0,80
Diacilglicerol, %massa, mx.
0,20
0,20
Triacilglicerol, %massa, mx.
0,20
0,20
Sdio + Potssio, mg/kg, mx.
Clcio + Magnsio, mg/kg, mx.
Fsforo, mg/kg, mx.
10
10
Destilao a presso reduzida, 90 %

recuperados, C, mx.
Resduo de Carbono dos 10 % destilados,
%massa, mx.
1,96,0
860900
3,5-5,0
16
TABELA 3 ESPECIFICAES DO BIODIESEL (continuao)
Parmetros
Brasil
E.U.A.
Europa
Estabilidade Oxidao a 110 C, h, mn.
Teor de ster, % massa, mn.
96,5
96,5
12
ster metlico de cido linolnico, % massa,

mx.
steres metlicos poliinsaturados, % massa,
mx.
(*) Lmpido e Isento de Impurezas.
(**) A especificao brasileira atual prev o valor limite para teor de gua de 350 mg/kg at 1
14
de janeiro de 2014, quando ento o limte ser reduzido para 200 mg/kg .
14
(***) Apenas a especificao brasileira prev a determinao de Etanol .
Isso claramente verificado nos parmetros ndice de Iodo e ster

metlico de cido linolnico, onde muitas matrias-primas no disponibilizariam
um produto que atendesse a totalidade da especificao. Talvez esse fato
aponte para uma poltica de interesses de determinado segmento de
agricultores
europeus,
alm
de
possvel
medida
protecionista,
pois
determinados mercados (asitico e sul-americano, por exemplo) poderiam

exportar para a Europa biodiesel a preo competitivo, aproveitando a
diversidade de matrias-primas disponveis.
3.1.3 Histrico do biodiesel no Brasil

Em 02 de julho de 2003, a Presidncia da Repblica instituiu por meio
de Decreto um Grupo de Trabalho Interministerial encarregado de apresentar
estudos sobre a viabilidade de utilizao de biodiesel como fonte alternativa de
energia. O resultado foi um relatrio que deu embasamento para o
estabelecimento do PNPB (Programa Nacional de Produo de Biodiesel)
como ao estratgica e prioritria para o Brasil. Tambm por meio de Decreto,
o PNPB foi institudo em 23 de dezembro de 2003. A estrutura gestora do
Programa
ficou
definida
com
instituio
da
Comisso
Executiva
Interministerial, possuindo, como unidade executiva, um Grupo Gestor. Foi

aprovado pela CEIB (Comisso Executiva Interministerial de Biodiesel), em 31
17
de maro de 2004, o plano de trabalho que norteava as aes do PNPB. No
decorrer de 2004 as aes desenvolvidas permitiriam cumprir uma etapa
fundamental para o PNPB que culminou com o lanamento oficial pela
Presidncia da Repblica em 06 de dezembro de 2004. Na oportunidade houve
o lanamento do Marco Regulatrio que estabelece as condies legais para a
introduo do biodiesel na Matriz Energtica Brasileira de combustveis
lquidos37-38.
O biodiesel foi oficialmente introduzido na matriz energtica do Brasil
atravs da Lei n 11.097 de 200537, sendo fixado o percentual mnimo
obrigatrio de adio de biodiesel ao leo diesel comercializado ao consumidor
final, em qualquer parte do territrio nacional. Nessa lei, foi concedido ainda um
prazo de oito anos para a efetiva aplicao desse percentual mnimo. Porm,
tal percentual j praticado desde 1 de janeiro de 201018, devido
capacidade produtiva do pas j satisfazer o volume necessrio para a prtica
do percentual de 5 %. A lei citada tambm atribuiu ANP (Agncia Nacional do
Petrleo, Gs Natural e Biocombustveis) a incumbncia de se regular o
mercado do biodiesel, assim como de qualquer biocombustvel. A regulao
prevista na lei inclui: a implementao da poltica energtica nacional; a
fiscalizao das atividades integrantes da indstria do biodiesel; o cumprimento
das boas prticas de conservao e uso racional do biodiesel; a autorizao de
atividades relacionadas produo, importao, exportao, armazenagem,
estocagem,
distribuio,
revenda
comercializao
de
biodiesel;
especificao da qualidade e a organizao e manuteno das informaes e

dados tcnicos relativos s atividades reguladas38.
Quando do lanamento do PNPB, as perspectivas eram animadoras
devido ao potencial da explorao de matrias-primas que o pas apresentava,
observado nos dados levantados at ento. Muito foi especulado da produo
de biodiesel a partir de leo de mamona, devido ao potencial de produo que
particularmente as regies Norte / Nordeste apresentaram; tais regies tambm
poderiam produzir grandes quantidades de Palma e Babau, disponveis para a
obteno de biodiesel (regionalizao). Alm disso, eram claros os princpios
do Marco Regulatrio que privilegiavam polticas de incluso social, como o
selo social, no qual o produtor poderia ter acesso a incentivos fiscais desde
que comprovasse que obtinha um percentual mnimo de matria-prima
18
proveniente de agricultores familiares39, e tambm de facilidades de
Financiamentos40. A Figura 4 apresenta um mapa que evidencia a inteno do
governo brasileiro, de na poca, explorar ao mximo as caractersticas
produtivas de cada regio38. Com o intuito de se estabelecer um controle maior
do mercado, a aquisio de biodiesel comeou a ser feita exclusivamente na
forma de leiles, promovidos pela ANP41.
Figura 4 Mapa evidenciando a estratgia inicial do governo de explorar o potencial de
matria-prima para produo de biodiesel por regio.
A Figura 5 apresenta um esquema de como funciona a cadeia do

biodiesel no Brasil. Na prtica, o biodiesel produzido de responsabilidade do
prprio produtor e este deve garantir que o produto atenda todas as exigncias
da especificao (produto certificado). Aps produzido e certificado, o
transporte do produto de responsabilidade da adquirente do biodiesel no
leilo da ANP. O produto ento armazenado, muitas vezes misturado com
19
biodiesel de outra procedncia, at ser adicionado ao leo diesel de origem
fssil na proporo estabelecida e disponibilizado ao posto revendedor, ou ao
grande consumidor (hospitais, centrais eltricas, indstrias ou frotas cativas de
transporte).
At fins de 2005, havia apenas oito produtores de biodiesel autorizados
pela ANP, totalizando uma capacidade de produo nominal de 85.320 m3 por
ano42. No fim de 2011, foram registrados sessenta e nove produtores
autorizados, totalizando uma capacidade de produo nominal de 6.770.900 m3
por ano. Porm, apenas aproximadamente 40 % dessa capacidade foi de fato
produzida em 2011, indicando que existe uma capacidade ociosa de produo
por parte das usinas. A Figura 6 apresenta grfico que ilustra a evoluo da
capacidade de produo de biodiesel no pas de 2005 a 201343.
Figura 5 Cadeia de produo e distribuio de biodiesel no Brasil.
J a Figura 7 apresenta mapa da estrutura da produo de biodiesel no

Brasil no fim de 2011. Observa-se que muitas usinas produtoras encontram-se
distribudas na regio Centro-Oeste, isso devido ao grane celeiro de produo
de soja que a regio apresenta. A localizao dos produtores est relacionada
justamente
com
facilidade
de
obteno
da
matria-prima,
20
representatividade dessa matria-prima para a produo de biodiesel. A Figura
8 apresenta grfico que apresenta a evoluo da participao de cada matriaprima na obteno de biodiesel43. Verifica-se que a soja a matria-prima
consideravelmente mais representativa do mercado de biodiesel brasileiro, e
tambm pode-se notar que a diversidade de matrias-primas prevista no incio
do PNPB no foi alcanada.
Figura 6 Evoluo da capacidade de produo de biodiesel no Brasil.
Figura 7 Infraestrutura da produo de Biodiesel no Brasil 2011.
21
Figura 8 Evoluo das matrias primas utilizadas para a produo de biodiesel.
A Figura 9 apresenta foto de uma planta produtora de biodiesel

autorizada pela ANP, no municpio de Veranpolis/RS.
Figura 9 Planta de usina produtora de biodiesel.
A segunda matria-prima em representatividade, segundo dados do

grfico da Figura 8 a gordura animal (no caso, sebo bovino). Tal matriaprima comeou a ganhar destaque em 2008, devido principalmente ao preo,
pois o leo de soja considerado uma commodity internacional, e que na
segunda metade da ltima dcada apresentou elevaes de preo, o que
22
desfavorece o seu uso na produo de biodiesel. Uma maior participao da
gordura animal complexa, devido ao problema do biodiesel gerado pelo sebo,
que apresenta cadeias com maior grau de saturao (Tabela 1) e,
conseqentemente, problemas de congelamento em temperaturas menores
que 15 C44.
Considerando o que j foi abordado quanto especificao e
caractersticas do biodiesel, alguns imprevistos na implantao do PNPB nos
ltimos anos foram detectados, apesar do aumento do percentual da mistura
com leo diesel (de 0 % a 5 % em aproximadamente quatro anos). Dentre
esses imprevistos, destacam-se os seguintes:
a) Inviabilidade da produo do biodiesel a partir de leo de mamona.
Uma das grandes apostas do PNPB, era o uso do leo de mamona,
principalmente na Regio Nordeste, onde o solo favorvel para
esta cultura por parte de pequenos agricultores. Porm, a
composio majoritria deste biodiesel de ster ricinolico, que
contm um radical hidroxila em sua cadeia (Figura 10). Esse radical
confere uma massa especfica mdia acima de 900 kg/m3 e uma
viscosidade mdia acima de 12 cSt, portanto no atendendo as
especificaes internacionais (Tabela 3).
b) Problemas logsticos e de qualidade acerca do biodiesel produzido.
Tais problemas, que passam por congelamento de produto obtido a
partir de gordura animal nas bases de distribuio, teores de gua
acima do especificado gerando proliferao de microrganismos e
massas insolveis nos tanques e bombas de abastecimento, levaram
os agentes econmicos, juntamente com a ANP, a reverem prticas
de manuseio e armazenamento do biodiesel, resultando em uma
norma tcnica de boas prticas45 e em uma cartilha por parte da
ANP46. Tais problemas tambm foram vivenciados na Europa e nos
Estados Unidos47-49.
c) A insero compulsria do leo diesel de baixo teor de enxofre na
matriz energtica nacional. Devido a questes ambientais e de
tendncia mundial, o leo diesel brasileiro nos ltimos anos vem
sofrendo mudanas rgidas na sua especificao quanto ao teor de
enxofre50. Os processos de refino para a obteno do leo diesel que
23
atenda esses novos limites de especificao resultam no chamado
leo diesel S10 (teor mximo de enxofre de 10 mg/kg), que possui
uma grande sensibilidade ao teor de gua presente no biodiesel,
tolerando no mximo um teor de gua de 200 mg/kg51. Isso em tese
obriga o mercado de biodiesel a fazer investimentos ainda mais
significativos no processo, a fim de produzir um biodiesel com teores
de gua ainda mais baixos que aqueles at ento praticados.
d) A praticamente exclusividade do uso do leo de soja, aliados aos
investimentos contnuos necessrios produo do biodiesel com
parmetros de qualidade exigentes levaram o biodiesel a ser
produzido, em sua maior parte, por grandes empresas exportadoras
de produtos oriundos da soja, com grande capacidade de
investimento. Tal observao vai de encontro a um dos objetivos
iniciais do PNPB, que previa parcela significativa do plantio das
matrias-primas
sendo
realizado
por
pequenos
agricultores,
favorecendo projetos de incluso social.

e) A produo cientfica visando disponibilizao de matrias-primas
de fato vantajosas economicamente, e que no tenham utilidade
alimentar, tem sido um desafio acadmico, sem de fato em seis anos
ter levado a uma contribuio significativa para o mercado. O uso de
matrias-primas diferentes da soja e sebo bovino tem esbarrado na
competio alimentar (casos de palma e girassol), que apresentam
preos mais vantajosos para tal fim que para a indstria do biodiesel,
ou no no atendimento s especificaes (casos de pinho e leo de
fritura usado), ou mesmo nas baixas produtividades (casos de uma
gama de variedade de oleaginosas)52. Esse cenrio no tem
permitido o uso de uma grande variedade de matrias-primas, como
previsto pelo PNPB inicialmente.
f) O uso do etanol, que estava previsto como uma das possveis
peculiaridades que o mercado brasileiro apresentaria, no foi de fato
implementado, devido pouca disponibilizao do produto no
mercado e ao preo. Para os produtores, ainda mais vantajosa a
importao do metanol que o uso do etanol para a produo de
24
biodiesel. Dos 69 produtores autorizados pela ANP no fim de 2011,
apenas 3 (4 %) afirmaram que utilizaram etanol em algum lote43.
Figura 10 Ricinoleato de metila, constituinte majoritrio do biodiesel de mamona.
Diante dos problemas expostos, mesmo com o pas contando com uma
capacidade nominal de produo que permitiria at o uso obrigatrio de uma
mistura com at 12 % de biodiesel no leo diesel de origem fssil, as
perspectivas para um aumento do teor da mistura soam como um desafio
tcnico para o pas. O cenrio atual tem convergido para o fim dos leiles da
ANP, uma vez que o mercado j est estabelecido, e os agentes econmicos
tm mostrado capacidade de negociar preos diretamente com os produtores,
e estes tm evidenciado competncia tcnica e capacidade de investimentos
para garantir o suprimento da demanda de biodiesel com a qualidade
requerida. Talvez a mudana de rumos do PNPB, diferentes de alguns
traados originalmente, seja apropriada para o momento que o mercado de
biodiesel brasileiro se encontra.
3.1.4 O processo de oxidao do biodiesel

O biodiesel susceptvel oxidao quando exposto ao ar e o produto
de sua oxidao, em ltima anlise, afeta a qualidade do combustvel. Em
funo disso, a estabilidade oxidao tem sido objeto de inmeras
pesquisas2-11. Um parmetro de especificao para a estabilidade oxidao
foi includo nas especificaes europias de biodiesel, EN (Europeenne
Norme)14213 e EN 1421412-13. O mtodo utilizado para avaliar a estabilidade
oxidao emprega o equipamento Rancimat16. A Figura 11 apresenta fotografia
do equipamento correspondente.
25
As razes para a oxidao do biodiesel esto relacionadas presena
de ligaes duplas nas cadeias de vrias substncias graxas. A oxidao de
substncias graxas insaturadas procede a diferentes velocidades, dependendo
do nmero e da posio das ligaes duplas53. As posies CH2- alqulicas, em
relao s duplas ligaes presentes nas cadeias dos cidos graxos, so
aquelas efetivamente susceptveis oxidao. As posies bis-allicas em
cidos graxos poliinsaturados de ocorrncia natural, tais como os cidos
linolico (duplas ligaes em 9 e 10, gerando uma posio bis-allica em C11) e linolnico (duplas ligaes em 9, 12 e 15, gerando duas posies bisallicas em C-11 e C-14) so ainda mais susceptveis oxidao que as
posies meramente allicas. As velocidades relativas de oxidao fornecidas
na literatura53 correspondem a 1 para oleatos (steres metlicos e etlicos), 41
para linoleatos, e 98 para linolenatos. Esta uma propriedade essencial,
porque a maioria dos diferentes tipos de biodiesel contm quantidades
significativas dos steres dos cidos graxos olico, linolico e linolnico que,
por sua vez, podem influenciar a estabilidade oxidativa dos combustveis. As
espcies formadas durante o processo de oxidao causam a deteriorao
eventual do combustvel. Pequenas quantidades de componentes graxos de
maior grau de insaturao tm um efeito forte, porm, diferenciado, sobre os
resultados de estabilidade oxidao, obtidos por mtodo IEO (Induced
Electron Oxidation)10.
Inicialmente, hidroperxidos so formados durante a oxidao, gerando
aldedos, cidos e outros compostos oxigenados como produtos do processo
de oxidao em cadeia53. Entretanto, duplas ligaes tambm podem ser
orientadas a reaes de polimerizao que levam a produtos de maior massa
molar e, eventualmente, a um aumento da viscosidade do combustvel. Dentre
tais produtos podem ser formadas espcies insolveis no combustvel, que
podero entupir linhas e bombas de combustvel devido ao tamanho das
partculas. Um estudo54 demonstrou que os polmeros formados durante o
armazenamento do biodiesel sob condies controladas so, devido sua
natureza polar, solveis no biodiesel, e insolveis em misturas de biodiesel
com leo diesel mineral, por este ltimo ser basicamente constitudo de
hidrocarbonetos.
26
A questo da estabilidade oxidao afeta a qualidade do biodiesel
principalmente em decorrncia de longos perodos de armazenamento. A
influncia de parmetros, como a presena de ar, calor, traos de metais,
antioxidantes
perxidos,
bem
como
natureza
armazenamento, foram investigadas em vrios estudos
do
tanque
de
6-11
. Resumindo as
descobertas at ento obtidas, a presena de ar, luz, ou de metais bem como

de temperaturas elevadas, facilitam o processo de oxidao. Estudos
realizados com mtodos IEO automatizados confirmam o efeito catalisador de
metais sobre a oxidao; no entanto, a influncia da estrutura dos steres
graxos, especialmente o grau de insaturao, foi ainda mais importante10.
Vrios outros mtodos, incluindo alguns de via mida como o ndice de acidez
(IA), o ndice de perxidos (IP) este pode ser substitudo pelo ndice de Iodo,
que uma medio indireta do grau de insaturao do biodiesel e a P-DSC
(calorimetria diferencial de varredura sob presso) tm sido aplicados em
estudos de oxidao do biodiesel55-57.
Alm do mtodo Rancimat16 (mtodo de referncia) para a determinao
da estabilidade oxidativa do biodiesel, foi desenvolvido nos ltimos anos, no
mbito da ASTM, um mtodo alternativo, com resultados diretamente
proporcionais aos resultados do mtodo de referncia. Trata-se do RSSOT
(Rapid Small Scale Oxidation Test)58, que possibilita obter-se o resultado em
minutos, no em horas. A prpria especificao americana de biodiesel o
considera apenas como alternativo15, e em caso de divergncia, o resultado a
ser considerado deve ser aquele obtido pelo mtodo de referncia.
Dentre as matrias-primas mais utilizadas para produo de biodiesel,
nas quais o parmetro de estabilidade oxidao mais crtico, pode-se citar
soja, canola, milho, algodo e girassol com base nos dados da Tabela 1,
tomando a composio significativa de cadeias carbnicas insaturadas destas
matrias-primas59. Considerando a grande importncia da soja como matriaprima do mercado brasileiro, pode-se concluir que a estabilidade oxidao
um parmetro crtico na qualidade do biodiesel brasileiro. Na Europa, onde a
principal matria-prima a canola, alm do parmetro de estabilidade
oxidao a 110 C, especificado teor de ster linolnico (trs insaturaes na
cadeia) e teor de steres poliinsaturados, alm do ndice de Iodo. No Brasil,
apenas o parmetro de estabilidade oxidao a 110 C especificado
27
(mnimo de seis horas), considerando diretamente a tendncia do biodiesel em
oxidar-se. O ndice de Iodo deve ser apenas reportado, no tendo valor limite
especificado (Tabela 3). Nos Estados Unidos, o limite de trs horas mnimas no
mtodo Rancimat16 adotado, considerado suficiente em estudos60. A
especificao Argentina, no exposta na Tabela 3, adota um mnimo de oito
horas no mtodo Rancimat. Cabe ressaltar que o biodiesel produzido na
Argentina tem como principal destino a exportao61, logo, aquele pas adota
um limite mais rgido para sua especificao, prevendo grandes trajetos no
transporte e longos perodos de armazenamento.
Figura 11 Equipamento Rancimat.
O mtodo Rancimat baseado na medida de uma clula de

condutividade. A amostra submetida a 110 C em um fluxo constante (10 L/h)
de insero de ar atmosfrico, logo, uma oxidao forada. Aps certo
tempo, dependendo da amostra, cidos leves resultantes da oxidao so
liberados pela amostra e carregados pelo ar, sendo borbulhados em uma clula
de condutividade com gua ultrapura. A clula de condutividade fica ativa
desde o incio do ensaio, e assim que os produtos da oxidao so
borbulhados, o aumento de condutividade registrado, obtendo-se um grfico
28
da condutividade pelo tempo. A Figura 12 mostra um exemplo de grfico obtido
no ensaio. O ponto de inflexo da curva onde a segunda derivada mxima
caracteriza o tempo em que a amostra resistente oxidao, e o resultado
final do ensaio, em horas.
Figura 12 Grfico obtido no ensaio Rancimat de uma amostra de biodiesel. Em verde, a
curva condutividade x tempo. Em azul, a segunda derivada da curva. Resultado do ensaio em
10,04 horas.
A estabilidade oxidao tambm tem sido especificada nos limites

americanos para B6-B20 (combustvel composto de mistura de biodiesel com
leo diesel fssil em proporo que pode variar de 6 a 20 % de biodiesel)62.
Isso porque tem sido comprovado que mesmo em proporo menor na mistura,
o biodiesel responsvel pela estabilidade oxidao da mistura, por ser bem
menos resistente oxidao que o leo diesel fssil60. Para a medio da
Estabilidade Oxidao da mistura B6 a B20, adotado mtodo Rancimat,
porm com diferenas ao mtodo original acerca da massa de amostra e do
tubo utilizado63.
29
3.2
Antioxidantes
3.2.1 Uso de antioxidantes em biodiesel
leos vegetais usualmente contm antioxidantes de ocorrncia natural

como os tocoferis. Portanto, leos vegetais no refinados que ainda
apresentem seus teores naturais de antioxidantes naturalmente apresentam
estabilidade oxidativa superior em comparao com leos refinados2, mas no
satisfazem
maioria
das
outras
exigncias
para
uso
combustvel.
Antioxidantes naturais foram adicionados tambm ao biodiesel para avaliar os

seus respectivos comportamentos sobre a oxidao. Alm destes antioxidantes
naturais, tambm existe uma variedade de antioxidantes sintticos. Muitos
deles so fenis substitudos como o butil hidroxitolueno (BHT; 2,6-di-tert-butil4-metilfenol),
hidroquinona
butil
hidroxianisol
(TBHQ;
(BHA;
3-t-butil-4-hidroxianisol),
2-tert-butil-hidroquinona),
pirogalol
tert-butil
(1,2,3-
trihidroxibenzeno) e propil galato (PG; ster proplico do cido 3,4,5trihidroxibenzico). Alguns esto ilustrados na Figura 13. Estes antioxidantes
sintticos tambm foram investigados em relao aos seus efeitos sobre a
estabilidade do biodiesel11,64-65.
Figura 13 Alguns antioxidantes sintticos.
30
A estrutura fenlica desses compostos permite a doao de um prton a
um radical livre, regenerando, assim, a molcula do acilglicerol e interrompido o
mecanismo de oxidao por radicais livres. Dessa maneira, os derivados
fenlicos transformam-se em radicais livres. Entretanto, estes radicais podem
se estabilizar sem promover ou propagar reaes de oxidao66.
Esses antioxidantes so utilizados na indstria alimentcia, em leos e
gorduras,
para
prevenir
oxidao
lipdica.
Esta
responsvel
pelo
desenvolvimento de sabores e odores desagradveis tornando os alimentos

imprprios para consumo, alm de tambm provocar outras alteraes que iro
afetar no s a qualidade nutricional, devido degradao de vitaminas
lipossolveis e de cidos graxos essenciais, mas tambm a integridade e
segurana dos alimentos, atravs da formao de compostos potencialmente
txicos67-69.
Estudos
toxicolgicos
tm
demonstrado
possibilidade
destes
antioxidantes apresentarem efeito carcinognico em experimentos com

animais70. Em outros estudos, o BHA mostrou induzir hiperplasia gastrintestinal
em roedores por um mecanismo desconhecido; em humanos, a relevncia
dessa observao no est clara71. A reduo do nvel de hemoglobina e a
hiperplasia de clulas basais foram atribudas ao uso de TBHQ68. Por estes
motivos, o uso destes antioxidantes em alimentos limitado; TBHQ no
permitido no Canad e na Comunidade Europia19. No Brasil, o uso destes
antioxidantes controlado pelo Ministrio da Sade que limita 200 mg/kg para
BHA e TBHQ e 100 mg/kg para BHT como concentraes mximas
permitidas19.
Para o atendimento s especificaes (Tabela 3), o leo vegetal utilizado
como matria-prima do biodiesel quase sempre refinado. Esse processo
retira quase que a totalidade dos antioxidantes naturais do leo. Aliado ao
processo de transesterificao, para obteno do biodiesel, praticamente todo
o teor de antioxidantes naturais removido, sendo praticamente obrigatria a
adio de antioxidantes sintticos, quando o biodiesel obtido a partir de leo
de soja, girassol, algodo, canola ou matria-prima com grau de insaturao
semelhante72. Quando o biodiesel obtido a partir de matria-prima com menor
grau de insaturao (gordura animal, leo de palma), tem-se dispensado o uso
de antioxidantes sintticos, visto que costumam atender as especificaes no
31
momento da retirada da usina produtora pelo distribuidor. Porm, no se
encontram na literatura estudos sobre o comportamento do biodiesel deste tipo
aps longos perodos de armazenamento. Apenas existem estudos que
apontam que esse tipo de biodiesel, embora apresente melhor estabilidade, ou
seja, maior resistncia oxidao, por outro lado tem apresentado problemas
de formao de massas insolveis, devido solidificao em baixas
temperaturas e presena de contaminantes saturados, mais especificamente
monoacilgliceris saturados73-75.
Diferentes antioxidantes sintticos tm diferentes efeitos sobre o
biodiesel, dependendo do tipo de matria-prima63, sem causar alteraes em
propriedades, como viscosidade, ponto de entupimento de filtro a frio,
densidade,
dentre
outros.
Em
outro
estudo,
diferentes
antioxidantes
apresentaram pouco ou nenhum efeito quando investigados pelo mtodo AOM

(Accelarated Oxidation Method)6. O TBHQ, particularmente, tem sido apontado
por vrios estudos como o de melhor desempenho para biodiesel. Ferrari
aponta o TBHQ como de melhor desempenho em biodiesel de girassol, aps
avaliao pelo mtodo Rancimat e tambm por absoro espectrofotomtrica
de compostos resultantes da oxidao (Figura 14)76. Cavalcanti, tambm pelo
mtodo Rancimat, avaliou o desempenho de misturas de antioxidantes, nas
quais encontrou o melhor tempo de resistncia oxidao em misturas com
maior teor de TBHQ77; Dinkov avaliou vrios parmetros que so alterados
quando da oxidao do biodiesel (viscosidade, densidade, acidez, etc.) e o
efeito quando da adio dos antioxidantes, contribuindo inclusive para a
diminuio de material particulado quando da queima de misturas Bx (leo
diesel mineral com x % de biodiesel, em volume)78. Mittelbach tambm acusou
o melhor desempenho do TBHQ, comparando-o inclusive com antioxidantes
naturais79. Borsato, atravs de estudo fsico-qumico (com auxlio de diagramas
de nvel) tambm encontrou o melhor desempenho para TBHQ, comparando-o
com BHT e BHA (Figura 15)80. Hess levantou a possibilidade de que o uso de
antioxidantes sintticos poderiam vir a diminuir as emisses do tipo NOx,
emisses essas que o biodiesel apresenta em maior grau que o leo diesel
mineral (apesar que nas emisses de CO2, hidrocarbonetos, material
particulado e xidos de enxofre o leo diesel mineral apresente um grau
consideravelmente maior que o biodiesel)81.
32
Figura 14 Grfico obtido em estudo por espectrofotometria UV (Ultravioleta) - Visvel que

monitorava absortividades molares de compostos resultantes de oxidao de biodiesel de leo
de girassol, aps adio de antioxidantes sintticos.
Figura 15 Curvas de nvel utilizadas para demonstrar graficamente a eficincia do TBHQ

para a manuteno da estabilidade do biodiesel em relao ao BHA e ao BHT. O diagrama da
esquerda foi obtido aps 7 dias de experimento e o da direita, aps 15 dias.
33
Devido ao grande uso dos antioxidantes sintticos, conseqncia da
grande participao da soja para o biodiesel brasileiro43, os estudos de
estabilidade em funo de variveis no armazenamento tm aumentado, assim
como de desempenho dos antioxidantes sintticos. Sendo assim, de grande
utilidade que existam metodologias analticas confiveis que determinem teores
de antioxidantes sintticos aps a produo de biodiesel. Com estas
metodologias, facilmente pode-se avaliar a concentrao de um determinado
antioxidante sinttico em funo do tempo de armazenamento do produto, e
no somente monitorando-se produtos de oxidao do biodiesel. possvel
tambm relacionar dados de concentraes de antioxidantes em funo da
estabilidade do produto em um dado momento; Adicionalmente, torna-se vivel
analisar indiretamente a degradao do antioxidante atravs de sua
concentrao ao longo do tempo.
Como mencionado anteriormente, existem nveis mximos tolerados
destas substncias para consumo humano, e conseqentemente, o uso por
parte de uma indstria no-alimentcia no gera maiores preocupaes acerca
do controle desses compostos especificamente. Como exemplo, a indstria de
biodiesel utiliza esses produtos com o intuito de adequar o produto
especificao, logo, quando o combustvel atende os valores especificados, a
concentrao utilizada desses compostos tem uma importncia secundria, e
tal fato pode gerar impacto ambiental. Tal impacto vem de uma contaminao
do solo, possvel porque vazamentos de produto em pequenas quantidades
no so tidos como perigosos, pois trata-se de um biocombustvel.
Considerando que a maior parte das usinas produtoras se concentra em reas
rurais, de plantio de alimentos, teoricamente pode haver problemas de
contaminaes de cultivos, alm de problemas para a fauna. Considerando
tambm que as unidades de distribuio de combustvel (onde biodiesel
armazenado) so em geral prximas s grandes cidades, contaminao de
rede de guas tambm pode ser cogitada.
34
3.2.2 Metodologias desenvolvidas para determinao de

antioxidantes sintticos em biodiesel
Os mtodos para quantificao de antioxidantes sintticos em leos

vegetais foram desenvolvidos com o propsito de se monitorar a concentrao
com vistas toxicidade elevada desses compostos19. Logo, o primeiro mtodo
disponvel na literatura para quantificao dessas substncias em biodiesel
tomou por base mtodo usado em leos vegetais82-83, que consiste na
utilizao de CLAE-UV (cromatografia lquida de alta eficincia com detector de
Ultravioleta). A Figura 16 ilustra cromatogramas obtidos por este mtodo84.
Figura 16 Cromatograma ilustrado em Tagliabue et al, evidenciando a eficiente separao
dos antioxidantes sintticos em biodiesel. (1) Pirogalol; (2) Pirocatecol; (3) Propil galato; (4)
TBHQ; (5) BHT; (6) Ascorbil palmitato.
Como os estudos disponveis tm apontado o TBHQ como aquele

antioxidante de melhor desempenho no biodiesel, os mtodos desenvolvidos
35
mais recentemente foram desenvolvidos somente para TBHQ, fazendo-se uso
de tcnicas eletroqumicas, aproveitando-se da natureza do TBHQ, que
facilmente pode ser oxidado a quinona e por conseqncia gerando um sinal
de corrente quando um potencial aplicado (Figura 17). Arajo utilizou
voltametria de varredura linear em eletrodo de pasta de carbono, com auxlio
de surfactante (Figuras 18 a 20)85.
Figura 17 Reao de oxidao de hidroquinona para quinona. Com o TBHQ (Figura 13),
ocorre reao semelhante quando um potencial aplicado.
Figura 18 Voltamogramas cclicos evidenciando que o uso de surfactante melhora o sinal

eletroqumico para determinao. (a) meio tamponado em pH 6,52; (b) TBHQ na ausncia
e (c) na presena de surfactante CTAB (Cetyltrimethyammonium bromide); (d) CTAB sem
TBHQ.
Figura 19 Voltamogramas evidenciando que o CTAB o surfactante que melhor

potencializa o sinal de oxidao do TBHQ. (a) meio tamponado em pH 6,52; (b) TBHQ na
36
ausncia e (c) na presena de surfactante; (d) surfactante sem TBHQ. Da esquerda para
direita: CTAB, Triton-100 e Lauril.
Figura 20 Voltamogramas, para adio-padro na quantificao de TBHQ em biodiesel,

com o uso de surfactante CTAB. Todos os mtodos eletroqumicos propostos seguem esta
ttica de quantificao.
Tormin props metodologia amperomtrica direta, sem o uso de

surfactante, apenas selecionando eletrlito suporte mais cido, usando
37
eletrodo de carbono vtreo no-modificado e amperometria de pulso mltiplo
(Figura 21)86.
Figura 21 Voltamograma com potencial selecionado para aplicar a quantificao.
Arajo tambm testou o uso de voltametria de onda quadrada,

com bons resultados87. Tormin tambm desenvolveu mtodo utilizando
amperometria de com anlise de injeo pontual, porm com de deteco
simultnea
para
TBHQ
BHA88.
Caramit
recentemente
tambm
desenvolveu mtodo voltamtrico de deteco simultnea de TBHQ e BHA

em biodiesel, usando eletrodos de nanotubos de carbono multicamadas
modificado89.
Todas essas metodologias propostas utilizaram o mtodo CLAEUV como referncia, e em geral apresentaram valores de recuperao
muito prximos, e ligeiramente melhores em alguns casos. Assim sendo,
tem-se mostrado que o mtodo que utiliza CLAE-UV, bem similar aos
mtodos disponveis para determinao desses compostos em leos
vegetais, pode ser satisfatoriamente substitudo por outras tcnicas. As
tcnicas
eletroqumicas
demonstraram
ter
grande
potencial
para
determinao de TBHQ, porm ainda no foram testadas para outros

antioxidantes sintticos, como foi a metodologia por CLAE-UV. Existe
mtodo que utiliza cromatografia em fase gasosa com detector de ionizao
por chama90, porm foi desenvolvido para aplicao em leos vegetais e
38
no biodiesel. Nesse mtodo realizada uma extrao seguida de reao
de metilao, substituindo os grupos (-OH) por radicais metila. A extrao
realizada pelo fato de que constituintes do leo poderiam interferir na
reao de metilao dos antioxidantes sintticos. J a reao de metilao
(no caso, procedida com hidrxido de tetrametilamnio) foi escolhida pelo
autor para a retirada dos grupos (-OH), que podem causar forte interao
ente os analitos e a fase estacionria da coluna, comprometendo o formato
dos picos no cromatograma e, conseqentemente, a quantificao. A
anlise cromatogrfica foi realizada com coluna de fase estacionria polar,
e injeo splitless. A Figura 22 ilustra cromatogramas obtidos com tal
mtodo90.
Figura 22 Cromatogramas obtidos por cromatografia em fase gasosa em mtodo para
aplicao em leos vegetais. 1 BHA; 2 BHT; 3 TBHQ; 4 N-tetradecanol (solvente
dos padres utilizados). Padres puros (A) e aps extrao no leo vegetal e metilao
com hidrxido de tretrametilamnio (B).
39
3.3. Cromatografia em Fase Gasosa

3.3.1 Generalidades
A Cromatografia Gasosa um procedimento fsico utilizado para
separar-se uma amostra em seus componentes individuais. A base para esta
separao a distribuio da amostra entre duas fases uma fase
estacionria e uma fase gasosa mvel.
A fase mvel denominada de gs de arraste ou gs portador, uma vez
que trata-se de um gs inerte cuja finalidade transportar as molculas a
serem separadas, atravs da coluna.
De acordo com a natureza da fase estacionria, possvel dividir-se,
para fins didticos, a cromatografia gasosa em: cromatografia gs-lquido
(C.G.L) e cromatografia gs-slido (C.G.S).
No caso da cromatografia gs-slido, C.G.S., a fase estacionria um
slido de grande rea superficial, usualmente um adsorvente como carvo
vegetal, slica-gel, ou peneira molecular (zelita sinttica). A adsoro
diferencial dos componentes da mistura a ser separada sobre a superfcie
slida a base para a separao cromatogrfica na C.G.S. a qual ,
geralmente, empregada na separao de gases como nitrognio, oxignio,
monxido de carbono e outros.
Na cromatografia gs-lquido, a fase estacionria uma pelcula delgada
lquida, a qual recobre um slido inerte denominado suporte. A base para a
separao cromatogrfica, neste caso, a distribuio da amostra dentro e
fora desta pelcula, ou seja, a partio da amostra entre a fase mvel e a fase
lquida estacionria.
A fase estacionria encontra-se acondicionada, atravs da qual o gs de
arraste flui continuamente. As molculas da amostra iro distribuir-se ao
equilibrar-se entre o gs de arraste e a fase lquida. As espcies mais solveis
na fase lquida permanecero menos tempo no gs de arraste em movimento
e, como consequncia, iro deslocar-se mais lentamente atravs da coluna.
40
Uma fase lquida que apresente solubilidade seletiva para dois dados
compostos, estes podero ser separados por cromatografia gs-lquido, devido
diferena de solubilidade na fase lquida.
A figura 23 mostra o cromatograma correspondente separao de dois
compostos por C.G.L. O componente A, menos retido, deixa a coluna em
tempo inferior ao B (mais retido). Aps a separao, A e B podem ser
identificados e/ou quantificados.
Devido grande diversidade de fases lquidas disponveis, a
cromatografia gs-lquido torna-se a mais verstil e seletiva forma de
cromatografia em fase gasosa. Isto permite que sejam analisadas amostras
slidas, lquidas ou gasosas desde que sejam volteis ou possam vir a ser
volatilizadas de diferentes formas.
Figura 23 Cromatograma tpico obtido por separao dos componentes A e B por
Cromatografia em Fase Gasosa.
B
A
Tempo
Desta forma, prefervel a denominao cromatografia em fase gasosa uma
vez que o processo cromatogrfico ocorre em fase gasosa, independente do
estado fsico inicial da amostra91.
41
3.3.2 Instrumentao
A Figura 24 apresenta os componentes bsicos de um sistema
cromatogrfico. A seguir cada um dos componentes descrito.
Gs de Arraste
A funo do gs de arraste, ilustrado na Figura 24 no reservatrio de
gs, arrastar a amostra atravs da coluna, ou seja, agir como a fase mvel.
Deve ser inerte e no pode interagir quimicamente com a amostra. Sua
segunda funo prover uma matriz adequada para o detector diferenciar os
componentes da amostra91.
Injetor
A obteno de picos ideais em cromatografia gasosa altamente
dependente da forma de introduzir-se a amostra na coluna (injeo). Quando
do uso de colunas capilares, a injeo precisa ser realizada rapidamente e a
quantidade de amostra deve ser muito pequena, geralmente, menor que 1 g.
em uma coluna capilar tpica de 25 m, h cerca de 10 mg de fase lquida. Isso
mostra que se forem injetadas grandes quantidades de amostra, a coluna pode
ser entupida, ou ocorrer vazamentos91. Picos provenientes de colunas capilares
so muito estreitos, havendo larguras de poucos segundos, por isso, injees
rpidas so necessrias, a fim de minimizar o alargamento de banda produzido
por uma injeo lenta91.
Coluna
A coluna onde, de fato, ocorre o processo cromatogrfico, uma vez
que nela que a separao ir ocorrer. A escolha da coluna apropriada para
uma dada separao de suma importncia, e muitas vezes, difcil.
42
Entre os diferentes parmetros a serem considerados quando da
escolha da coluna, dois devem ser destacados: a fase estacionria (o suporte
slido e a fase lquida) e o tubo onde ser acondicionado (material, dimenses,
etc.). Dentre os materiais mais utilizados, destaca-se slica com poliamida, o
que permite a obteno de colunas de grande extenso compactadas em um
volume pequeno.
Colunas capilares de slica fundida so feitas de slica purificada
especialmente que contm quantidades mnimas de xidos metlicos. Esses
capilares tm paredes mais finas que as antigas colunas equivalentes em vidro.
Os tubos ganham resistncia com recobrimentos protetores de poliamidas, que
so aplicados conforme os tubos capilares esto sendo produzidos. As colunas
resultantes so bastante flexveis e podem ser enroladas como bobinas com
dimetros de alguns centmetros. Colunas capilares esto disponveis
comercialmente e oferecem vrias vantagens importantes, como resistncia
fsica, reatividade muito mais baixa com relao aos componentes da amostra
e flexibilidade. Para a maioria das aplicaes, elas substituram as colunas de
vidro antigas.
Figura 24 Componentes bsicos de um sistema cromatogrfico.
43
Forno
desejvel que a temperatura da coluna seja suficiente para que o
tempo de anlise seja curto, porm suficientemente baixa para que a eficincia
desejada seja atingida. Em geral, o tempo de reteno duplica a cada 30 C
diminuindo na temperatura da coluna (controlada pelo forno).
Para a grande maioria das amostras, quanto menor a temperatura da
coluna, maior ser a razo dos coeficientes de partio na fase estacionrio e,
como consequncia, uma melhor separao ser atingida. Deve ser lembrado,
entretanto, que em alguns casos no se obtm separao alguma com a
coluna operando a baixas temperaturas91. Em geral, a fase estacionria lquida
da coluna apresenta limites de temperatura que devem ser observados (cerca
de 350 C para as fases mais resistentes), pois alm desses limites pode haver
alterao nas propriedades da fase estacionria. Entretanto, o uso recente de
colunas de alta temperatura (HT High Temperature column) tem possibilitado
a anlise, por cromatografia gasosa, de uma srie de compostos de peso
molecular alto, at ento no analisveis por esta tcnica, chegando-se a at
450 C em algumas anlises92.
Detector
O detector ideal para cromatografia gasosa tem as seguintes
caractersticas93:
a)
Sensibilidade
adequada.
que
exatamente
significa
sensibilidade adequada no pode ser descrito em termos

quantitativos. Por exemplo, descries de sensibilidades dos
detectores diferem de um fator de 107. Apesar disso, todos
so amplamente usados e claramente adequados para
determinadas
tarefas.
Os
menos
sensveis
no
so,
entretanto, satisfatrios para certas aplicaes. Em geral, as

sensibilidades dos detectores atuais esto dentro de um
intervalo de 10-8 a 10-15 g de soluto por segundo.
b)
Boa estabilidade e reprodutibilidade.
44
c)
Uma resposta linear para solutos que se estenda por vrias

ordens de grandeza.
d)
Um
intervalo
de
temperatura
que
abranja
desde
temperatura ambiente at, pelo menos, 400 C.

e)
Uma resposta rpida, independente da vazo.
f)
Alta confiabilidade e de fcil uso. O detector deve, na medida

do possvel, funcionar bem, mesmo nas mos de operadores
inexperientes.
g)
Similaridade
na
resposta
para
todos
os
solutos
ou
alternativamente uma resposta altamente previsvel e seletiva

para uma ou mais classes de solutos.
h)
No destruir a amostra.
De fato, nenhum detector apresenta todas essas caractersticas e

parece pouco provvel que tal detector venha a ser obtido93.
Os tipos de detectores mais comuns so: detector de ionizao por
chama, de condutividade trmica, de quimioluminescncia de enxofre, de
captura de eltrons, de emisso atmica, termoinico. H ainda o uso
importante de detectores como espectrmetro de massa e o espectrmetro de
infravermelho com transformada de Fourier. Mesmo com essa diversidade de
detectores, mais de 90 % dos cromatgrafos a gs em operao no mundo so
equipados com detector de condutividade trmica, ionizao por chama ou
captura de eltrons91. A Figura 25 apresenta um esquema bsico de um
detector de ionizao por chama.
45
Figura 25 Esquema bsico de um detector de ionizao por chama. Neste caso, Ocorre a
queima de hidrognio pelo oxignio presente no ar sinttico, que gera uma chama. Compostos
orgnicos oriundos da coluna geram ons aps a combusto, que so coletados pelo eletrodo
que se encontra polarizado devido uma diferena de potencial aplicada. O fluxo desses ons
gera uma corrente, proporcional quantidade daquele composto orgnico.
Eletrodo
Fonte
Ar sinttico
H2
Gs de arraste
oriundo da coluna
Registrador
A funo do registrador imprimir, geralmente na forma de uma
gaussiana, o sinal eltrico proveniente do detector, o qual dever ser
proporcional quantidade de amostra injetada no sistema cromatogrfico.
Desta forma, o cromatograma obtido no registrador permitir uma anlise
qualitativa e / ou quantitativa da amostra em estudo.
O aparecimento dos integradores eletrnicos modernos na dcada de 70
fez com que os registradores potenciomtricos comeassem a perder terreno
para o registro de cromatogramas. Os integradores alm de representarem o
cromatograma, permitem ainda o registro dos tempos de reteno, altura do
pico e rea dos picos. A partir destes dados, torna-se fcil o clculo de
concentraes e reas relativas.
Na dcada de 80, surgiram novas opes para o registro de dados
atravs do uso de computadores pessoais. Uma interface A/D (analgica-
46
digital) permite a converso do sinal analgico do detector para digital,
linguagem prpria para o computador. Isto permite a aquisio dos dados
cromatogrficos diretamente pelo computador, sem necessidade de uso de
integradores. Adicionalmente, uma interface D/A (digital/analgica), permite ao
computador o controle de todas as funes do cromatgrafo, transformando o
computador em uma ferramenta muito mais verstil do que o registrador ou
integrador91.
3.3.3 Mtodos de derivatizao
O termo derivatizao, refere-se, em cromatografia, transformao de

um composto qumico em outro, de fcil volatilizao, com o intuito de obter-se
uma anlise mais rpida, conveniente ou mais exata, evitando retenes na
coluna. Esta melhora pode ser obtida tanto na etapa de preparo da amostra
quanto na de anlise. O novo composto formado geralmente apresenta uma ou
mais das seguintes vantagens em relao ao composto de partida; mais fcil
de ser extrado ou cromatografado; medido com maior sensibilidade ou
exatido; ou mais facilmente separado de interferentes.
Uma das maiores (se no a maior) limitaes da cromatografia gasosa
pode ser contornada atravs da derivatizao; a elevada polaridade, baixa
volatilidade e/ou estabilidade trmica de vrios compostos orgnicos,
particularmente biomolculas. Assim, muitas molculas excludas da anlise
por cromatografia gasosa quando no estado livre podem ser adequadamente
analisadas na forma de um derivado. Compostos contendo massa molecular
elevada e grupos polifuncionais no, so, usualmente, adequados anlise
direta por cromatografia gasosa. Em geral, estes grupos funcionais tornam o
composto bastante polar e reduzem sua volatilidade tornando o tempo de
reteno demasiadamente longo. Em casos extremos, no h eluo da
coluna cromatogrfica. Felizmente, tais compostos podem ser facilmente
convertidos a derivados menos polares e mais adequados anlise por
cromatografia gasosa. Grupos carboxila (COOH) e hidroxila (OH) causam
47
maiores problemas sendo seguidos pelos grupos amino (NH2) e imino (=NH),
os quais devem ser derivatizados para uma anlise mais adequada89.
Dentro os mtodos de derivatizao, um bom exemplo a sililao, ou
silanizao,
que
produo
de
derivados
do
trimetilsilil,
mais
especificamente a trimetilsililao (com grupo TMS, trimetilsilil), processo

conhecido h vrias dcadas92, e trata-se de uma substituio dos prtons
lbeis em compostos polares pelo grupo trimetilsilil [-Si(CH3)3]. Vrios grupos
funcionais podem ser derivatizados dessa forma, incluindo os seguintes
grupos:
-OH
-COOH
-SH
-NH2
=NH
Dentre as classes de compostos que podem ser derivatizados por esta tcnica
destacam-se alcois, cidos carboxlicos, aminas, fenis, carboidratos,
esterides, e muitos outros. Existem ainda vrios outros mtodos de
derivatizao, como acetilao e esterificao91.
3.3.4 Cromatografia Gasosa e o Biodiesel
Como mostra a Tabela 3, percebe-se que muitos so os parmetros de

qualidade exigidos para o biodiesel. A tcnica de cromatografia em fase gasosa
uma ferramenta fundamental no controle de qualidade do biodiesel, pois dos
31 parmetros listados, 9 utilizam a cromatografia gasosa como tcnica nos
mtodos de referncia. Isso corresponde a 29 % de todos os parmetros de
controle de qualidade do biodiesel. A tabela 4 apresenta um resumo dos
mtodos de cromatografia gasosa, atualmente utilizados no controle de
qualidade de biodiesel, destacando suas aplicaes.
48
TABELA 4 MTODOS DE CROMATOGRAFIA GASOSA EM ANLISES DE BIODIESEL
Parmetro de
Mtodo
qualidade
Resumo
aplicvel
Utiliza coluna de fase estacionria polar, e o
Teor de ster
biodiesel injetado diludo em tolueno, juntamente

com um padro interno. Identifica todos os picos da
EN1410394
amostra relativos a steres, quantificando o teor

Teor de ster
linolnico
total de steres e de ster linolnico (C18:3) na

amostra. Detector de ionizao por chama.
Utiliza-se injeo com headspace, que consiste no
aquecimento da amostra e a injeo apenas dos
EN1411095
Teor de Metanol
vapores liberados. O resultado um cromatograma

limpo, apenas com o pico relativo ao metanol.
Detector de ionizao por chama.
Utiliza coluna de fase estacionria apolar, e o
biodiesel injetado diludo em heptano. Identifica
NBR
1576496
Teor de ster
os picos da amostra de steres, quantificando o

total de steres por meio de calibrao externa.
Detector de ionizao por chama.
Utiliza coluna de fase estacionria apolar, e o
NBR
Teor de metanol
1534397
e/ou etanol
biodiesel injetado puro, fortificado com padro

interno. Identifica os picos de metanol e/ou etanol,
quantificando essas substncias. Detector de
ionizao por chama.
EN1410598
ASTM
D6584
99
NBR
15908100
Utiliza coluna de fase estacionria apolar de alta

Teor de glicerol
livre, glicerol
total, mono-, die triacilgliceris
temperatura, e o biodiesel injetado diludo em

heptano. Antes, porm, possui etapa de
derivatizao devido natureza dos gliceris. A
quantificao feita por curva analtica com
padronizao interna. Detector de ionizao por
chama.
49
TABELA 4 MTODOS DE CROMATOGRAFIA GASOSA EM CONTROLE DE QUALIDADE DE
BIODIESEL (continuao)
Parmetro de
Mtodo
qualidade
Resumo
aplicvel
Utiliza coluna de fase estacionria polar, e o
biodiesel injetado diludo em tolueno, juntamente
EN15779101
Teor de steres
com um padro interno. Identifica os picos de
poliinsaturados
steres com 4 insaturaes ou mais na cadeia,

quantificando estes steres. Detector de ionizao
por chama.
3.4
Validao de mtodos
3.4.1 Metrologia e Validao
A metrologia definida como a cincia da medio e suas aplicaes.

Ela abrange todos os aspectos tcnicos e prticos relativos s medies, e
possui uma diviso em trs reas: metrologia cientfica, industrial e legal. A
metrologia extremamente relevante nas relaes industriais e comerciais
globalizadas, no meio ambiente, na sade pblica e pessoal, na proteo ao
consumidor e em processos judiciais. Um requisito formal (e freqentemente
legal) aos laboratrios de qumica analtica, a introduo de medidas de
garantia da qualidade, para assegurar que sejam capazes de produzir
resultados com a qualidade adequada ao uso pretendido.
Os laboratrios de ensaio devem atender requisitos internacionais de
qualidade a fim de atender exigncias acerca dos resultados de sua anlises, e
tais requisitos, no Brasil, encontram-se descritos na norma ABNT NBR ISO/IEC
(Associao Brasileira de Normas Tcnicas, Norma Brasileira, International
Organization for Standardization/ International Electrotechnical Comission)
1702521. A norma, de forma genrica, engloba requisitos do sistema de
50
qualidade que o laboratrio deve manter e requisitos tcnicos. Dentre os
requisitos do sistema, h detalhes a serem seguidos quando da definio de
atribuies e responsabilidades da organizao; controle de documentos e
registros; suprimento de bens e servios; auditorias internas e anlises crticas;
aes corretivas e preventivas; subcontratao de ensaios; ensaio no
conforme. Dentre os requisitos tcnicos, pode-se citar: qualificao e
competncia de pessoal; acomodaes e condies ambientais; mtodos e
procedimentos de ensaio; equipamentos; amostragem; rastreabilidade da
medio; ensaios de proficincia; auditorias tcnicas; manuseio de itens;
incerteza de medio. Por consenso internacional, o laboratrio que atende a
norma de forma integral garante a qualidade dos seus resultados de ensaio,
pois dentro desta garantia, ele dispor de procedimentos de controle da
qualidade dos resultados; aplicaes de tcnicas estatsticas para anlise
crtica dos resultados; uso regular de materiais de referncia; participao em
programas interlaboratoriais; ensaios replicados, utilizando-se dos mesmos
mtodos ou de mtodos diferentes, quando aplicvel; correlao de resultados
de caractersticas diferentes de um item; reensaio de itens retidos.
Dentro dos requisitos tcnicos, h o item 5.4.5 da referida norma, que
trata da validao de mtodos. fundamental que os laboratrios disponham
de meios e critrios objetivos para demonstrar, por meio da validao, que os
mtodos de ensaio que executam conduzem a resultados confiveis e
adequados qualidade pretendida.
O laboratrio, ao empregar mtodos normalizados, necessita demonstrar
que tem condies de oper-los de maneira adequada, dentro das condies
especficas existentes nas suas instalaes antes de implant-los, no
necessitando realizar uma validao, pois em geral um mtodo normalizado a
princpio j foi devidamente validado. Se um mtodo existente for modificado
para atender aos requisitos especficos, ou um mtodo totalmente novo for
desenvolvido, o laboratrio deve se assegurar de que as caractersticas de
desempenho do mtodo atendem aos requisitos para as operaes analticas
pretendidas102.
Com o objetivo de confirmar que os mtodos so apropriados para o uso
pretendido, o laboratrio deve validar:
a) Mtodos no normalizados;
51
b) Mtodos criados / desenvolvidos pelo prprio laboratrio;
c) Mtodos normalizados usados fora dos escopos para os quais
foram concebidos;
d) Ampliaes e modificaes de mtodos normalizados.
O processo de validao deve estar escrito em um procedimento, e os
estudos para determinar os parmetros de validao devem ser realizados com
equipamentos
instrumentos
dentro
das
especificaes,
funcionando
corretamente e adequadamente calibrados. Do mesmo modo, o responsvel

pela realizao dos estudos deve ser competente na rea e precisa ter
conhecimento suficiente sobre o trabalho, sendo capaz de tomar as decises
apropriadas durante a realizao do mesmo.
No planejamento e execuo da validao, sugere-se a seguinte
seqncia de trabalho:
a) Definir a aplicao, objetivo e escopo do mtodo;
b) Definir os parmetros de validao e critrios de aceitao;
c) Verificar se as caractersticas de desempenho do equipamento
esto compatveis com o exigido pelo mtodo em estudo;
d) Qualificar os materiais, por exemplo, padres e reagentes;
e) Planejar os experimentos de validao, incluindo o tratamento
estatstico; e
f) Fazer os experimentos de validao.
Os parmetros de validao devem estar claramente declarados no
procedimento documentado e incluir, quando aplicvel:
a) Seletividade;
b) Linearidade;
c) Sensibilidade;
d) Faixa de Trabalho e Faixa Linear;
e) Limite de deteco;
f) Limite de quantificao;
g) Tendncia / recuperao;
h) Preciso
(repetibilidade,
reprodutibilidade
103
);
preciso
intermediria
52
i) Robustez.
Os parmetros que necessitam ser calculados durante o processo de
validao podem variar de acordo com o tipo de ensaio, como sugerido na
Tabela 5102. Outros parmetros podem ser includos e/ou excludos,
dependendo das condies do mtodo.
TABELA 5 PARMETROS GERAIS PARA VALIDAO DE MTODOS
Tipo de ensaio
Parmetros
Qualitativo
Preciso
Seletividade
Tendncia /
recuperao
Robustez
Determinao
Anlise de
do componente
elementos
Propriedades
(ou analito) em
menores e
fsicas
maior teor*
traos**
Sensibilidade /
Linearidade /
faixa de
trabalho
Limite de
deteco
Limite de
quantificao
(*) Dependendo da faixa de concentrao do analito pode no ser necessria a determinao

dos limites de deteco e de quantificao, como aqueles com concentrao entre 1 e 100 %.
(**) So consideradas de menor teor concentraes entre 0,01 e 1 % e elementos traos
concentraes abaixo de 0,01 %.
Segue definio dos parmetros de validao104-105.
53
Seletividade
Tambm chamada especificidade, a capacidade do mtodo em
determinar com exatido o analito de interesse na presena de componentes
passveis de estarem presentes na amostra, como impurezas, produtos de
degradao, efeitos de matriz, etc.
Linearidade
Consiste na capacidade de uma metodologia analtica em demonstrar
que os resultados obtidos so diretamente proporcionais concentrao do
analito na amostra, dentro de um intervalo especificado.
Sensibilidade
a taxa de mudana de resposta analtica em relao mudana de
concentrao do analito. Em geral, expressa pelo coeficiente angular em uma
curva analtica, obtido por regresso linear ou experimentalmente.
Faixa de trabalho / intervalo
a faixa de concentrao na qual o analito em questo pode ser
determinado com preciso e tendncia aceitveis.
Limite de deteco
a menor quantidade de analito presente na amostra, que pode ser
detectada, mas no necessariamente quantificada, independentemente do
rudo.
Limite de Quantificao
54
a menor quantidade de analito presente na amostra, que pode ser
determinado com exatido e preciso aceitveis.
Exatido
o grau de concordncia entre o valor medido e o valor de referncia.
Preciso
Expressa o grau de disperso de uma srie de medidas e pode ser
considerada
em
trs
nveis:
repetibilidade,
preciso
intermediria
reprodutibilidade.
Robustez
a medida da capacidade de permanecer inalterado com pequenas
variaes nos parmetros do mtodo.
De forma resumida, a validao de um mtodo um equilbrio entre
custos, riscos e possibilidades tcnicas, conforme segundo Nota 3 do item
5.4.5.3 da norma ABNT NBR ISO/IEC 1702521.

Nesse contexto de garantia da qualidade do resultado analtico, a
incerteza um dos principais parmetros associados ao resultado de uma
medio. Atualmente, mundialmente reconhecido que o resultado de uma
medio no est completo se faltar alguma expresso de incerteza a ele
associado. Somente de posse de uma estimativa da incerteza podemos
garantir a comparabilidade de dois resultados106. Formalmente, a nota 2 do
item 5.4.5.2 da norma ABNT NBR ISO/IEC 1702521 coloca a avaliao da
incerteza de medio do resultado com base no conhecimento cientfico dos
princpios tericos do mtodo e na experincia prtica, como uma das tcnicas
usadas para a determinao de um desempenho de um mtodo. Logo, a
55
avaliao (ou estimativa, neste caso), da incerteza est diretamente associada
validao daquele mtodo.
A estimativa de uma incerteza de medio um processo que envolve
algumas etapas, e tais etapas esto descritas a seguir107.
Especificao do Mensurando
Deve-se escrever uma definio clara (e o mais rigorosa possvel) do
que est sendo medido, incluindo a relao (frmula, modelo) entre o
mensurando e as grandezas de entrada (isto , grandezas medidas,
constantes, valores dos padres de calibrao etc.) das quais depende.
Identificao das fontes de incerteza
Devem-se listar as possveis fontes de incerteza. Isto ir incluir as fontes
que contribuem para as incertezas das grandezas de entrada da relao
especificada no primeiro passo, mas pode incluir outras fontes e devem incluir
aquelas fontes originadas de hipteses qumicas (isto , aproximaes feitas
no modelo proposto). recomendvel a construo de um diagrama espinha
de peixe ou diagrama de causa e efeito ou de Ishikawa. Um exemplo desse
tipo de diagrama (utilizado na estimativa da incerteza da determinao do
Ponto de Fulgor calculado para biodiesel) est ilustrado na Figura 26.
Quantificao dos componentes de incertezas
Medir ou estimar o tamanho da incerteza associada a cada fonte de
incerteza identificada. sempre possvel estimar ou determinar uma
contribuio nica para a incerteza associada a um conjunto em separado de
fontes de incerteza.
Calcular a incerteza combinada
As contribuies de fontes individuais ou associadas estimuladas na
terceira etapa devem ser expressas como desvios padro, e combinadas de
56
acordo com a regra apropriada, para produzir a incerteza padro combinada
(uc). O fator de abrangncia apropriado pode ser aplicado para produzir uma
incerteza expandida (U), que caracterizar, juntamente com o resultado da
medio, o intervalo de confiana.
Figura 26 Diagrama de Ishikawa utilizado na estimativa de incerteza da determinao do
Ponto de Fulgor calculado (PFC) para biodiesel.
Existem guias disponveis para auxlio na estimativa de incerteza107-109.

Porm, assim como para a validao, no h um padro estabelecido em
que deve ser obrigatoriamente seguido em sua integralidade. Existem muitas
variveis que sempre sero peculiares ao processo de estimativa de incerteza,
principalmente de um novo mtodo proposto.
57
4. EXPERIMENTAL
A parte experimental do trabalho foi subdividida em cinco etapas:
1. etapa- Experimentos de caracterizao dos antioxidantes sintticos

utilizados: obteno dos antioxidantes a serem utilizados no desenvolvimento
do mtodo, e caracterizao utilizando CG-EM (Cromatografia GasosaEspectrometria de Massas).
2. etapa- Experimentos de desenvolvimento do mtodo proposto:
utilizao
dos
antioxidantes
sintticos
utilizados
na
etapa
para
desenvolvimento do mtodo proposto, por CG-DIC (Cromatografia GasosaDetector de Ionizao por Chama), partindo de condies gerais do mtodo
ASTM D6584.
3. etapa- Experimentos de otimizao do mtodo: verificao de possveis
problemas ou interferentes no mtodo, e execuo de correes adequadas.
4. etapa- Experimentos de validao do mtodo: elaborao e aplicao de
protocolo de validao a fim de validar o mtodo intralaboratorialmente.
5. etapa- Experimentos de suporte estimativa de incerteza de medio:
estimativa de incerteza de medio, com o suporte de experimentos para
quantificao de determinadas fontes de incerteza.
6. etapa- Experimentos de aplicabilidade do mtodo: obteno de teores
de antioxidantes sintticos de algumas amostras, e interpretao dos
resultados com auxlio de medies de estabilidade oxidao das mesmas
amostras.
58
4.1
Material
4.1.1 Reagentes e solventes

Os reagentes e solventes utilizados em todos os experimentos
realizados so mostrados na Tabela 6.
TABELA 6 REAGENTES E SOLVENTES
Reagentes
Fonte
Piridina P.A.
Vetec
Antioxidante sinttico TBHQ*
Antioxidante sinttico BHT*
MSTFA (N-N-trimetiltrifluoroacetamida)
Merck
n-Heptano P.A.
Isofar
gua grau ASTM I**
Sigma-
Soluo de Karl Fischer coulomtrica andica
Aldrich
Sigma-
Soluo de Karl Fischer coulomtrica catdica
Aldrich
Extran Alcalino
Merck
Peneira Molecular 3A
Metrohm
Acetona P.A.
Isofar
Metanol P.A.
Vetec
Biodiesel NIST (National Institute of Standards and Technology)

2772 (Material de Referncia com teor de gua certificado)
NIST
(*) Materiais obtidos junto usina de biodiesel autorizada pela ANP, BIOCAPITAL
Participaes S/A.
(**) Material obtido com uso do ultrapurificador de gua ELGA Purelab Classic, com valor de
110
condutividade de 0,1 S/cm, atendendo portanto o grau ASTM I, segundo ASTM D1193
4.1.2 Solues
4.1.2.1
Solues estoque de antioxidantes sintticos
59
As solues estoque de antioxidantes sintticos so apresentadas na
Tabela 7.
TABELA 7 SOLUES ESTOQUE DE ANTIOXIDANTES SINTTICOS
Quantidade
Soluto
de soluto
Volume total
Solvente
de soluo
(g)
Antioxidante
sinttico TBHQ 1
Antioxidante
sinttico BHT 1
Antioxidante
sinttico TBHQ 2
Antioxidante
sinttico BHT 2
(mL)
Concentrao
final (mg/mL)
0,2062
Piridina
25
8,248
0,2039
Piridina
25
8,156
0,2016
Piridina
25
8,064
0,2088
Piridina
25
8,352
4.1.2.2 Solues de calibrao preparadas a partir das solues

estoque
As solues estoque de antioxidantes sintticos foram preparadas
conforme quantidades apresentadas na Tabela 8 .
TABELA 8 SOLUES DE CALIBRAO
Soluo de calibrao
20
40
60
80
100
Volume de piridina (L)
80
60
40
20
Volume de MSTFA (L)
100
100
100
100
100
Volume de n-Heptano (mL)
10
10
10
10
10
Caracterstica
Volume de soluo estoque
de antioxidante adicionado
(L)
Massa de antioxidante
sinttico* (mg)
0,16496 0,33712 0,50568 0,65984 0,82480
60
TABELA 8 SOLUES DE CALIBRAO (continuao)
Soluo de calibrao
Caracterstica
sinttico* (mg)
sinttico* (mg)
sinttico* (mg)
0,16312 0,32624 0,48936 0,65248 0,81560

0,16128 0,32256 0,48384 0,64512 0,80640
0,16704 0,33408 0,50112 0,66816 0,83520
(*) Massas obtidas considerando os volumes tomados das solues estoque da

Tabela 7, respectivamente.
4.1.2.3 Preparo de solues de amostras
As solues para a leitura de amostras de biodiesel foram preparadas
conforme condies estabelecidas na Tabela 9.
TABELA 9 PREPARO DE SOLUES PARA LEITURA DE AMOSTRAS
Massa de
Volume de
Volume de
Volume de n-
amostra (mg)
Piridina (L)
MSTFA (L)
Heptano (mL)
100,0
200
100
10
4.1.3 Vidrarias e Instrumentos volumtricos
4.1.3.1 Vidrarias
Para o preparo das solues estoque da Tabela 7, foram usados bales
volumtricos de 25 mL, devidamente calibrados por laboratrio pertencente
RBC (Rede Brasileira de Calibrao) para a grandeza volume.
Para o preparo das solues de calibrao da Tabela 8 e das solues
para leitura de amostras, foram utilizados frascos de vidro de 20 mL de
capacidade, e pipeta volumtrica de 10 mL, devidamente calibrada por
61
laboratrio pertencente RBC para a grandeza volume, para a adio do nHeptano (solvente). Para injees nos cromatgrafos, foram utilizados frascos
de 1,7 mL de vidro, prprios para amostradores automticos.
4.1.3.2 Instrumentos volumtricos
Para as medies dos volumes menores que 10 mL citados nas
Tabelas 8 e 9, foram utilizadas micropipetas volumtricas de volume mximo
de 100 L, devidamente calibradas por laboratrio pertencente RBC para a
grandeza volume.
4.1.4 Balana
Para todas as medies de massa deste trabalho, foi utilizada balana

analtica digital com resoluo de 0,0001 g, marca Precisa, modelo XT 220A,
devidamente calibrada por laboratrio pertencente RBC para a grandeza
massa.
4.1.5 Instrumentao analtica

4.1.5.1 Aparelhagem utilizada nos experimentos de caracterizao
dos antioxidantes sintticos
O cromatgrafo Perkin Elmer Clarus 500 com espectrmetro de massas
como detector (CG-EM) foi utilizado nos experimentos de caracterizao dos
antioxidantes sintticos que seriam utilizados no desenvolvimento do mtodo
proposto. Este equipamento fez uso de injetor / amostrador automtico, injeo
tipo split. A coluna selecionada foi de fase estacionria apolar, composta por 95
% dimetilpolisiloxano e 5 % fenil-metilpolisiloxano, de alta temperatura, com
separao por ponto de ebulio, de dimenses 30 m x 0,25 mm x 0,10 m. O
equipamento controlado por microcomputador, atravs de software
Turbomass GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) Perkin Elmer
Software.
62
4.1.5.2
Aparelhagem utilizada nas demais etapas experimentais
O cromatgrafo Agilent 6890 com detector de ionizao por chama (CGDIC) foi utilizado nas demais etapas experimentais do trabalho. Este
equipamento fez uso de injetor / amostrador automtico, injeo tipo oncolumn. A coluna selecionada foi do mesmo tipo que a coluna j citada em
4.1.5.1. O equipamento controlado por microcomputador, atravs de software
Agilent Chemstation.
O equipamento Metrohm Karl Fischer Coulometer 831, com seus
respectivos acessrios, foi utilizado nas medies de teor de gua necessrias
durante a etapa de experimentos de otimizao do mtodo proposto.
O equipamento Metrohm Rancimat 743, com seus respectivos
acessrios, foi utilizado nas medies de Estabilidade Oxidao necessrias
durante a etapa de experimentos de aplicabilidade do mtodo.
4.2
Metodologia
4.2.1 Caracterizao dos antioxidantes sintticos

Os antioxidantes sintticos escolhidos para o trabalho foram o BHT e o
TBHQ, visto que so utilizados pelas usinas produtoras de biodiesel conforme
informado pela ANP. Nenhuma usina no territrio nacional tem reportado uso
de outros antioxidantes sintticos ANP.
As condies gerais da metodologia proposta envolveram as condies
cromatogrficas similares quelas observadas nas normas ASTM D658499 e
EN1410598. levantada uma curva analtica, com quantidades (massas)
conhecidas dos antioxidantes sintticos. Padres de antioxidantes sintticos de
grau analtico poderiam vir a ser utilizados, por exemplo, BHT e TBHQ grau
analtico. Porm, optou-se pelo uso de antioxidantes comercialmente obtidos
junto aos produtores de biodiesel, obviamente com purezas inferiores a
padres analticos. Isso porque o trabalho tem por objetivo desenvolver mtodo
63
para a determinao do antioxidante sinttico, no somente do composto
qumico. Para os produtores e para a os agentes envolvidos com a cadeia do
biodiesel, a informao mais relevante neste caso seria a quantidade real de
antioxidante no biodiesel, em detrimento da quantidade de TBHQ, por exemplo.
Experimentos utilizando cromatografia gasosa acoplada com detector de
massas (CG-EM) foram procedidos com as solues-estoque dos antioxidantes
comerciais para a caracterizao da adequabilidade do uso desses materiais
no desenvolvimento do mtodo. As solues estoque foram preparadas
conforme quantidades descritas na Tabela 7. Essas solues foram injetadas
diretamente no sistema CG-EM, com aparelhagem descrita no item 4.1.5.1.
Cabe destacar que a coluna e as condies de temperatura ao longo da
anlise cromatogrfica foram escolhidas de forma que fossem de fato
semelhantes
condies
que
seriam
utilizadas
posteriormente
no
desenvolvimento do mtodo proposto, com o intuito de j observar o

comportamento dos analitos de interesse. As condies de operao do
sistema esto descritas na Tabela 10.
TABELA 10 CONDIES DE OPERAO CG-EM
Injetor
Injeo split
Razo 18:1
Volume injetado
1 L
Temperatura
310 C
Programao do forno
Temperatura inicial
50OC
1,5 min
Rampa 1
15OC / min at 180OC
0 min
Rampa 2
7OC / min at 230OC
0 min
Rampa 3
20OC / min at 375OC
17 min
Detector
Tipo
Multiplicadora de eltrons
Analisador
Quadrupolo
Ionizao
Eletrnica, modo positivo

Gs de arraste
Tipo
Vazo
Hlio
1,5 mL/min
64
4.2.2 Desenvolvimento do mtodo proposto

Uma vez prontas as solues estoque, foram preparadas solues de
calibrao, conforme quantidades apresentadas na Tabela 8. O solvente para a
soluo estoque escolhido foi a piridina, por trs razes, sendo:
a) A piridina um solvente que solubiliza instantaneamente tanto os
compostos de interesse quanto o prprio biodiesel;
b) A piridina um solvente que permite que reaes de derivatizao,
mais especificamente silanizao, procedam com alto rendimento111;
c) A piridina o solvente utilizado nas determinaes quantitativas de
glicerol e seus derivados98-99, resultantes da reao de transesterificao para
obteno de biodiesel, ou seja, um solvente disponvel em todos os
laboratrios de certificao de biodiesel.
Poder-se-ia, em teoria, utilizar outro solvente que favorecesse a
derivatizao, por exemplo, acetonitrila, de toxicidade menor que a piridina112.
Ocorre que neste caso seria necessria uma etapa adicional de extrao, o
que aumentaria consideravelmente o tempo de anlise. Alm disso, possveis
novas condies para a derivatizao (tempo e temperatura de reao, por
exemplo) deveriam ser testadas90.
Aps segregao dos volumes de solues estoque, faz-se a reao de
derivatizao com MSTFA, adicionando-se em cada soluo de calibrao 100
L deste reagente (quantidade em excesso), e deixou-se reagir por 20 minutos,
em temperatura ambiente, para que a reao fosse concluda, ou seja, a
remoo do grupo (-OH) e a introduo do grupo trimetilsilil113-116. A Figura 27
ilustra o mecanismo da reao de silanizao do TBHQ com MSTFA. Esta
reao permite a anlise quantitativa dos antioxidantes sintticos por
cromatografia gasosa. O solvente fator decisivo no alto rendimento dessa
reao, pois ele pode atuar como base de Lewis para a ativao da reatividade
dos grupos que sero removidos111.
65
Figura 27 Reao geral de silanizao do TBHQ com MSTFA. Os radicais (-OH) so

substitudos por grupos trimetilsilano.
OH
CH3
CH3
CH3
O
H3C
CH3
H3C
Si
CH3
H O+
N
Si
H3C
CH3
CH3
H3C
CH3
Si
H3C
OH
H3C
H3C CH3
CH3
O
CH3 O
H
Si
H3C
CH3
F
CH3
CH3
CH3
F
NH
F
F
CH3
NH
H3C
CH3
Si
O
H3C
H3C
Si
H3C
CH3
CH3
CH3
Aps esta etapa, feita uma diluio das solues com 10 mL de nheptano, para injeo no cromatgrafo, e feita posterior identificao dos picos
para levantamento da curva analtica. A faixa de massas de antioxidantes
coberta pelas curvas analticas foi de aproximadamente 0,16 mg (primeiro
ponto) a aproximadamente 0,82 mg (quinto ponto), massas essas detalhadas
na Tabela 8. A Tabela 11 apresenta as condies cromatogrficas.
A aparelhagem utilizada no mtodo proposto est descrita no item
4.1.5.2. O uso do detector de ionizao por chama devido ao favorecimento
de uma anlise quantitativa de compostos orgnicos, por parte deste tipo de
detector, sendo notria sua estabilidade. A coluna de fase estacionria apolar
comumente utilizada nas determinaes de gliceris, portanto de aplicao j
conhecida para biodiesel. O uso desta coluna para alta temperatura tambm se
CH3
66
justifica pelo fato do mtodo no prever etapa de extrao, logo a amostra
injetada integralmente no cromatgrafo, e amostras como o biodiesel possuem
constituintes de peso molecular relativamente alto (maiores que 600 Da como,
por exemplo, alguns triacilgliceris), sendo necessria uma coluna de alta
temperatura para total eluio destes compostos. J o emprego de injetor oncolumn tambm justificado para garantir uma melhor quantificao,
melhorando a sensibilidade para faixas de concentrao menores que 0,1 %
em massa, alm de possibilitar a verificao da eficincia da reao de
derivatizao.
TABELA 11 CONDIES DE OPERAO
Injetor
Injeo on-column
Volume injetado
1 L
Temperatura
Acompanha programao do forno

Programao do forno
Temperatura inicial
50OC
1 min
Rampa 1
15OC / min at 180OC
0 min
Rampa 2
7OC / min at 230OC
0 min
Rampa 3
30OC / min at 380OC
10 min
Detector
Tipo
Ionizao por chama de Hidrognio
Temperatura
380OC
Vazo de Hidrognio
35 mL/min
Vazo de ar sinttico
450 mL/min
Vazo de Nitrognio (gs auxiliar) 30 mL/min

Tempo total de corrida
Aproximadamente 35 minutos
Gs de arraste
Tipo
Hlio
Vazo
3 mL/min
67
Caso a reao ocorra parcialmente, o uso deste injetor possibilita, ao observar
o cromatograma, se a reao de derivatizao foi de fato efetiva. Produtos noderivatizados tendem a alargar o pico do analitodificultando uma quantificao
segura112.
Para anlise de amostras, foram tomadas massas de aproximadamente
100 mg, com valor devidamente registrado com aproximao de 0,1 mg. Essa
quantidade de amostra a mesma que utilizada nos mtodos de
determinao dos teores de glicerol livre e glicerol total98-99. A amostra ento
diluda com 200 L de piridina, para posteriormente ser adicionado reagente
MSTFA em quantidade de 100 L (excesso), e a reao processa-se por 20
minutos, em temperatura ambiente. Cabe ressaltar que ao contrrio das
solues de calibrao, a amostra de biodiesel contm uma srie de
compostos que tambm so passveis de sofrerem reaes de silanizao,
como o prprio glicerol, monoacilgliceris e diacilgliceris. O excesso de
MSTFA no foi adicionado por conta da presena desses compostos, pois a
quantidade de reagente silanizante j suficiente para a silanizao de todos
os compostos silanizveis presentes no biodiesel, sendo 100 L de MSTFA
para 100 mg de biodiesel; os compostos silanizveis, considerando um
biodiesel especificado, no tm teor superior a 3,5 % em massa. A Figura 28
apresenta um esquema da metodologia proposta, passo a passo.
Aps a reao, as amostras foram diludas com 10 mL de n-heptano, e
injetadas no cromatgrafo. Identificado o pico de interesse, atravs dos tempos
de reteno das solues de calibrao, e faz-se a quantificao utilizando a
equao da curva analtica, obtida por regresso linear. importante tambm
destacar que no momento da obteno da massa de antioxidante na amostra
por meio da equao da curva analtica, os resultados foram convertidos para
mg/kg, atravs da diviso pela massa da amostra, obtida inicialmente na
pesagem, e posterior multiplicao pelo fator 106. Sendo assim, o resultado da
anlise descrito pela equao 1.
10

Onde:
(1)
68
C a concentrao de antioxidante na amostra de biodiesel, em mg/kg.
mg/
mant a massa de antioxidante, obtida pela regresso linear, em miligramas.
m
mbiod a massa de biodiesel, obtida na pesagem, em miligramas.
m ramas.
Figura 28 Esquema-resumo da metodologia proposta
Anlise de
amostra
Calibrao
69
4.2.3 Otimizao do mtodo

Quando do desenvolvimento do mtodo, foi detectada influncia
importante do teor de gua nas amostras. Tal influncia tratada com detalhes
na seo 5. Assim sendo, foram necessrias anlises de determinao do teor
de gua de algumas amostras, segundo mtodo ASTM D6304117, anlise
gravimtrica, injetando-se aproximadamente 1,5 g de amostra. Aps a
deteco de tal influncia, o mtodo foi mantido com as mesmas condies
descritas em 2.2, porm com consideraes acerca de requisitos para
amostras a serem analisadas pelo mtodo proposto. Maior detalhamento
tratado na seo 5.
4.2.4 Validao do mtodo

Para a validao do mtodo, elaborou-se protocolo de validao prprio,
pois para a validao de mtodos em biodiesel no h um protocolo de
referncia. Assim sendo, o protocolo foi desenvolvido a partir de referncias j
estabelecidas102,104-105
de
referncia
de
validao
na
rea
de
cromatografia118. A Tabela 12 apresenta com detalhes o protocolo de validao

seguido para a metodologia, assim como os resultados obtidos. Abaixo,
seguem comentrios acerca dos parmetros utilizados.
Exatido
A Exatido , geralmente, determinada por intermdio do uso de uma
amostra certificada cuja concentrao do analito de interesse conhecida.
Porm, devido inexistncia de uma amostra de biodiesel certificada para
concentrao dos compostos antioxidantes, optou-se por avaliar a exatido
juntamente com a recuperao, isto , utilizar uma amostra isenta de
antioxidante e adicionar quantidade conhecida de antioxidante, e proceder
anlise (fortificao).
70
Preciso
Avaliou-se aqui o coeficiente de variao (ou desvio-padro relativo) ao
se injetar um mesmo padro dez vezes.
Fidelidade Repetibilidade de reas e tempos de reteno
A fidelidade analtica tem sido estabelecida em trs nveis: repetibilidade,
preciso intermediria e reprodutibilidade, sendo que a primeira expressa a
fidelidade obtida nas mesmas condies operacionais, aplicadas em um curto
espao de tempo; a segunda refere-se s variaes ocorridas dentro de um
mesmo laboratrio quando um ou mais fatores importantes so mudados; a
terceira designa a fidelidade entre laboratrios, geralmente obtida em anlises
colaborativas.
No presente trabalho, obteve-se apenas a fidelidade no nvel de repetibilidade,
ficando os demais nveis como sugestes para a continuidade dos estudos.
Tanto para rea de pico quanto para tempo de reteno, utilizou-se a relao:

100 %

Onde:
CV o coeficiente de variao;
x a mdia de reas de pico ou de tempo de reteno;
sr o desvio-padro de repetibilidade.
Linearidade
Neste caso, verificaram-se os coeficientes de correlao (r) obtidos.
Deve-se lembrar que o coeficiente de correlao no o mesmo que o
coeficiente de determinao (r2). O coeficiente de correlao traz informao
de quanto de similaridade que a resposta instrumental tem com a equao da
reta obtida por regresso linear; o coeficiente de determinao traz a
informao de efetiva relao entre a variao da resposta instrumental e a
quantidade de analito.
71
Metodologia para determinao de limite de deteco e quantificao

A metodologia escolhida para obteno de LD e LQ (Limite de Deteco
e Limite de Quantificao) envolve as curvas limites de confiana e curvas
limites de previso, inferiores e superiores para um dado nvel de confiana
escolhido119. A escolha de tal mtodo se deu porque ele leva em considerao
as variaes de todos os nveis de concentrao da curva analtica. Como a
regresso linear um modelo matemtico criado pela anlise, todas as
mudanas nesse modelo que influenciem as relaes matemticas, tero efeito
no LD e LQ. Na prtica, quanto mais imprecisas as medies em todos os
nveis de concentrao, mais distantes graficamente as CLCs e a CLPs (curvas
limites de confiana e curvas limites de previso) ficaro em relao curva
analtica, gerando LDs e LQs mais altos.
Sensibilidade
A sensibilidade, em geral, determinada por intermdio da inclinao do
grfico da curva analtica, indicando que o mtodo to mais sensvel quanto
maior for o coeficiente angular da reta de regresso linear. Este parmetro
particularmente til quando da comparao destes coeficientes angulares de
outras retas de regresso obtidas por outros mtodos, na mesma faixa de
aplicao. Porm, a no-disponibilidade de tais coeficientes obtidos por outros
mtodos foi uma dificuldade, ento optou-se por uma comparao
com
mtodo por CLAE84 disponvel na literatura, mesmo sem exatamente a mesma

faixa de trabalho ser coberta.
Seletividade
Este parmetro foi avaliado de forma qualitativa, por interpretao dos
cromatogramas, verificando-se possibilidade de co-eluies.
Estabilidade
72
Para a definio deste parmetro, foram feitas injees da mesma
amostra ao longo do tempo a fim de se verificar quando que havia uma
variao maior que 2 % da concentrao medida. Aps este perodo, uma nova
curva analtica deveria ser levantada.

A incerteza de medio foi estimada utilizando diretrizes do Guia
Eurachem:CITAC (Cooperation on International Traceability in Analytical
Chemistry) Relacre (Associao de Laboratrios Acreditados de Portugal)109,
que um guia de estimativa de incertezas analticas baseado no ISO GUM
(Guide of Uncertainty Measurement)108, e no Guia Eurachem: CITAC107
especfico para ensaios qumicos, e de divulgao europia. Como o mtodo
utiliza regresso linear, sabe-se que a incerteza de medio uma varivel da
concentrao, logo, apresenta valor mximo e mnimo ao longo da faixa de
trabalho. Sendo assim, optou-se por estabelecer um limite de 20 % para a
maior incerteza expandida encontrada no intervalo de aplicao, como critrio
de aceitao. Maior detalhamento da estimativa de incerteza de medio
exposto na seo 5.
TABELA 12 PROTOCOLO DE VALIDAO
Parmetro
Exatido
Mtodo utilizado
aceitao118
Anlise de amostra branco
Recuperao entre 70 e
fortificada com quantidade de
120 % com 3 replicatas
antioxidante conhecida
em 3 nveis de
(recuperao)
concentrao distintos
Obteno do coeficiente de
Preciso
Critrios de
variao para dez injees de

padro
Coeficiente de variao
1%
Obteno da repetibilidade da
Repetibilidade
rea do pico, atravs de dez
de reas
injees de uma soluo de
1%
calibrao
73
TABELA 12 PROTOCOLO DE VALIDAO (continuao)
Parmetro
Repetibilidade
de tempos de
reteno
Linearidade
Mtodo utilizado
tempo de reteno, atravs de
dez injees de uma soluo de
1 %.
calibrao
Avaliao dos coeficientes de
Coeficiente de
correlao das curvas analticas
correlao 0,999
Testes de premissas: outliers,
Aprovao em todos os
normalidade de resduos,
testes: adoo da
independncia de resduos e
regresso linear
homocedasticidade para
ordinria. Caso
definio das regresses
contrrio, regresso
lineares
linear ponderada
Cruzamento entre as curvas de
deteco
previso e analtica119
Limite de
Cruzamento entre as curvas de
quantificao
previso e analtica119
Seletividade
LD 70 % do primeiro
nvel de concentrao
da curva analtica
LQ primeiro nvel de
concentrao da curva
analtica
Obteno dos coeficientes
Comparao com
angulares
mtodo CLAE84
Observao dos cromatogramas

Avaliao em injees da
Estabilidade
aceitao118
Obteno da repetibilidade do
Limite de
Sensibilidade
Critrios de
mesma amostra ao longo do

tempo
Verificao de coeluies
Variao de resultado
2%
Intervalo de
Definio entre o limite de
aplicao (faixa
quantificao e o ltimo ponto
de trabalho)
da curva analtica
Incerteza de
Estimada com base em guias107-
U mxima 20 % do
medio
109
valor determinado
74
4.2.6 Aplicabilidade do mtodo

Aps validao do mtodo, este foi aplicado em amostras de biodiesel
comerciais, com o intuito de se obter informaes acerca do desempenho dos
antioxidantes BHT e TBHQ, a fim de se confirmar o que a literatura tem
reportado, quando usados em biodiesel. A estabilidade oxidao foi medida
utilizando-se o mtodo Rancimat, segundo a norma EN1411216.
75
5. RESULTADOS E DISCUSSO
5.1 Caracterizao dos antioxidantes sintticos

As Figuras 29 e 30 mostram cromatogramas de corrente inica total,
obtidos em modo scan para as solues-estoque dos antioxidantes comerciais,
correspondentes ao TBHQ e ao BHT. J as Figuras 31 a 36 trazem os
espectros de massa obtidos para os principais picos observados nos
cromatogramas de corrente inica total, sempre confrontando com espectros
de massa de referncia indicados pela biblioteca NIST disponvel no software
do equipamento (item 4.1.5.1), com a devida percentagem de similaridade.
Para TBHQ, a somatria das reas dos picos em 9,34 e 6,29 minutos
correspondeu a 98,7 % das reas totais do cromatograma, sendo que 82,4 %
referente ao pico em 9,34 minutos. Para BHT, a soma dos picos em 8,4; 6,86;
8,93 e 9,64 minutos correspondeu a 97,1 % das reas totais do cromatograma,
sendo que 73,5 % referente ao pico em 8,4 minutos.
Figura 29 Cromatograma de corrente inica total obtido no experimento CG-EM para TBHQ
comercial.
76
Figura 30 Cromatograma de corrente inica total obtido no experimento CG-EM

CG
para BHT
comercial.
Figura 31 Espectro de massas para pico em 9,34 minutos

utos no cromatograma da Figura 29
(acima). Espectro referncia do TBHQ (abaixo). Similaridade de 92,8 %.
OH
CH3
CH3
CH3
OH
77
Figura 32 Espectro de massas

massa para pico em 6,29 minutos no cromatograma da Figura 29
(acima). Espectro referncia de quinona precursora do TBHQ (abaixo). Similaridade de 94,7 %.
O H3C
CH3
CH3

massa para pico em 9,64 minutos
(acima). Espectro referncia de derivado de BHT 2,4,6-t-butil-fenol
fenol (abaixo). Similaridade de
92,7 %.
H3C
OH H3C
C 3
CH
CH
H3
H3C
H3C
H3C
CH3
CH3

(acima). Espectro referncia do BHT (abaixo). Similaridade de 92,6 %.
H3C
OH H3C
C 3
CH
CH
H3
H3C
H3C
CH3
78

(acima). Espectro referncia de derivado de BHT 2-t-butil-fenol
95,5%.
OH
CH3
CH3
CH3

(acima). Espectro referncia de derivado de BHT 2-t-butil-fenol
93,7%.
OH
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
As anlises realizadas por CG-EM

CG EM indicaram que os antioxidantes
sintticos comerciais obtidos contm apenas TBHQ,
TBHQ, BHT e seus derivados,
derivados
conforme suas estruturas
estrutura demonstram.. Nos espectros de massa, no foram
detectados compostos que fossem interferentes na atividade antioxidante ou de
natureza diferente de TBHQ e BHT. Portanto, o uso analtico desses
antioxidantes comerciais, tal como so comercializados aos produtores de
biodiesel,
odiesel, permite a anlise do produto que de fato adicionado ao biodiesel
em seu processo produtivo, possibilitando que a metodologia proposta venha a
79
quantificar o antioxidante como um todo, monitorando sua concentrao aps a
aditivao, e no somente um composto especfico isolado.
5.2 Desenvolvimento do mtodo proposto

As Figuras 37 a 39 ilustram cromatogramas obtidos quando do
desenvolvimento do mtodo. Cabe destacar que os cromatogramas indicam
que pelo menos para TBHQ e BHT, os tempos de reteno observados para os
compostos de interesse no coincidiram com tempos de reteno de glicerol ou
de 1,2,4-butanotriol. Este ltimo padro interno na anlise de glicerol98-99.
Conseqentemente, a metodologia poderia em princpio ser utilizada
simultaneamente para anlise de glicerol livre e glicerol total. Certamente, em
caso de antioxidante que venha a apresentar co-eluio, deve-se rever o uso
da metodologia para o referido antioxidante.
Figura 37 Cromatograma obtido para amostra de biodiesel livre de antioxidantes, com o

glicerol e o butanotriol devidamente identificados.
80
Figura 38 Cromatograma obtido para amostra de biodiesel fortificada com 6587 mg/kg de
TBHQ.
Figura 39 Cromatograma obtido para amostra de biodiesel fortificada com 2254 mg/kg de
BHT.
pA
Tempo (min)
81
5.3 Otimizao do mtodo

Nos cromatogramas inicialmente obtidos, percebeu-se que o formato do
pico de interesse era diferente, quando da corrida com a amostra em relao
s corridas das solues de calibrao. O formato do pico nas corridas das
solues de calibrao era mais apropriado para uma anlise quantitativa, pois
nas corridas com amostras o pico se apresentava mais alargado (Figura 40).
Mesmo que a quantificao utilizando os valores de rea devido integrao
automtica do software tenha ficado satisfatria, uma investigao acerca da
diferena no formato era necessria, e resultados de quantificao de
antioxidantes obtidos at ento foram desconsiderados.
Em linhas gerais, em cromatografia gasosa, quando se utilizam reaes
de silanizao, a efetividade da reao pode ser verificada pelo formato do pico
esperado. Logo, foram levantadas varveis que pudessem afetar a reao de
silanizao, em especial na presena de amostra. Como j explicado
anteriormente, a amostra de biodiesel possui outros compostos silanizveis, o
que poderia causar uma concorrncia na reao, onde os compostos
naturalmente presentes no biodiesel teriam uma preferncia em sofrer a
silanizao em detrimento dos compostos antioxidantes. Na literatura,
constatado que quando do uso de silanizao em leos, realizada
previamente uma extrao dos compostos fenlicos de interesse, para
minimizar interferncias de componentes do leo115. No caso do biodiesel, em
se considerando que compostos como glicerol e derivados de glicerol esto
presentes em concentraes mximas individuais de 10000 mg/kg, e que os
antioxidantes tm sido determinados entre 900 e 5000 mg/kg (em biodiesel)8587
, poder-se-ia imaginar que efetivamente o glicerol e seus derivados
interfeririam na reao. Porm, o agente derivatizante (MSTFA) adicionado

em excesso, 100 L para 100 mg de amostra. Esta quantidade, em princpio,
deveria garantir a silanizao de todas as espcies silanizveis da amostra.
Fatores como temperatura, cintica e estereoqumica tambm podem influir no
direcionamento de reaes de silanizao quando existem muitas espcies
82
silanizveis114. Mas, segundo a literatura, o fator de maior interferncia na
efetividade da reao a presena de teores de gua113-115.
Sabe-se que o biodiesel, ao contrrio de combustveis derivados de
petrleo, tende a ser muito mais higroscpico, logo, certo teor de gua em uma
amostra, como por exemplo, 1000 mg/kg, em uma amostra de leo diesel fssil
causa turbidez bem visvel, enquanto que o mesmo teor em biodiesel no
percebido apenas pelo aspecto de uma amostra, ficando esta quantidade de
gua dissolvida1. Como o mtodo foi testado com amostras comerciais de
biodiesel, mesmo quando fortificadas com antioxidantes (neste caso, foram
utilizadas amostras de biodiesel de gordura animal, sem adio de antioxidante
sinttico no processo, conforme informao da usina produtora), verificou-se
ento o teor de gua total de amostras at ento processadas durante o
mtodo, utilizando-se mtodo descrito na norma tcnica ASTM D6304117. Os
dados obtidos esto na Tabela 13. Observou-se que o teor de gua das
amostras utilizadas at ento estava acima do permitido na especificao da
ANP14 (mximo de 350 mg/kg) em todos os casos, o que pode estar
relacionado a condies de armazenamento do biodiesel. Isso indicou que
existia uma limitao metodologia proposta, que seria o teor de gua das
amostras a serem analisadas. Esse fator, apenas pelo cromatograma seria de
difcil elucidao porque a gua invisvel a um detector DIC.
Aps os resultados dos teores de gua obtidos, um novo conjunto de
amostras, desta vez com um teor de gua conforme a especificao da ANP na
poca (na oportunidade, o limite especificado era de 500 mg/kg)120, foi
providenciado para posterior verificao dos formatos dos picos. Isso indicaria
se realmente a gua presente em teores considerados altos estava interferindo
de fato na reao de silanizao dos compostos de interesse. A tabela 14 traz
os resultados dos teores de gua obtidos pelo mesmo mtodo usado. A Figura
40 tambm ilustra o formato do pico observado no cromatograma para uma
dessas amostras, onde foi observada melhor definio do pico.
83
TABELA 13 TEOR DE GUA NAS AMOSTRAS UTILIZADAS INICIALMENTE NO
DESENVOLVIMENTO DA METODOLOGIA
Teor de gua
encontrado
(mg/kg)
982
754
Caracterstica da
amostra
Fortificada com 1500
mg/kg de antioxidante
Reprodutibilidade do
mtodo ASTM D6304 para
o valor referido (mg/kg)
105
90
Amostra comercial,
680
quantificada com 1275
85
Padro de referncia
195
NIST 2772 certificado

com (180 20) mg/kg de
39
gua
Aps isso, optou-se por trabalhar apenas com amostras que

atendessem a especificao da poca para teor de gua - 500 mg/kg. No
foram observados desvios significativos nos resultados de teor de gua, e para
a garantia da qualidade desses resultados foi utilizado padro de referncia
NIST 2772, cuja matriz um biodiesel de soja, com valor certificado para teor
de gua (amostra 4 da Tabela 13).
84
Figura 40 Regio de cromatograma com destaque para o pico correspondente ao
antioxidante TBHQ, para amostra de biodiesel com 982 mg/kg de teor de gua (azul) e 509
mg/kg de gua (vermelho).
TABELA 14 TEOR DE GUA PARA O NOVO CONJUNTO DE AMOSTRAS
Teor de gua
encontrado
(mg/kg)
509
425
Caracterstica da
amostra
Reprodutibilidade do mtodo
ASTM D6304 para o valor
referido (mg/kg)
71
64
Amostra comercial,
487
69
Amostra comercial,
396
61
Amostra comercial,
441

65
85
5.4 Validao do mtodo

A Tabela 12 apresenta um resumo do protocolo de validao adotado
para o mtodo em questo. J a tabela 15 traz os resultados obtidos quando
da aplicao do referido protocolo.
5.4.1 Exatido
A menor recuperao foi de 92 %, e a maior, de 106 %. Esses
resultados de recuperao foram considerados satisfatrios, tendo em vista
que genericamente aceita a faixa que vai de 70 % a 120 %102. O nmero de
replicatas utilizado foi de apenas uma, visando a uma maior estimativa de
incerteza, como tratado quando da discusso deste parmetro.
5.4.2 Preciso
Os valores obtidos foram tambm considerados satisfatrios, atendendo
ao critrio de aceitao de coeficiente de variao 1,0 %.
5.4.3 Fidelidade Repetibilidade de reas

O valor obtido para a repetibilidade das reas dos picos de TBHQ e BHT
ficou bastante aceitvel, visto que os valores de desvio-padro de 2,95 e 2,16
unidades de rea corresponderam a um coeficiente de variao de 1,0 % e 0,8
%, respectivamente.
5.4.4 Fidelidade Repetibilidade de tempos de reteno

Neste parmetro, da mesma forma que o anterior, obtiveram-se dados
ainda melhores 0,004 minutos de desvio-padro corresponderam a um
coeficiente de variao de 0,06 %.
86
TABELA 15 RESULTADOS DA VALIDAO
Parmetro
Resultado obtido para
Resultado obtido para
antioxidante TBHQ
antioxidante BHT
98 % (para 2158 mg/kg)
106 % (para 2341 mg/kg)

92 % (para 3487 mg/kg)
Exatido
103 % (para 3364 mg/kg)
94 % (para 5422 mg/kg)

93 % (para 5247 mg/kg)
0,33 %
0,14 %
Coeficiente de variao de
Repetibilidade de
1,0 % (para soluo de
reas
calibrao 3, preparada
conforme Tabela 8)
conforme Tabela 8)
conforme Tabela 8)
conforme Tabela 8)
Linearidade
0,999 (r mnimo obtido)
0,999 (r mnimo obtido)
Limite de
0,0054 mg (equivale a 54
deteco
mg/kg)
mg/kg)
Limite de
quantificao
mg/kg)
mg/kg)
535 (menor coeficiente
543 (menor coeficiente
angular obtido)
angular obtido)
Seletividade
Estabilidade
18h
18h
108-8248 mg/kg
536-8124 mg/kg
Incerteza de
Dados relatados no item
Dados relatados no item
medio
5.5
5.5
Preciso
Repetibilidade de
tempos de
reteno
Sensibilidade
Intervalo de
aplicao
87
5.4.5 Linearidade
Neste caso, verificaram-se os coeficientes de correlao (r) obtidos, que
apresentaram valores com, no mnimo, trs noves aps a vrgula. Porm, a
regresso linear primeiramente utilizada consistiu no uso de MMQO (Mtodo
dos Mnimos Quadrados Ordinrio). Segundo a literatura o uso do MMQO para
uma regresso linear diretamente a partir dos dados de resposta instrumental
(no caso do presente mtodo, as reas dos picos correspondentes) versus o
valor de entrada conhecido (no caso do presente mtodo, a massa de
antioxidante, em miligramas) uma aproximao, e que pode resultar em erros
sistemticos119. Assim sendo, foi verificado se realmente o uso do MMQO era o
mais adequado para obteno de curva analtica para ser usada na
quantificao de amostra com teor de antioxidante desconhecido.
Primeiramente, devem ser procedidos testes estatsticos para a
verificao de outliers, que so dados que devem ser descartados por serem
considerados discrepantes em relao ao conjunto; em seguida, os dados
devem ser submetidos ao teste de normalidade de resduos, para verificar se
os resduos dos dados seguem uma curva normal. Os resduos so definidos
como a diferena dos valores previstos pela suposta curva analtica por MMQO
para cada nvel de concentrao e os valores reais para cada nvel. Caso os
resduos no sigam uma normal, o MMQO j no deve ser formalmente
utilizado121.
Caso de fato os resduos sigam uma normal, o teste de independncia
de resduos deve ser aplicado, para verificao de tendncias entre os
resduos. Caso haja dependncia, ou correlao claramente existente, o
MMQO
tambm
no
deve
ser
utilizado;
finalmente,
teste
de
homocedasticidade deve ser procedido, para verificao da homogeneidade

das varincias obtidas em cada nvel de concentrao (que a condio de
homocedasticidade propriamente dita) quando da leitura das solues de
calibrao. A condio de homocedasticidade necessria para aplicao do
MMQO. Pode-se observar graficamente uma condio de heterocedasticidade
(ausncia de homocedasticidade), atravs do grfico de resduos. Se os
88
resduos
estiverem
distribudos
de
forma
aleatria,
teste
de
homocedasticidade deve ser necessariamente aplicado, para a dissipao de

dvida. Caso pelo grfico de resduos j exista uma tendncia clara, a condio
de heterocedasticidade praticamente certa, e a realizao dos testes apenas
confirma a constatao visual. As Figuras 41 e 42 ilustram grfico de resduos
obtidos para TBHQ e BHT, respectivamente. Curiosamente, para o primeiro, foi
observada clara heterocedasticidade, pois as varincias dos resduos tenderam
a diminuir quando do aumento da massa de antioxidante. J para o segundo, a
distribuio dos resduos ficou bem aleatria, de forma que alguma concluso
s foi possvel com a aplicao dos testes estatsticos mencionados.
Figura 41 Grfico de resduos obtido para TBHQ.

8,00E+00
6,00E+00
4,00E+00
Resduos
2,00E+00
0,00E+00
0
0,2
0,4
0,6
0,8
-2,00E+00
-4,00E+00
-6,00E+00
-8,00E+00
massa de antioxidante (mg)
Resduos TBHQ
89
Figura 42 Grfico de resduos obtido para BHT.
2,00E+01
1,50E+01
Resduos
1,00E+01
5,00E+00
0,00E+00
-5,00E+00
0,2
0,4
0,6
0,8
Resduos BHT
-1,00E+01
-1,50E+01
-2,00E+01
As frmulas aplicadas em todos os testes na etapa de linearidade

encontram-se em anexo neste trabalho. O teste de outliers escolhido foi o teste
de Jacknife, ou do resduo padronizado, que faz uma estimativa se o resduo
individualizado apresenta uma disperso consideravelmente maior que a do
conjunto, recomendando nesse caso sua excluso121. Cabe observar que ao
todo so 15 resduos obtidos, pois em cada um dos cinco nveis foram feitas
leituras em triplicata. As Tabelas 16 e 17 ilustram a obteno de dados nesse
teste. No foi verificado nenhum outlier nos dados obtidos, visto que Jei
TABELA 16 TESTE JACKNIFE PARA TBHQ
Pontos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
xi
0,16496
0,16496
0,16496
0,32992
0,32992
0,32992
0,49488
0,49488
0,49488
0,65984
0,65984
0,65984
0,82480
0,82480
0,82480
yi
95,2
96,4
96,9
195,2
195
195,3
276,5
278,1
279
364,8
366,3
364,6
452,9
452,8
453,1
ei
-5,55E+00
-4,35E+00
-3,85E+00
6,09E+00
5,89E+00
6,19E+00
-9,73E-01
6,27E-01
1,53E+00
-1,03E+00
4,67E-01
-1,23E+00
-1,29E+00
-1,39E+00
-1,09E+00
Jei
-1,772
-1,324
-1,154
1,847
1,770
1,887
-0,257
0,165
0,404
-0,278
0,125
-0,332
-0,369
-0,398
-0,312
ri
-1,642
-1,287
-1,139
1,697
1,641
1,725
-0,266
0,172
0,418
-0,288
0,130
-0,344
-0,382
-0,412
-0,323
hi
0,200
0,200
0,200
0,100
0,100
0,100
0,067
0,067
0,067
0,100
0,100
0,100
0,200
0,200
0,200
90
TABELA 17 TESTE JACKNIFE PARA BHT
Pontos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
xi
0,16248
0,16248
0,16248
0,32496
0,32496
0,32496
0,48744
0,48744
0,48744
0,64992
0,64992
0,64992
0,81240
0,81240
0,81240
yi
225,1
224,7
224,3
436,9
439
438,6
638,2
639,3
637,6
883,4
882,7
889,7
1086,2
1085,2
1088,5
ei
4,67E+00
4,27E+00
3,87E+00
-6,30E-01
1,47E+00
1,07E+00
-1,64E+01
-1,53E+01
-1,70E+01
1,17E+01
1,10E+01
1,80E+01
-2,62E+00
-3,62E+00
-3,20E-01
Jei
0,479
0,437
0,395
-0,060
0,141
0,103
-1,726
-1,585
-1,806
1,182
1,103
1,984
-0,267
-0,370
-0,033
ri
0,493
0,451
0,409
-0,063
0,147
0,107
-1,608
-1,500
-1,667
1,164
1,094
1,792
-0,277
-0,383
-0,034
hi
0,200
0,200
0,200
0,100
0,100
0,100
0,067
0,067
0,067
0,100
0,100
0,100
0,200
0,200
0,200
crtico para 15 dados de 2,179 em um nvel de confiana de 95 %. Para

TBHQ, o maior Jei foi de 1,725 e para BHT foi de 1,984.
Para o teste de normalidade de resduos, foi escolhido o teste de RyanJoiner, que faz uma distribuio crescente dos resduos e verifica se existe
tendncia de normalidade121. As Tabelas 18 e 19 trazem os dados obtidos
quando da aplicao deste teste. Os valores de R calculados foram de 0,9502
e 0,9691 para TBHQ e BHT respectivamente. Para um nmero de 15 resduos,
o R crtico de 0,9383 para um nvel de confiana de 95 %. Neste teste, para
que exista tendncia de normalidade, o R calculado deve ser maior que o R
crtico.
Para verificao da independncia de resduos, foi utilizado o teste de
Durbin-Watson, que avalia tal independncia a partir da diviso das somas
quadrticas das diferenas entre os resduos adjacentes e dos prprios
resduos121. As Tabelas 20 e 21 ilustram os dados obtidos neste teste para
TBHQ e BHT respectivamente, e as Figuras 43 e 44 trazem o grfico referente
a este teste, onde pode-se visualmente constatar a independncia ou no entre
os resduos.
91
TABELA 18 TESTE RYAN-JOINER PARA TBHQ

Pontos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
pi
0,0410
0,1066
0,1721
0,2377
0,3033
0,3689
0,4344
0,5000
0,5656
0,6311
0,6967
0,7623
0,8279
0,8934
0,9590
qi
-1,7394
-1,2450
-0,9458
-0,7137
-0,5150
-0,3349
-0,1651
0,0000
0,1651
0,3349
0,5150
0,7137
0,9458
1,2450
1,7394
ei
-5,55E+00
-4,35E+00
-3,85E+00
-1,39E+00
-1,29E+00
-1,23E+00
-1,09E+00
-1,03E+00
-9,73E-01
4,67E-01
6,27E-01
1,53E+00
5,89E+00
6,09E+00
6,19E+00
TABELA 19 TESTE RYAN-JOINER PARA BHT

Pontos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
pi
0,0410
0,1066
0,1721
0,2377
0,3033
0,3689
0,4344
0,5000
0,5656
0,6311
0,6967
0,7623
0,8279
0,8934
0,9590
qi
-1,7394
-1,2450
-0,9458
-0,7137
-0,5150
-0,3349
-0,1651
0,0000
0,1651
0,3349
0,5150
0,7137
0,9458
1,2450
1,7394
ei
-1,70E+01
-1,64E+01
-1,53E+01
-3,62E+00
-2,62E+00
-6,30E-01
-3,20E-01
1,07E+00
1,47E+00
3,87E+00
4,27E+00
4,67E+00
1,10E+01
1,17E+01
1,80E+01
92
TABELA 20 TESTE DE DURBIN-WATSON PARA TBHQ
Pontos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
ei
-5,55E+00
-4,35E+00
-3,85E+00
6,09E+00
5,89E+00
6,19E+00
-9,73E-01
6,27E-01
1,53E+00
-1,03E+00
4,67E-01
-1,23E+00
-1,29E+00
-1,39E+00
-1,09E+00
ei-1
ei - ei-1
-5,5533
-4,3533
-3,8533
6,0867
5,8867
6,1867
-0,9733
0,6267
1,5267
-1,0333
0,4667
-1,2333
-1,2933
-1,3933
1,20E+00
5,00E-01
9,94E+00
-2,00E-01
3,00E-01
-7,16E+00
1,60E+00
9,00E-01
-2,56E+00
1,50E+00
-1,70E+00
-6,00E-02
-1,00E-01
3,00E-01
Para TBHQ, o teste foi conclusivo, verificando correlao positiva entre

os resduos, ou seja, no foi observada independncia, pois o valor de d
calculado foi 0,8986, sendo o d crtico 1,08 para 15 resduos. Para BHT, o teste
foi inconclusivo, pois o d calculado obtido foi de 1,1317, maior que o d crtico,
porm menor que 1,36; valor mnimo para comprovar a independncia entre os
resduos. Sendo assim, para TBHQ o uso do MMQO foi considerado
inadequado segundo este teste.
TABELA 21 TESTE DE DURBIN-WATSON PARA BHT
Pontos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
ei
4,67E+00
4,27E+00
3,87E+00
-6,30E-01
1,47E+00
1,07E+00
-1,64E+01
-1,53E+01
-1,70E+01
1,17E+01
1,10E+01
1,80E+01
-2,62E+00
-3,62E+00
-3,20E-01
ei-1
ei - ei-1
4,6667
4,2667
3,8667
-0,6300
1,4700
1,0700
-16,4267
-15,3267
-17,0267
11,6767
10,9767
17,9767
-2,6200
-3,6200
-4,00E-01
-4,00E-01
-4,50E+00
2,10E+00
-4,00E-01
-1,75E+01
1,10E+00
-1,70E+00
2,87E+01
-7,00E-01
7,00E+00
-2,06E+01
-1,00E+00
3,30E+00
93
Figura 43 Grfico de Durbin-Watson para TBHQ.
ei-1
ei
Figura 44 Grfico de Durbin Watson para BHT.

ei-1
ei
Nos grficos das Figuras 43 e 44, porm, tal visualizao no ficou simples de
ser observada. Para BHT, o teste de homocedasticidade ainda era crtico para
formalmente adotar o MMQO ou no para uma regresso linear. Para tal
verificao, foi escolhido o teste de Brown-Forsythe, que avalia a varincia dos
resduos com base na diviso em dois grupos e a disperso em relao
mediana dos grupos121. Os dados obtidos neste teste para BHT esto na
Tabela 22. Foi comprovada homocedasticidade, pois o valor p obtido (0,37) foi
maior que o p crtico (0,05) para um nvel de confiana de 95 %. Sendo assim,
utilizou-se regresso pelo MMQO para BHT.
94
TABELA 22 TESTE DE BROWN-FORSYTHE PARA BHT

e1j
4,67E+00
4,27E+00
3,87E+00
-6,30E-01
1,47E+00
1,07E+00
-1,64E+01
-1,53E+01
e2j
-1,70E+01
1,17E+01
1,10E+01
1,80E+01
-2,62E+00
-3,62E+00
-3,20E-01
| d1 |
3,40E+00
3,00E+00
2,60E+00
1,90E+00
2,00E-01
2,00E-01
1,77E+01
1,66E+01
| d2 |
1,67E+01
1,20E+01
1,13E+01
1,83E+01
2,30E+00
3,30E+00
0,00E+00
Para TBHQ, os dados obtidos ento foram utilizados em uma regresso

por MMQP (Mtodo dos Mnimos Quadrados Ponderado), ou seja, uma
regresso ponderada, que leva em considerao o desvio-padro de cada nvel
individualmente, e os nveis de menor desvio-padro possuem maior
contribuio para a obteno dos coeficientes angular e linear da equao da
regresso linear. A Figura 45 ilustra curva analtica obtida por essa regresso.
As frmulas para obteno dos coeficientes a partir de MMQP assim como pelo
MMQO se encontram em anexo a este trabalho. O coeficiente de correlao
encontrado foi de 0,9995, atendendo ao critrio de aceitao, e para BHT,
usando MMQO, foi o mesmo, e a curva analtica obtida encontra-se na Figura
45. As curvas limite de previso superior (LPS) e inferior (LPI) tambm esto
ilustradas. Estas foram utilizadas para clculo dos limites de quantificao e
deteco, conforme discutido a seguir. Na figura 45, so ainda indicadas nos
grficos as posies do centroide e do baricentro. O primeiro corresponde ao
ponto mdio tanto para as variveis de entrada do eixo x quanto para o ponto
mdio das respostas instrumentais (eixo y). J o segundo corresponde ao
ponto em teoria onde as curvas LPI e LPS mais se aproximam da curva
analtica. Sua posio em relao ao eixo x dada pela equao 2.

(2)
Onde:
XB a posio do baricentro em relao ao eixo x.
95
xi a varivel de entrada individual no eixo x.
wi dado pela equao 3.

$
!"
(3)
Onde:
syi o desvio-padro da resposta instrumental em um nvel.
p o nmero de leituras de solues de calibrao por nvel.
Figura 45 Curva analtica obtida por MMQP para TBHQ.
500
y = 522,13x + 22,359
R = 0,9992
450
Curva analtica
reas de pico de TBHQ
400
LPI 95%
350
LPS 95%
300
Baricentro
250
Centride
200
Linear (Curva analtica)
150
Linear (LPI 95%)
100
Linear (LPS 95%)
50
y = 523,43x + 19,545
R = 0,9999
0
0
0,2
0,4
0,6
Massa de antioxidante (mg)
0,8
y = 520,84x + 25,173
R = 0,9999
96
Figura 46 Curva analtica obtida por MMQO para BHT.
500
450
rea do pico de BHT
400
350
y = 535,65x + 12,393
R = 0,9992
300
Curva analtica
250
Curva LPS
200
150
Curva LPI
100
Linear (Curva
analtica)
50
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
y = 535,65x + 25,201
R = 1
y = 535,65x - 0,4146
R = 1
5.4.6 Limite de Deteco

Utilizou-se aqui mtodo do cruzamento das curvas de previso e
analtica119. Este mtodo est ilustrado na Figura 47. Na prtica, a curva limite
de previso superior prolongada at interceptar o eixo y. Este ponto ento
rebatido na curva analtica, e o ponto obtido por esta operao no eixo x
corresponde ao limite de deteco.
As curvas limites de previso (CLP) e limite de confiana (CLC) so
traadas para verificao grfica de quanto que a disperso da resposta
instrumental para cada padro da curva analtica contribui para uma maior ou
menor confiabilidade da regresso linear ao longo da faixa de trabalho.
97
Figura 47 Utilizao do mtodo do cruzamento das curvas de previso e analtica, para a
obteno dos limites de deteco e quantificao.
500
450
400
Curva analtica
350
Curva limite de
previso superior
rea
300
250
Curva limite de
previso inferior
200
150
Linear (Curva
analtica)
100
50
0
0
LD LQ
0,2
0,4
0,6
0,8
Quanto mais prximas da curva analtica graficamente, maior a

preciso dos dados obtidos experimentalmente. Considerando uma resposta
instrumental que esteja acima do ponto do eixo y que interceptado pela curva
limite de previso superior com 95 % de confiana, h apenas 2,5 % de chance
desta resposta instrumental ser um branco ou um rudo119.
Para a obteno das curvas limites de previso, deve-se traar uma
regresso por MMQO entre as variveis de entrada conhecidas no eixo x (no
caso, massas de antioxidantes), e no eixo y devem ser usados valores
calculados conforme equao 4.
3 /89 : 3 3 : 2 <=>8?, AB : 3 B
%&' ()*+) , -./ %;123 456
*

C

Onde:
YPI o valor do ponto do eixo y na curva LPI.
(4)
98
yicalc a resposta instrumental estimada pela equao de regresso dos dados
originais por MMQO.
t95 %;n-2 o t de student para 95 % de confiana e n-2 graus de liberdade.
n o nmero de nveis da curva analtica (no caso, 5).
sres dado pela equao 5.
sa dado pela equao 6.
sb dado pela equao 7.
cov(a,b) a co-varincia entre o coeficiente angular a e linear b da regresso
linear.
C
56 4
$ D E $ D*$

$ D3*C 23C E 2 3* E

23
(5)
Onde:
m o nmero de leituras totais (no caso, 15).
yi a resposta instrumental individual.
* 56 !F/G
(6)
Onde:
Sxx dado pela equao 8.
C 56 4
$
HII
G F 3 , 8 B3
(7)
(8)
Para obteno dos valores do eixo y da curva LPS, basta trocar o sinal
de diferena da equao 4 pelo de soma. J para a obteno das curvas
limites de confiana, deve-se traar uma regresso por MMQO entre as
99
variveis de entrada conhecidas no eixo x, assim como nas curvas LP, e no
eixo y devem ser usados valores conforme equao 9.
%J' ()*+) , -./ %;123 43 *3 : 2 <=>8?, AB : C3
(9)
Onde:
YCI o valor do ponto do eixo y na curva LCI (Limite de Confiana Inferior).
Para obteno dos valores do eixo y da curva LCS (Limite de Confiana
Superior), basta trocar o sinal de diferena da equao 9 pelo de soma. Na
literatura, usam-se as curvas LCS e LCI para clculo de LD e LQ119. Porm,
optou-se por utilizar as curvas LPI e LPS, por englobarem a variao da
resposta instrumental da amostra. O uso de LPI e LPS conduzem a LD e LQ
mais conservadores, com valores mais altos122.
Porm, como j exposto no item relativo linearidade, para o
antioxidante TBHQ foi realizada regresso segundo MMQP. Para esse tipo de
regresso, o clculo de LD e LQ sofre uma alterao, quando se usam curvas
LP. Isso porque, como j comentado, levada em conta a variao da resposta
instrumental, e quando do uso de MMQP no se pode prever tal variao pela
equao 4, simplesmente porque os coeficientes a e b da equao 2 so
obtidos por MMQO. Sendo assim, necessria outra previso da variao da
resposta instrumental, em funo da varivel de entrada do eixo x119. Para esta
previso, foi utilizada uma regresso polinomial entre o desvio-padro das
respostas instrumentais e as variveis de entrada do eixo x, e com base na
equao dessa regresso, possvel prever uma variao da resposta
instrumental de amostra. A Figura 48 mostra o grfico desta regresso para
TBHQ.
Com base na equao de regresso do grfico da Figura 48, pode-se
utilizar a equao 10 para a obteno de YPI.
%&' ()*+) , -./ %;123 48241,74M , 520,75O : 384,663 , 111,82 : 11,01B3 : *3 3 : 2<=>8?, AB : C3
(10)
100
Figura 48 Relao entre os desvios-padro das reas e a massa de antioxidante para TBHQ.
1,6
Desvio-padro das reas
1,4
y = 241,74x4 - 520,75x3 + 384,66x2 - 111,82x +

11,01
R = 1
1,2
1
0,8
Devios-padro de reas
para TBHQ
0,6
Polinmio (Devios-padro
de reas para TBHQ)
0,4
0,2
0
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Massa de antioxidante (mg)
Como a regresso linear para a obteno dos coeficientes angular e

linear a e b diferente, os parmetros descritos nas equaes de 4 a 9
consequentemente tambm so diferentes, e para uma regresso por MMQP
so calculados conforme equaes de 11 a 13.
* 4 H
(11)
C 4
(12)

II
$
HII
G 3 , 8 B3
(13)
Finalmente, aplicando-se o rebatimento ilustrado na Figura 47 para a

obteno do LD, para TBHQ, usando os valores evidenciados na Figura 45,
tem-se o valor de 0,0054 mg de antioxidante. Considerando-se 100 mg de
amostra, essa massa equivale a um biodiesel com 54 mg/kg de antioxidante
TBHQ. Para BHT, usando os valores evidenciados na Figura 45, tem-se o valor
101
de 0,0268 mg de antioxidante. Com a mesma considerao, essa massa
equivale a um biodiesel com 268 mg/kg de antioxidante BHT.
Aps observar a considervel diferena entre os limites de deteco
para BHT e TBHQ, considerou-se simular uma regresso de MMQO para
TBHQ, com o intuito de verificar se tal diferena seria mantida. Feito isso, foi
calculado um LD de 0,0239 mg de antioxidante. Logo, percebe-se que a
mudana do modelo de regresso, de MMQO para MMQP influenciou
consideravelmente nos levantamentos desses parmetros de validao do
mtodo. De qualquer forma, a obteno de LD para os dois antioxidantes
satisfez o critrio de aceitao da Tabela 12, de LD 70 % do primeiro nvel da
curva analtica.
5.4.7 Limite de quantificao

Seguindo o mesmo mtodo, o ponto encontrado no intercepto da curva
LPS no eixo y, rebatido desta vez na curva LPI, e o ponto obtido por esta
operao no eixo x o limite de quantificao. A Figura 47 ilustra a obteno
do limite de quantificao. Para TBHQ, foi calculado um LQ de 0,0108 mg de
antioxidante e para BHT, um LQ de 0,0536 mg. Da mesma forma que no LD,
foram levantados dados de LQ simulando uma regresso MMQO tambm para
o TBHQ. A Tabela 23 traz um resumo dos resultados de LDs e LQs calculados.
Mesmo que a diferena observada entre os limites obtidos com uso de MMQP
e uso de MMQO tenham se mostrado grandes, interessante observar que em
todos os casos o critrio de aceitao foi satisfeito.
TABELA 23 LIMITES DE DETECO E QUANTIFICAO
TBHQ
Parmetros/antioxidantes
TBHQ
BHT
com
MMQO
Satisfaz critrio
de aceitao?
LD (mg)
0,0054 0,0268
0,0239
Sim
LQ (mg)
0,0108 0,0536
0,0478
Sim
Aps
levantamento
desses
parmetros,
amostras
isentas
de
antioxidantes sintticos foram fortificadas com os antioxidantes disponveis em
102
nveis de concentrao prximos aos limites propostos na Tabela 23, para a
confirmao desses valores tericos. Os resultados encontram-se na Tabela
24, j considerando uma massa de amostra de 100 mg, resultando em limites
em mg/kg. J a Tabela 25 informa as recuperaes dos valores lidos em
relao aos valores de fortificao, aqui sendo considerados como VVC (Valor
Verdadeiro Convencional).
TABELA 24 QUANTIFICAO DE AMOSTRAS COM CONCENTRAO PRXIMA AO LD
E AO LQ. CONCENTRAES EM mg/kg
Concentraes
Amostra 1
Amostra 2
(Com
(Com
TBHQ)
TBHQ)
54
LD terico
Concentrao de
fortificao
Concentrao de
leitura
LQ terico
Concentrao de
fortificao
Concentrao de
leitura
Amostra 3
Amostra 4
(Com BHT)
(Com BHT)
54
268
268
60
62
195
289
69
75
241
324
108
108
536
536
125
98
494
554
138
109
484
561
TABELA 25 RECUPERAES PARA CONCENTRAES PRXIMAS AO LQ
Amostras
Valor obtido (mg/kg) VVC Recuperao em relao ao VVC
Amostra 1
138
125
110,4
Amostra 2
109
98
111,2
Amostra 3
484
494
98,0
Amostra 4
561
554
101,3
Utilizando o mesmo critrio de aceitao do parmetro de exatido, foi

verificado que os resultados obtidos pelas anlises foram satisfatrios, mesmo
trabalhando em uma faixa prxima ao LQ. Assim como o LD, os LQs obtidos
103
tambm satisfazem o critrio de aceitao da Tabela 12, de LQ primeiro nvel
da curva analtica.
5.4.8 Sensibilidade
A Tabela 26 traz uma comparao entre os coeficientes angulares

obtidos, pelas regresses lineares realizadas e aquelas disponveis por mtodo
por CLAE84.
TABELA 26 COMPARAO DOS COEFICIENTES ANGULARES
Mtodo
TBHQ
BHT
CLAE84
5292,4
3052,3
Proposto
522,13
535,65
Mesmo verificando uma menor sensibilidade do mtodo proposto em

relao ao mtodo por CLAE, deve-se observar que em tal mtodo no foi
trabalhada a mesma faixa de trabalho (no mtodo por CLAE, a faixa vai de 80 a
400 mg/kg para TBHQ e 80 a 530 mg/kg para BHT)84. Logo, a comparao da
sensibilidade neste caso foi inconclusiva.
5.4.9 Seletividade
Este parmetro foi avaliado de forma qualitativa, pois ao interpretaremse os cromatogramas, verificou-se que os compostos de interesse no eluem
na regio do glicerol livre, e tambm no eluem na regio dos steres,
componentes majoritrios do biodiesel, como ilustrado nas Figuras 37 a 39.
5.4.10 Estabilidade
Para a definio deste parmetro, foram feitas injees da mesma
amostra ao longo do tempo a fim de se verificar quando havia uma variao de
pelo menos 2 % da concentrao medida. Aps este perodo, uma nova curva
104
analtica deveria ser levantada. Como o mtodo no utilizou padro interno
esperava-se que este perodo de estabilidade no fosse longo. A Tabela 27
traz os resultados obtidos para a definio deste parmetro, assim como a
figura 49, que traz o grfico, que a partir do qual se estimou um valor mximo
para a estabilidade. Os dados de Estabilidade demonstraram que, sem dvida,
com 24 horas aps o tempo inicial, dever-se-ia reinjetar a curva analtica
considerando o limite de variao de 2 %. Devido limitao de tempo, optouse por estimar o limite de 18 horas, conservadoramente.
TABELA 27 ESTIMATIVA DA ESTABILIDADE
Tempo ( horas)
10
24
30
Concentrao (mg/kg) 2341 2352 2344 2355 2332 2288 2279
Figura 49 A linha vermelha indica o limite de variao na estabilidade de 2 %; A linha verde

indica o limite de estabilidade adotado conservadoramente.
Concentrao de antioxidante (mg/kg)
Estimativa da Estabilidade
2359
2349
2339
2329
Valores
2319
Limte estimado
2309
2299
2289
2279
0
10
15
Tempo (h)
20
25
30
105
5.4.11 Intervalo de aplicao

A definio deste parmetro ficou definida como o intervalo entre o limite
de quantificao e o ltimo ponto da curva analtica. Isto implica em um
intervalo entre 108 mg/kg e 8248 mg/kg, para o antioxidante TBHQ. Para BHT,
o intervalo ficou entre 536 mg/kg e 8124 mg/kg.
5.5 Incerteza de medio

A incerteza de medio foi estimada com diretrizes do Guia
Eurachem:Citac Relacre109, que um guia de estimativa de incertezas
analticas baseado no ISO GUM Uncertainty Guide108, e no Guia Eurachem:
CITAC107 especfico para ensaios qumicos, e de divulgao europia. A etapa
inicial do levantamento da incerteza de medio a considerao de todas as
fontes de incerteza (que, por definio, so desvios-padro) passveis de
influenciar no resultado da medio, atravs do levantamento da equao do
mensurando (equao 1, j mencionada no item 4.2.2) e posteriormente, do
diagrama de Ishikawa (Figura 50).
10

(1)
Onde:
C a concentrao de antioxidante na amostra de biodiesel, em mg/kg.
mant a massa de antioxidante, obtida pela regresso linear, em miligramas.
mbiod a massa de biodiesel, obtida na pesagem, em miligramas.
106
Figura 50 Diagrama de Ishikawa para a metodologia proposta LEGENDA. A: Regresso linear; B: Massa de amostra; C: Incerteza de uma pesagem,
engloba resoluo, calibrao, deriva e excentricidade; D: Repetibilidade; E1 a E5: Padres de calibrao de 1 a 5; F: Combinao dos padres de calibrao;
G: Massa de antioxidante para a preparao da soluo estoque; H: Concentrao da soluo estoque de antioxidante; I: Volume de micropipeta; J: Volume
do balo volumtrico; K: Calibrao, deriva e repetibilidade do balo volumtrico; L: Resoluo, calibrao, deriva e repetibilidade de micropipeta.
F
E1
K
C
G
E2
I
K
E3
K
C
E4
H
I
A
C
E5
Concentrao
de antioxidante
C
B
107
As fontes de incerteza, conforme ilustradas no diagrama de Ishikawa,
afetam direta ou indiretamente o resultado da medio. Aquelas que afetam
diretamente (e esto apontadas para o eixo principal do diagrama) so a
incerteza gerada pela regresso linear (que afeta mant); a incerteza da massa
de biodiesel pesada (mbiod) ; a incerteza gerada pela repetibilidade da
metodologia (afeta diretamente C); e a incerteza da preparao dos padres de
calibrao (afeta mant). Esta ltima fonte de incerteza largamente discutida
entre as referncias se realmente deve ser levada em considerao, pois existe
o entendimento que esta j estaria englobada na incerteza gerada pela
regresso linear. Neste trabalho, seguiu-se o exemplo do Guia Eurachem
Relacre, onde considera-se a incerteza combinada dos padres de calibrao
como uma componente parte, apontando diretamente para o eixo principal do
diagrama de Ishikawa.
As demais fontes de incerteza ilustradas no diagrama esto afetando
indiretamente o resultado. As fontes de resoluo, calibrao, deriva e
excentricidade so aplicveis em todas as pesagens previstas na metodologia
na pesagem de amostra e tambm na pesagem do antioxidante concentrado
para a preparao da soluo estoque. Neste ltimo caso, a pesagem afeta
diretamente a massa de antioxidante (mantp), conforme equao 14:
56S
"
TU
(14)
Onde:
Cest a concentrao da soluo estoque, em mg/mL.
mantp a massa de antioxidante, obtida na pesagem, em mg.
Vbal o volume do balo volumtrico utilizado, em mL.
As fontes de incerteza de calibrao, deriva e repetibilidade do balo

volumtrico afetam diretamente Vbal. J Cest afeta diretamente a massa de
antioxidante em cada soluo-padro, exemplificada como mpad1 na equao
15:
FV*W 56S 102O
(15)
108
Onde:
mpad1 a massa de antioxidante referente ao padro 1, em mg.
V1 o volume de soluo estoque utilizado no padro 1, em L.
A relao descrita na equao 3 a mesma para todas as cinco solues de
calibrao. V1 (assim como V2, V3, V4 e V5) afetado diretamente pelas fontes
de resoluo, calibrao, deriva e repetibilidade da micropipeta utilizada na
medio deste volume.
Aps o levantamento das fontes de incerteza, estas so ento
quantificadas e somadas, de acordo com a lei de soma de varincias, onde se
determinam as incertezas combinadas (equao 16):
X) Z[\]8X13 <13 B
(16)
Onde:
uc a incerteza combinada, que a soma quadrtica das outras incertezas.
un a fonte de incerteza individual.
cn o coeficiente de sensibilidade relativo fonte de incerteza un.
O coeficiente de sensibilidade responsvel pela correo das unidades
durante o somatrio das diferentes fontes de incerteza, alm de conferir o
devido peso quela determinada fonte de incerteza. Ele definido na equao
17. A utilizao dos coeficientes de sensibilidade no prevista no guia
Eurachem107, mas fundamentada no ISO GUM108.
<1 ^1
^_
(17)
Onde:
R a grandeza que afetada por n.
Um exemplo pode ser dado pela equao do mensurando no ensaio de
ndice de acidez de biodiesel 123:
` 83 , B abc
/,
d
(18)
Onde:
I ndice de acidez da amostra, em mg de KOH por g;
V2 o volume de equivalncia na titulao potenciomtrica da amostra;
109
V1 o volume de equivalncia na titulao potenciomtrica do branco;
CKOH a concentrao do titulante (hidrxido de potssio);
W a massa de amostra.
Pela definio da equao 17, tem-se:
<Jabc
^'
^Jefg
83 , B
/,
d
(19)
Onde:
cCKOH o coeficiente de sensibilidade da concentrao de hidrxido de potssio
em relao ao ndice de acidez.
Com essas definies, as fontes de incerteza levantadas para a
metodologia proposta puderam ser quantificadas e somadas. Inicialmente, o
Quadro 1 traz o balano de incerteza para as pesagens. O valor da incerteza
de calibrao foi retirado do certificado de calibrao da balana; Para a
resoluo, considerou-se metade da menor medida (sendo uma balana
analtica de 4 casas decimais de grama, a incerteza da resoluo foi de
0,00005 g). Para a deriva da balana (que definida como mudanas
aleatrias que o instrumento pode apresentar aps a calibrao), considerouse dividir a incerteza de calibrao pelo fator de abrangncia k; A incerteza de
excentricidade (incerteza gerada pelas diferentes posies dentro do prato da
balana) tambm foi retirada do certificado de calibrao. Destas fontes de
incerteza, apenas a fonte de calibrao tem distribuio de probabilidade
normal (onde o divisor 2,00), segundo o certificado de calibrao. As demais
tm distribuio de probabilidade dita retangular (onde o divisor 3), e neste
caso considera-se que a fonte de incerteza aleatoriamente distribuda dentro
do referido intervalo. Os coeficientes de sensibilidade assumem o valor

numrico de 1,0 e -1,0. Como dentro da soma quadrtica os coeficientes so
elevados ao quadrado (equao 4), no h distino numrica entre eles. Mas
seus valores so resultados da aplicao da equao 5, ao se considerar que
as massas registradas na balana so o resultado de uma operao de
diferena, segundo a equao 20:
Onde:
F FS , F
(20)
110
m a massa registrada na balana;
mt a massa total do sistema (amostra + recipiente);
mr a massa do recipiente (ou massa de tara).
Ao se aplicar a equao 5, facilmente percebe-se que cmt = 1,0 e cmr = 1,0.
Os graus de liberdade so ditos infinitos porque os valores no foram
obtidos a partir de uma srie de medidas (so incertezas do tipo B). Caso
fossem definidos em uma srie de medidas, seriam atribudos valores iguais a
n -1, sendo n o nmero de medies realizadas (incerteza do tipo A).
Ao final de todos os balanos de incerteza, h o clculo da incerteza expandida
(U), que corresponde ao intervalo de confiana da medio (valor U), para
um certo grau de confiana. No presente trabalho optou-se por trabalhar
sempre com um grau de 95 % de confiana (ou 5 % de significncia). Para
obter-se a incerteza expandida, utiliza-se a equao 21:
h X) i
(21)
Onde:
U a incerteza expandida;
k o fator de abrangncia, que neste trabalho correspondeu ao t de student
para 95 % de confiana e ao nmero de graus de liberdade efetivos (eff). Este
ser abordado mais frente;
uc definido na equao 16.
111
Quadro 1
112
Quadro 2
113
O Quadro 2 apresenta o balano de incerteza para o volume do balo.
Ele utilizado na preparao da soluo estoque, estando diretamente
relacionado com a concentrao dessa soluo (equao 14). As fontes de
incerteza de calibrao e deriva recebem tratativa semelhante da balana;
Mas neste caso h a insero tambm da repetibilidade. Ela considera a
variao que ocorre quando do preenchimento do balo, ou seja, variaes ao
redor do menisco. Para avaliar esta fonte de incerteza, realizou-se um ensaio
de enchimento do balo dez vezes, com gua destilada (que a 25 C tem
densidade conhecida). Cada uma das dez vezes era registrada a massa de
gua na balana, gerando os dados da Tabela 28. Aps a converso para
volume, pela densidade, tirou-se o desvio-padro para ser a fonte de incerteza
relacionada repetibilidade, considerada incerteza do tipo A.
TABELA 28 REPETIBILIDADE DO PREENCHIMENTO DO BALO VOLUMTRICO
Replicata
Massa (g)
Converso para volume (mL)
24,9525
24,9975
24,9573
25,0023
24,9577
25,0027
24,9548
24,9998
24,9542
24,9992
24,9544
24,9994
24,9526
24,9976
24,9522
24,9972
24,9525
24,9975
10
24,9521
24,9971
Desvio-padro
0,00208
No Quadro 2 todos os coeficientes de sensibilidade tiveram o valor

numrico 1,00, visto que todas as fontes de incerteza j estavam na unidade da
incerteza combinada desejada (mL). Alm disso, os graus de liberdade foram
diferentes entre si - como a componente de repetibilidade foi uma fonte de
incerteza do tipo A, apresentou um grau de liberdade individual de 9 (10
medies), enquanto que as outras fontes (do tipo B), tm grau de liberdade
114
infinito. Essa diferena influencia no grau de liberdade efetivo, conforme
equao 22 (equao de Welch-Satterthwaite):
j5kk X)M / 1\]
8l ) Bm
n
(22)
Onde:
eff o nmero de graus de liberdade efetivos;
n o nmero de graus de liberdade individual, de cada fonte de incerteza.
Observando a equao 22, percebe-se que no caso de todos os graus
de liberdade individuais forem infinitos, o somatrio tender a zero, e o nmero
de graus de liberdade efetivos ser infinito. No caso do balano de incerteza
relativo ao volume do balo (Quadro 2), o valor de eff foi de 25, aps a
aplicao da equao 22, chegando-se a um fator de abrangncia k de 2,11,
para ento se chegar incerteza expandida. importante observar que
quando os clculos de incerteza forneceram valores para serem usados em
outros clculos, a incerteza expandida utilizada, e o divisor deve
corresponder ao fator de abrangncia especfico. Por exemplo, a incerteza
associada ao volume do balo volumtrico utilizada no clculo de incerteza
relativo concentrao da soluo estoque (Quadro 3). Ao se inserir na
planilha de clculo, a incerteza do volume do balo tratada com distribuio
normal, com divisor 2,11 (o fator de abrangncia individual). Isso porque para
que seja aplicada a equao 16, que combina as diferentes fontes de incerteza,
todas as componentes devem estar no formato de um desvio-padro. Isso
tambm explica porque quando da insero das incertezas do tipo A, a
distribuio considerada normal, e com divisor igual a 1,0 (o valor retirado
diretamente das medies j um desvio-padro).
No clculo de incerteza do Quadro 3 as fontes de incerteza
correspondem s grandezas relacionadas na equao 14: a massa utilizada de
antioxidante e o volume do balo. Os coeficientes de sensibilidade relativos a
cada grandeza, devido equao 14, tero valores diferentes, conforme
clculo abaixo:
115
<*1SV ^ o T
^J
"
U
3/ 0,04 Fp2

(23)
Onde:
cmantp o coeficiente de sensibilidade relativo massa de antioxidante obtida
na pesagem.
Onde:
<TC*+
^Jo
^TU
,
"
$
TU
,
3],3
3/$
,0,32992 FrFp23
(24)
cVbal o coeficiente de sensibilidade relativo ao volume do balo volumtrico.

Os valores atribudos massa de antioxidante so de uma concentrao de
soluo estoque de referncia, de 8,248 mg/mL.
O Quadro 4 traz o clculo de incerteza para o volume de soluo
estoque pipetado para a preparao das solues de calibrao. A diferena
para o balano do volume do balo volumtrico est na insero da fonte
relacionada resoluo, visto que um instrumento digital, onde se seleciona
manualmente o volume desejado. Para a resoluo, a tratativa foi a mesma
seguida para a balana. J a repetibilidade teve a mesma tratativa do balo
volumtrico: dez medies realizadas, com o mesmo volume selecionado,
seguida de pesagem das massas de gua, converso para volume e clculo do
desvio-padro (Tabela 29).
116
Quadro 3
117
Quadro 4
118
TABELA 29 REPETIBILIDADE DE VOLUME DA MICROPIPETA
Replicata
Massa (g)
Converso para volume (L)
0,0998
99,9800
0,0998
99,9800
0,0999
100,0801
0,0998
99,9800
0,0999
100,0801
0,0998
99,9800
0,0998
99,9800
0,0998
99,9800
0,0999
100,0801
10
0,0998
99,9800
Desvio-padro
0,04839
O Quadro 5 ilustra o balano de incerteza para o padro de calibrao 1,

ou seja, o ponto intermedirio da curva analtica. Todas as demais massas de
calibrao seguiram o mesmo balano de incerteza, baseado na equao 14,
diferindo entre si apenas nos coeficientes de sensibilidade, conforme
demonstrado abaixo:
<J56S
^"
s
^Jo
102O 20 102O 0,02 Fp (25)
Onde:
cCest o coeficiente de sensibilidade relativo concentrao da soluo
estoque.
<T
^"
s
^Ts
56S 102O 8,248 102O 0,008248 rFp2 (26)
Onde:
cV1 o coeficiente de sensibilidade relativo ao volume de soluo estoque
utilizado no padro 1.
Para os demais padres, cV1 assume valor constante, pela sua deduo.
J cCest substituindo-se os valores de 40, 60, 80 e 100 L, obtm-se:
<J56S 0,04; 0,06; 0,08; 0,10 Fp, respectivamente para os padres 2, 3, 4 e 5.
119
O Quadro 6 traz a planilha de combinao das incertezas das solues
de calibrao, para enfim ser inserida na planilha da incerteza final (Quadro 7).
Na incerteza final, ainda so inseridas as fontes relativas repetibilidade,
regresso linear e massa de amostra, conforme o Diagrama de Ishikawa indica.
Para a definio dos coeficientes de sensibilidade relativos ao balano
de incerteza final, levou-se em considerao a relao definida na equao 1:
<*1S
^J
^

10
]]
10 10 000 Fr2 (27)
Onde:
cmant o coeficiente de sensibilidade relativo massa de antioxidante.
<CtW
^J
^
,

$

10 ,
],u
]]$
10 ,17 Fr2
(28)
Onde:
cmbiod o coeficiente de sensibilidade relativo massa de biodiesel.
A fonte de incerteza combinada dos padres assumiu o mesmo
coeficiente de sensibilidade da regresso linear por ambas se referirem
massa de antioxidante, obtida ao se obter o resultado da massa de
antioxidante presente na amostra por intermdio da reta obtida na regresso
linear. Um ensaio de repetibilidade do mtodo forneceu os dados para o
levantamento desta fonte de incerteza, e os resultados esto na Tabela 30.
importante observar que a considerao desta componente de incerteza de
repetibilidade,
no
se
sobrepe,
em
princpio,
componentes
de
repetibilidades de volume de balo e micropipeta, visto que estas fontes de

repetibilidade esto relacionadas preparao dos padres de calibrao, e
este ensaio de repetibilidade para leituras de amostras, que conforme
descrio do mtodo, no passam pelo mesmo processo de preparao que as
solues de calibrao.
120
Quadro 5
121
Quadro 6
122
Quadro 7
123
TABELA 30 ENSAIO DE REPETIBILIDADE
Replicata
Concentrao (mg/kg)
4833,6
4852,2
4829,8
4816,7
4857,8
4850,4
4846,6
4861,6
4854,1
10
4876,5
Desvio-padro
17,22
Para a incerteza da regresso linear, a equao 29 prevista no guia de

incertezas analticas:
X)lv*
8E
4 : : $ U
(29)
w
1
C 8 2B$

2EB$
xy
Onde:
Sy o desvio-padro associado massa de antioxidante;
b o coeficiente angular da reta de calibrao;
N o nmero de padres utilizados no traado da curva analtica;
n o nmero de replicatas da amostra;
ylid o valor da rea do pico de interesse na amostra;
( o valor mdio das reas de pico de interesse nos padres de calibrao;

xi a massa de antioxidante em uma soluo de calibrao;
o valor mdio das massas de antioxidante entre as solues de calibrao.
Na literatura, tem-se a deduo da equao 29, que em linhas gerais,
estabelece relao matemtica direta para a obteno da incerteza gerada pela

regresso linear, que corresponde combinao das incertezas dos coeficientes
124
angular e linear da reta obtida na regresso, e da correlao entre eles, e tambm da

incerteza gerada no sinal instrumental, no caso da metodologia proposta, rea dos
picos de interesse.
Porm, Miller124 discute esta equao e a detalha como uma aproximao, na
verdade, e propem outra equao, que foi utilizada neste trabalho para o clculo da
incerteza gerada pela regresso linear (equao 30):
X)lv*
$
{o D $ 6$ D3)tv8*,CBD 6$

$
C
z
(30)
Onde:
sres dado pela equao 5;
x o valor de massa de antioxidante presente na amostra obtido pela equao da reta
de regresso;
sa dado pela equao 6;
sb dado pela equao 7.
Quando a regresso feita pelo MMQP, sres obtido pela estimativa de desviopadro da amostra a partir da regresso polinomial entre os desvios-padro de
resposta instrumental e nveis da curva analtica (Figura 47). J sa e sb so obtidos
pelas equaes 11 e 12, respectivamente.
Para as estimativas de incerteza, considerou-se n = 1, prevendo a injeo da
amostra em apenas uma replicata, considerando-se assim o pior caso para a incerteza
analtica. Logo, a equao 31 descreveu a obteno de sres para a regresso pelo
MMQP para determinao de antioxidante TBHQ.
56 8241,74 M , 520,75 O : 384,66 3 , 111,82 : 11,01B/|
(31)
125
J a incerteza relativa massa de amostra, tambm inserida no balano da

incerteza final, foi retirada do mesmo balano do Quadro 1, que corresponde
incerteza de uma pesagem com a balana utilizada no procedimentos.
A Figura 51 traz um grfico que correlaciona a incerteza de medio levantada
em funo da concentrao de antioxidante determinada pela metodologia, dentro do
intervalo de aplicao para TBHQ (considerando regresso linear pelo MMQO). Cabe
destacar que todos os clculos de incerteza ilustrados usaram como valor de referncia
uma concentrao de 1700 mg/kg. Esta concentrao foi escolhida como referncia
porque foi uma concentrao intermediria para o conjunto de amostras utilizado para
verificao da aplicabilidade do mtodo proposto (detalhes a seguir). Devido boa
correlao da funo ilustrada na Figura 51, todo o clculo de incerteza individual pode,
em tese, ser substitudo pela obteno da incerteza expandida diretamente por esta
funo.
Figura 51 Regresso de segundo grau entre a incerteza expandida e o valor da concentrao de

antioxidante nas amostras utilizadas para verificao da aplicabilidade do mtodo.
Relao entre a incerteza expandida e a

concentrao de antioxidante
Incerteza expandida (mg/kg)
184
182
y = 7E-07x2 - 0,0068x + 186,13
R = 0,9981
180
178
176
Pontos medidos
174
Regresso parablica
172
170
168
0
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

Concentrao de antioxidante (mg/kg)
126
Atravs da relao evidenciada na Figura 51, possvel estimar o ponto de

menor incerteza da metodologia, como segue abaixo:
h 7 102u 3 , 0,0068 : 186,13
(32)
(34)
^}
^J
14 102u , 0,0068 0 (ponto mnimo).

],]]~
M]
4857, 1 Fr/ir
(33)
Como esperado, o ponto de menor incerteza localiza-se prximo ao centro da

curva analtica. Porm, a maior parte das amostras desconhecidas situou-se entre 900
e 2500 mg/kg, ou seja, em um intervalo onde a incerteza expandida fica entre 180 e
174 mg/kg, em nmeros relativos, entre 20 % e 7 %.
As Figuras 52 e 53 apresentam a mesma relao, para TBHQ com regresso
pelo MMQP (regresso de fato considerada para TBHQ) e para BHT, respectivamente.
Figura 52 Regresso de quarto grau entre a incerteza expandida e o valor da concentrao de

antioxidante TBHQ nas amostras utilizadas para verificao da aplicabilidade do mtodo.
250
y = 7E-13x4 - 1E-08x3 + 0,0001x2 - 0,2834x + 348,06

R = 0,9678
Incerteza expandida
200
150
Pontos medidos
100
Regresso de quarto grau
50
0
0
2000
4000
6000
8000
Concentrao de antioxidante TBHQ (mg/kg)
10000
127
Figura 53 Regresso de segundo grau entre a incerteza expandida e o valor da concentrao de

antioxidante BHT nas amostras utilizadas para verificao da aplicabilidade do mtodo.
200
y = 8E-07x2 - 0,0081x + 204,42
R = 0,9999
Incerteza expandida (mg/kg)
198
196
194
192
Pontos medidos
190
Regresso parablica
188
186
184
0
2000
4000
6000
8000
10000
Concentrao de antioxidante BHT (mg/kg)
As equaes 35 a 37 representam a obteno de concentrao quando da

incerteza expandida mnima para determinao de BHT, da mesma forma como obtido
para determinao de TBHQ com regresso pelo MMQO.
h 8 102u 3 , 0,0081 : 204,42
^}
^J
16 102u , 0,0081 0 (ponto mnimo).
] 5062, 5 Fr/ir

],]]~
(35)
(36)
(37)
Entretanto, para TBHQ com regresso pelo MMQP, no foi possvel estabelecer
uma funo polinomial at quarto grau confivel entre a concentrao e a incerteza
expandida a partir de dados obtidos experimentalmente. Logo, a estimativa de
incerteza para a determinao de TBHQ pelo MMQP apresentou a vantagem de
obteno de menores valores de incerteza fato evidenciado pelos dados das Tabelas
31 e 32. A necessidade, porm, de se estimar a incerteza individualmente para cada
amostra, sem a facilidade de utilizao de uma funo previamente estabelecida,
uma desvantagem. Por meio dos dados, foi observado que as regies de menor
128
incerteza expandida foram entre 2000 e 3000 mg/kg, e entre 7500 e 8000 mg/kg. Para
determinao de TBHQ pelo MMQO, foi possvel, pela funo obtida (Figura 51), a
estimativa do ponto de menor incerteza (4857 mg/kg). Isso demonstra a clara diferena
em se trabalhar com regresso pelo MMQP e pelo MMQO, alm das diferenas
observadas quando do levantamento de LD e LQ. Como a maior parte das amostras
comerciais encontra-se em uma faixa de concentrao de at 2500 mg/kg, pode-se
inferir que de fato, a utilizao de MMQP na regresso linear mais indicada para a
determinao de TBHQ que o uso de MMQO.
Os valores de incerteza de medio expandida de determinao de antioxidante
TBHQ para as amostras analisadas pelo mtodo proposto variaram de 236 mg/kg em
uma concentrao de 584 mg/kg a 87 mg/kg em uma concentrao de 7825 mg/kg, o
que traduz uma variao de 40 % a 1 % de incerteza expandida relativa para
determinao de antioxidante TBHQ. J para BHT os valores variaram de 198 mg/kg
em uma concentrao de 777 mg/kg a 167 mg/kg em uma concentrao de 4895
mg/kg, o que traduz uma variao de 25 % a 3 % de incerteza expandida relativa para
determinao de antioxidante BHT.
O fato de no ser possvel estabelecer uma funo confivel entre a incerteza
expandida e a concentrao obtida na determinao de antioxidante TBHQ quando do
uso do MMQP, pode estar relacionado com o detalhe de haver mais fontes de incerteza
no clculo final (Quadro 7). A menor incerteza de regresso linear gerada pelo uso do
MMQP deixou aparentemente a incerteza expandida final mais sensvel aos valores de
incerteza das outras fontes, como repetibilidade, padres de calibrao e massa de
amostra. Essa maior sensibilidade s outras fontes tambm parece ter contribudo para
a maior variao de incerteza expandida relativa quando da determinao de TBHQ.
5.6 Aplicabilidade do mtodo

Aps validao do mtodo, este foi aplicado em amostras comerciais,
devidamente especificadas ateno especial foi concedida acerca do teor de gua
das amostras, devido influncia verificada no item 3 com o intuito de se obter
informaes acerca do desempenho dos antioxidantes BHT e TBHQ, a fim de se
confirmar o que a literatura tem reportado, quando usados em biodiesel. A estabilidade
129
oxidao foi medida utilizando-se o mtodo Rancimat16. A Tabela 31 traz os

resultados mais relevantes, e as Figuras 54 e 55 expem a relao grfica entre os
resultados. Os parmetros de qualidade de algumas amostras comerciais utilizadas,
mostrando que atendem a especificao da ANP, encontram-se em anexo a este
trabalho.
TABELA 31 RESULTADOS DE CONCENTRAO E DE ESTABILIDADE OXIDAO
Amostra /
Concentrao de
Concentrao de
Estabilidade
matria-prima
TBHQ (mg/kg)
BHT (mg/kg)
oxidao* (h)
Soja
845 171
4,33 0,59
Soja
1244 179
5,52 0,59
Gordura animal
9,16 0,59
6,87 0,59
Soja
1955 87
8,87 0,59
Soja
1332 108
7,79 0,59
Soja
998 180
4,98 0,59
Soja
852 181
4,61 0,59
Soja
1008 180
5,36 0,59
Soja
952 152
6,24 0,59
11,02 0,59
Soja / Gordura
animal
Soja / Gordura
animal
(*)A estimativa de incerteza de medio do ensaio Rancimat (Estabilidade oxidao a 110 C) foi
estimada em estudo realizado em paralelo ao desenvolvimento da metodologia proposta, e este estudo
relatado em anexo.
Como se pode observar nas Figuras 54 e 55, o TBHQ apresenta melhor

desempenho, pois uma menor concentrao deste antioxidante mostrou-se necessria
para adequao das amostras especificao da ANP, em relao ao BHT.
130
Figura 54 Concentrao encontrada de TBHQ em amostras comerciais e suas respectivas

Estabilidades Oxidao, conforme Tabela 31. Observa-se que uma concentrao de TBHQ prxima a
1000 mg/kg tem sido suficiente para a adequao deste conjunto de amostras especificao da ANP.
10
9
Estabilidade oxidao (h)
8
7
6
5
Resultados
Especificao da ANP
3
2
1
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Concentrao de TBHQ (mg/kg)
Figura 55 Concentrao encontrada de BHT em amostras comerciais e suas respectivas Estabilidades

Oxidao, conforme Tabela 31. Observa-se que uma concentrao de BHT prxima a 1000 mg/kg no
tem sido suficiente para a adequao deste conjunto de amostras especificao da ANP, ao contrrio
do TBHQ.
7
Estabilidade oxidao (h)
6
5
4
Resultados
Especificao da ANP
2
1
0
0
500
1000
1500
2000
Concentrao de BHT (mg/kg)
2500
3000
131
Estes resultados esto de acordo com o que sugerido na literatura76-81. A

Tabela 31 tambm evidencia que nas amostras de biodiesel de origem dupla (soja e
gordura animal), no se encontrou teor de antioxidantes. Isso de certa forma era
esperado, visto que, a composio mais saturada dos steres presentes na gordura
animal, torna o produto menos susceptvel oxidao, no necessitando assim de
antioxidante para adequao especificao da ANP. A Tabela 32 traz mais resultados
obtidos pelo mtodo proposto em amostras comerciais.
TABELA 32 RESULTADOS
Amostra / matria-
Concentrao de TBHQ
Concentrao de BHT
prima
(mg/kg)
(mg/kg)
Soja
1537 92
Soja
1805 190
Gordura animal
Soja / Gordura animal
Soja
1698 91
Soja
1147 136
Soja
1988 189
Soja
820 198
Soja
777 198
Soja
884 166
Soja / Gordura animal
584 236
Soja
8224 89
Soja
7825 87
Girassol
7116 88
Soja
6925 90
Soja
1845 190
Soja
2254 187
Soja
6304 95
Soja
5518 99
132
TABELA 32 RESULTADOS (continuao)
Amostra / matria-
Concentrao de TBHQ
Concentrao de BHT
prima
(mg/kg)
(mg/kg)
Soja
5049 99
Girassol
4620 96
Soja
4015 91
Soja
3526 87
Soja
2882 87
Soja
2440 87
Soja
2125 87
Soja
1897 88
Soja
1661 92
Soja
2005 189
Soja
1227 195
Soja
3325 178
Soja
4895 167
Soja
7662 189
As figuras 56 e 57 ilustram cromatogramas obtidos para algumas amostras

citadas na tabela 32.
133
Figura 56 Cromatogramas na regio do pico de TBHQ de amostras quantificadas com 6925, 2882,
1537 e 1147 mg/kg, respectivamente em azul, vermelho, verde e rosa.
Figura 57 Cromatogramas na regio do pico de BHT de amostras quantificadas com 3325, 2254, 1227
e 820 mg/kg, respectivamente em rosa, verde, vermelho e azul.
134
6. CONCLUSO
Para uma melhor compreenso do processo de oxidao do biodiesel, vrios

estudos tm sido realizados, e uma das ferramentas auxiliares a esses estudos est
em fase de desenvolvimento, que trata justamente da determinao quantitativa de
antioxidantes sintticos. Apesar dos esforos empregados, ainda no h mtodo
analtico difundido e largamente empregado junto aos agentes econmicos envolvidos
na cadeia do biodiesel. Alm disso, existe uma carncia de informaes sobre a
estabilidade e o efeito dos antioxidantes sintticos em funo de sua concentrao, e
esta carncia pode se tornar crtica ao mercado, visto que dentro da logstica nacional,
possvel que o biodiesel fique at 6 meses armazenado nas mais variadas condies,
aps certificado pelo produtor e antes de ser misturado ao leo diesel, para ento ser
de fato consumido.
Mesmo diante de tal carncia, resultados principalmente sobre o desempenho
dos antioxidantes sintticos foram obtidos e disponibilizados, apontando para um
melhor desempenho do TBHQ, dentre os antioxidantes mais utilizados na indstria do
biodiesel.
As tcnicas cromatogrficas apresentam propriedades favorveis para o
desenvolvimento de mtodos para determinao de antioxidantes, tais como: por ser
uma tcnica de separao, a possibilidade de amostras apresentarem efeito de matriz
muito pequena, devido diferena da natureza entre os analitos e a matriz, neste
caso; o uso de um detector suficientemente sensvel e estvel para as determinaes
(ionizao por chama); so tcnicas j conhecidas por parte dos agentes envolvidos na
cadeia do biodiesel. Pode-se dizer que este estudo possibilitou no somente o
desenvolvimento de um mtodo para a determinao quantitativa de antioxidantes
sintticos TBHQ e BHT, tais como so utilizados nas usinas produtoras, mas tambm a
aplicao de conceitos que fazem cumprir requisitos de qualidade previstos nas
normas vigentes sobre o assunto. Tais requisitos so reconhecidos internacionalmente,
e a adoo de sistemas de qualidade com foco nesses requisitos, por parte de
laboratrios de certificao de produtos, notoriamente crescente ano a ano,
evidenciada tambm devido a exigncias em nvel governamental.
135
A partir da metodologia desenvolvida e proposta, chegou-se s seguintes

concluses:
a) Foi desenvolvida nova metodologia para a determinao de antioxidantes
sintticos em biodiesel, utilizando cromatografia em fase gasosa, com detector
de ionizao por chama e injetor on-column.
b) Esta metodologia foi otimizada, quando foi verificada limitao imposta pelo teor
de gua da amostra de biodiesel, quando acima de 500 mg/kg de gua. Cabe a
observao de que a especificao atualmente est em mudana corrente,
alterando-se o valor mximo permitido de 350 mg/kg para 200 mg/kg de gua ao
fim do presente ano. Isto, em princpio, favorece a implantao da metodologia,
principalmente por parte de laboratrios de certificao de biodiesel (inclusive
dos prprios produtores de biodiesel), que em geral j possuem a
instrumentao e reagentes / padres necessrios, e que ento podem realizar
estudos de estabilidade, monitorando a concentrao de antioxidante.
c) A
metodologia
foi
validada
segundo
parmetros
internacionais
para
antioxidantes que tem sua composio majoritariamente constituda de TBHQ e

BHT, que hoje so os mais utilizados no pas.
d) Durante a validao, foram aplicados diferentes conceitos para o levantamento
dos parmetros do protocolo, mesclando ferramentas estatsticas disponveis,
diferentes
daquelas
convencionalmente
adotadas.
Isto
possibilitou
principalmente a obteno de bons limites de deteco e quantificao.

e) Tambm durante a validao, foi possvel a comparao entre o modelo clssico
de regresso linear (MMQO) e outro modelo (MMQP), que em um dos casos,
demonstrou ser mais adequado. Esta comparao apontou diferenas
significativas quando da adoo dos diferentes modelos. Essas diferenas
observadas no eram esperadas no incio do estudo.
f) Como parte da validao, foi estimada a incerteza de medio, que um dos
requisitos obrigatrios nos sistemas de qualidade que se baseiam na NBR ISO
IEC 17025:2005. Foi possvel tambm, em um dos casos, estimar como a
incerteza de medio se comporta ao longo da faixa de trabalho da metodologia.
O uso do MMQP contribuiu tambm de forma significativa para a reduo dos
valores de incerteza de medio, e novamente isso no era esperado.
136
g) A metodologia, como concebida, possui maior aplicabilidade para biodiesel de

soja ou de composio parecida (girassol, canola, dentre outros), visto que,
como esperado, o biodiesel com predominncia de cadeias carbnicas
saturadas (ex: gordura animal) j atende a especificao da ANP quanto
estabilidade sem a necessidade da adio de antioxidantes. Os resultados da
Tabela 31 confirmam dados da ANP em que foi observado que produtores que
trabalham com gordura animal no tm relatado uso de antioxidantes. Estes
resultados ainda demonstram a aplicabilidade da metodologia, podendo-se
utiliz-la no sentido de se buscar um valor mnimo de determinado antioxidante
necessrio para a adequao de um lote de biodiesel especificao da ANP,
sem a necessidade de se gerar vrios lotes, para um levantamento de tentativa
e erro.
H tambm outra carncia de informaes, esta acerca do impacto ambiental

decorrente do uso desses produtos na indstria do biodiesel. Tais produtos j so alvo
de controle na indstria alimentcia, e o uso em uma indstria de combustvel no
chama ateno, primeira vista, com respeito ao impacto ambiental. Porm, devido
localizao das usinas produtoras, sempre prximas a unidades produtoras de gros
(algumas, inclusive, dividindo parque industrial), o passivo ambiental carece de ser
melhor estudado, e a metodologia aqui proposta pode ser ferramenta a contribuir nesse
sentido.
Como continuidade para este trabalho, prope-se a realizao de testes com a
metodologia em diferentes usinas produtoras e em diferentes agentes econmicos da
cadeia do biodiesel (distribuidoras, por exemplo). Tambm pode ser proposta a
validao interlaboratorial da metodologia, desde que um nmero adequado de
laboratrios venha a adot-la e implant-la. Aperfeioamentos naturalmente tambm
podem vir a ser propostos, como por exemplo, novas faixas de trabalho (sempre com a
devida ateno de no se trabalhar prximo aos limites da tcnica), a ampliao do
escopo para outros antioxidantes sintticos, e o uso de vlvulas de reverso de fluxo,
dependendo dos tempos de reteno de interesse, para agilizar a anlise.
137
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145
ANEXO 1 TRABALHOS PUBLICADOS

1.1 OLIVEIRA FILHO, W.P. Avaliao da Estimativa de Incerteza Analtica para
o ensaio de Estabilidade Oxidao a 110 C em Biodiesel, Anais do 3
Seminrio de Laboratrio do Instituto Brasileiro de Petrleo e Gs (IBP) Rio
de Janeiro-RJ (2010).
Meio de apresentao: oral
O ensaio de Estabilidade Oxidao a 110 C em Biodiesel uma das anlises mais
crticas para se avaliar a qualidade do biodiesel. A anlise avalia a tendncia que o
biodiesel apresenta em oxidar-se, gerando cidos graxos livres e outros compostos,
que podem danificar componentes de motores de ignio por compresso. A medio
realizada induzindo a amostra de biodiesel a uma oxidao acelerada, mantendo a
amostra a uma temperatura de 110 C e submetendo-a a um fluxo de ar de 10 (dez)
litros por hora (1). Ao oxidar-se, a amostra comea a liberar compostos volteis a tal
temperatura, os quais so introduzidos em uma clula com gua ultra pura, a qual
possui sua condutividade monitorada constantemente. Quando os referidos compostos
resultantes da oxidao da amostra comeam a se aglomerar no meio aquoso, a
condutividade do meio tem um aumento considervel, e o tempo em que este
fenmeno acontece indica o resultado do ensaio. A Especificao do Biodiesel em
vigor (2) estabelece um mnimo de 6 (seis) horas para que o biodiesel seja aprovado
neste ensaio. Este limite segue o estabelecido pela especificao europia do biodiesel
(3).
As exigncias atuais de cumprimento a requisitos de qualidade previstos na norma
NBR ISO IEC 17025 levam os laboratrios em processo de acreditao, a buscar
estabelecer, entre outros parmetros, o levantamento da incerteza analtica dos
ensaios de seus escopos. Para este ensaio, particularmente um desafio levantar a
incerteza analtica, visto que embora o processo fsico seja complexo, a medio
direta, isto , no necessria a construo de uma curva analtica, tampouco
diluies de padres ou solues.
Neste estudo, tentou-se seguir a metodologia tradicional de levantamento de incerteza,
que consiste em: 1)Levantamento de fontes de incerteza Tabela 1; 2)
Estabelecimento da Equao do Mensurando e traado do Diagrama de Ishikawa
Figura 1; 3) Medio e quantificao das fontes de incerteza e 4) Elaborao da
planilha de incerteza Tabela 2 (4).
Como pode ser observado na Tabela 1, no foi levada em considerao influncia da
massa de amostra no levantamento de incerteza, visto que trabalhando dentro de uma
faixa de (3,00 0,01) g no observada mudana no resultado. Foram consideradas
possveis influncias de condutividade, fluxo de ar aplicado e temperatura da amostra
146
durante o ensaio, alm das tradicionais componentes de repetitividade e de resoluo

do resultado fornecido pelo software do equipamento.
Para o estabelecimento da equao do mensurando, no havia referncias que
pudessem ser tomadas de base. Logo, verificou-se que o software do equipamento
(Metrohm Rancimat 743) fornece o resultado aps traar a segunda derivada da curva
de medio experimental Condutividade (C) x Tempo (x), e calcular seu ponto de
mximo. Sendo assim, atribuiu-se curva experimental uma equao de um polinmio
de quarto grau (usando ajuste do tipo MMQO):
? M : A O : < 3 : :
Neste caso, facilmente obtm-se a condio para o ponto de mximo da segunda
derivada deste polinmio, atravs de simples derivao:
A
,
4?
Desta forma, chega-se equao do mensurando (R):
A
,
: ::G
4?
Onde F a contribuio do fluxo de ar, T a contribuio da temperatura e S, a
contribuio da condutividade medida. Os valores de F, T e S so numericamente
nulos, pois suas contribuies no corrigem o resultado, apenas incluem fontes de
incerteza. Como no se dispe de algoritmo estabelecido para o clculo das incertezas
relativas aos coeficientes a e b, (ao contrrio de uma regresso linear, por exemplo)
optou-se por considerar estas incertezas nulas, e inserir a componente de
reprodutibilidade, obtida por um ensaio com diferentes analistas.
Fonte de incerteza
cond
fluxo
temp
res
repe
repro
Descrio
Incerteza da condutividade medida.
Incerteza do fluxo de ar aplicado.
Incerteza da temperatura estabelecida durante o ensaio.
Incerteza da resoluo do resultado
Incerteza na repetitividade
Incerteza na reprodutibilidade.
Figura 1. Diagrama de Ishikawa para o ensaio.

Os respectivos coeficientes de sensibilidade foram obtidos experimentalmente, com
exceo daqueles relativos repetitividade, reprodutibilidade e resoluo, em que
nestes casos foi atribudo o valor 1,00, por j estarem na mesma unidade do resultado
(horas). Considerou-se temp = 0, visto que o sensor de temperatura compatvel do
147
fabricante do equipamento no se encontrava calibrado, impedindo medies

rastreveis de possveis variaes de temperatura. Ao final, obteve-se uma incerteza
expandida (U) de 0,33 horas.
Smbolo
Valor
Unidade
Distribuio
Divisor
cond
fluxo
temp
res
repe
repro
0,50
0,90
0,00
0,01
0,21
0,04
Scm-1
Lh-1
C
h
h
h
Retangular
Retangular
Retangular
Retangular
Normal
Normal
1,73
1,73
1,73
1,73
2,00
2,00
Incerteza
combinada
0,16
Distribuio
Normal
Valor do
c.sens.
0,20
0,20
1,00
1,00
1,00
1,00
Graus de liberdade
efetivos
32
Unidade do
c.sens.
hcmS-1
h2L-1
h C-1
h
h
h
Fator de
abrangncia
2,08
Incerteza
padro
0,06
0,10
0,00
0,01
0,11
0,02
Incerteza
expandida (U)
0,333
Graus de
liberdade
Infinito
Infinito
Infinito
Infinito
6
2
Unidade
h
Tabela 2. Planilha para estimativa da incerteza do ensaio.
Observando os dados experimentais, conclui-se que a equao do mensurando deve

ser reescrita, a fim de satisfazer os coeficientes de sensibilidade encontrados:
A
G
,
: : :
4? 5 5
Referncias
1 EN14112:2003 FAME Determination of oxidation stability.
2 Resoluo ANP 07/08, DOU 20/03/2008.
3 EN14214:2003 FAME Requirements and Test Methods.
a
4 Guia EURACHEM/CITAC, 2 Ed. Verso Brasileira QUAM:2002.
Agradecimentos
ANP,
Fundao
CERTI
Brasil
Ecodiesel
S/A.
148
1.2 OLIVEIRA FILHO, W.P., REZENDE, M.O.O. Desenvolvimento de

metodologia de determinao de antioxidantes sintticos em biodiesel por
Cromatografia Gasosa, Anais do 16 Encontro Nacional de Qumica Analtica,
USP Campos do Jordo-SP (2011).
Meio de apresentao: pster
Desenvolvimento de metodologia de determinao de

antioxidantes sintticos em biodiesel por Cromatografia
Gasosa
Waldemar P. de O. Filhoa,b* (PG), Maria Olmpia de O. Rezendea (PQ)
a
Instituto de Qumica de So Carlos, Universidade de So Paulo, So Carlos, SP, Brasil

Centro de Pesquisas e Anlises Tecnolgicas, Agncia Nacional do Petrleo, Gs Natural e
Biocombustveis, Braslia, DF, Brasil
*e-mail: wfilho@anp.gov.br
Nos ltimos anos, tem-se dado importncia peculiar para a questo da estabilidade
oxidao do biodiesel, visto que uma considervel instabilidade do produto pode levar
formao de compostos que podem causar danos a componentes do motor, assim
como levar formao de particulados antes e depois da mistura do produto com leo
diesel mineral1. Sabe-se que os antioxidantes sintticos so necessrios para
biodiesel oriundo de matria-prima com certo grau de insaturao, como por exemplo
soja, canola e girassol, no sentido de que o produto atenda as especificaes em
vigor. Alguns estudos constantes na literatura tem obtido a performance dos
antioxidantes sintticos em biodiesel2,3. Neste cenrio, importante a disponibilidade
de metodologia que determine a concentrao dos antioxidantes j adicionados ao
biodiesel, para possibilitar a melhoria dos estudos de performance e tambm de
estabilidade do prprio biodiesel. Existe metodologia que utiliza cromatografia lquida
de alta eficincia com deteco por ultravioleta (HPLC-UV)4 e outra por voltametria2,
aplicveis para alguns antioxidantes. Aqui, apresentada metodologia por
cromatografia gasosa com deteco de ionizao por chama (GC-FID), que a princpio
possui a vantagem de utilizar a mesma instrumentao j aplicada para certificao de
biodiesel em anlises de rotina, como teor de ster, glicerina livre, glicerina total,
monogicerdeos, diglicerdeos e triglicerdeos. O mtodo tem se mostrado robusto,
com boa recuperao e de fcil aplicao. At o presente momento, tem sido usado
para determinao dos antioxidantes tert-butil-hidroquinona (TBHQ) e butilhidroxitolueno (BHT), compostos usados com freqncia na produo do biodiesel de
soja nacional. A Figura 1 mostra cromatogramas de curva analtica levantados durante
o desenvolvimento da metodologia, e a Figura 2 ilustra um cromatograma de amostra
de biodiesel com destaque para o pico observado para o TBHQ.
149
Figura 1. Cromatogramas de curva analtica para TBHQ obtidos pelo mtodo.
TBHQ
Figura 2. Amostra de biodiesel de soja acusando TBHQ.

1
Knothe, G, Gerpen, JV, Krahl. The Biodiesel Handbook. AOCS Press, 2005.
Araujo, TA, Barbosa, AMJ, Viana, LH, Ferreira, VS. Fuel, 90, 2011, 707.
3
Dunn, RO. Fuel Process Technology, 86, 2005, 1071.
4
Tagliabue S, Gasparoli A, Bella, DL, Biodioli, P. Rivista Italiana Delle Sostanze Grasse, 81, 2004, 37.
2
150
1.3 OLIVEIRA FILHO, W.P., REZENDE, M.O.O. Estimativa de incerteza na

determinao de antioxidantes sintticos em biodiesel, Anais do 14.
Congresso Latino-Americano de Cromatografia e Tcnicas Relacionadas
(COLACRO), Centro de convenes Florianpolis-SC (2012).
Meio de apresentao: oral
A partir de mtodo proposto para determinao de antioxidantes sintticos em biodiesel por

cromatografia gasosa (mtodo que utiliza coluna de alta temperatura, injetor on-column, e
agente silanizante, devido aos grupos hidroxilas fenlicos do analitos) estimou-se a incerteza de
medio utilizando como base protocolos sugeridos no guia ISO GUM, Guia Eurachem : Citac
e Eurachem : Relacre. Para isso, foram consideradas fontes de incerteza de regresso linear,
fontes de incerteza relacionadas s medies de massas, fontes de incerteza quanto aos padres
de calibrao e fonte de incerteza relativa repetibilidade. As fontes de incerteza relacionadas
aos padres de calibrao geraram outras sub-fontes de incerteza, como fonte de incerteza de
massas e volumes medidos no preparo desses padres, e cada uma dessas fontes foi
devidamente quantificada. Em seguida, obteve-se relao entre a incerteza final e a faixa de
aplicao do mtodo, onde verificou-se uma variao entre 7 % e 20 % dessa incerteza final
em relao concentrao de analito. Concluiu-se que a incerteza de medio do mtodo atende
a requisitos de aceitao internacionais, e que compatvel com as necessidades de
determinao desse tipo de analito a fim de atender os usurios, particularmente produtores de
biodiesel, que tm comumente utilizado antioxidantes sintticos em seus processos de obteno.
151
ANEXO 2 EQUAES COMPLEMENTARES UTILIZADAS NAS

REGRESSES LINEARES
2.1 Equaes complementares utilizadas nas regresses pelo MMQO.
?
F ( , (
G
3 ( , (
A
G
Onde:
a o coeficiente angular;
b o coeficiente linear;
xi o valor da grandeza de entrada do eixo x da curva analtica;
yi o valor da resposta instrumental.
m o nmero de leituras de padres de calibrao.
Onde:
<=>8?, AB
3

56
G
cov(a,b) a co-varincia entre os coeficientes angular e linear da regresso;

sres dado pela equao 5.
152
2.2 Equaes complementares utilizadas nas regresses pelo MMQP.

?
Onde:
A
( , (
G
3 ( , (
G
wi dado pela equao 3;

<=>8?, AB ,

G
Onde:
cov(a,b) a co-varincia entre os coeficientes angular e linear da regresso.
153
ANEXO
ESTATSTICOS
EQUAES
PARA
UTILIZADAS
DEFINIO
DO
NOS
MTODO
REGRESSO
3.1 Equaes utilizadas no teste de Jacknife
1 8 , B3
:
|
G
Onde
hi o resduo padronizado;
n o nmero de resduos;
xi a varivel de entrada (aqui, massas de antioxidante);
a mdia das variveis de entrada.
Sxx dado pela frmula abaixo.
G
Onde
3 , 8 B3

|
( , 8A : ? B
ei o resduo;
yi a resposta instrumental referente ao resduo (aqui, rea do pico);
b o coeficiente linear da equao de regresso por MMQO;
a o coeficiente angular da equao de regresso por MMQO;

Onde:
ri o coeficiente outlier;
M dado pela equao abaixo:
! 81 , B
TESTES
DE
154
Onde:
8( , (B3 , ?3 G

|,2
( a mdia das respostas instrumentais.

5 z
|,3
| , 2 , 3
Onde:
Jei o coeficiente Jacknife calculado.
Onde:
)S)t -],]/;12O
Jcrtico o t de student para n 3 graus de liberdade e 95 % de confiana.
3.2 Equaes utilizadas no teste de Ryan-Joiner.
9
Onde:
3
, 8
1
| : 4
pi o fator ponderante do resduo para o teste de Ryan-Joiner.

i o nmero do resduo (de 1 a 15, neste trabalho).
Onde:
8)56) ; B
R o coeficiente de Ryan-Joiner.
r o coeficiente de correlao entre o conjunto de eicresc e o conjunto de qi.
eicresc o conjunto de resduos ordenados em ordem crescente de valores.
qi o inverso da funo normal em relao a pi.
155
3.3 Equaes utilizadas no teste de Durbin-Watson.

8 , 2 B3

3
Onde:
d o coeficiente de Durbin-Watson.
ei-1 o resduo adjacente.
Onde:
1,9693 : ,
2,8607
|
# : ,
3,4148
16,64
#: 3 #
|
|
dL o coeficiente crtico superior para correlao.
Onde:
} 1,9832 : ,
3,0547
1,3862
16,3662
#:
#:
#
|
|3
|
dU o coeficiente crtico inferior para independncia.
3.4 Equaes utilizadas no teste de Brown-Forsythe.
Onde:
| , |
dk o desvio individual do resduo do grupo k, em relao mediana do grupo.

ekj o resduo individual do grupo k.
ek a mediana do grupo k.
Onde:
B3
G 8 ,
SQDk a soma dos desvios quadrticos dos desvios individuais em relao

mediana do grupo k.
a mdia dos desvios individuais em relao mediana do grupo k.

V3
G
| , 2
156
Onde:
sp2 a varincia dos desvios individuais segundo mediana inter grupos.
nk o nmero de resduos do grupo k.
-
Onde:
3
,
1
1
: V3
| |3
tL o coeficiente de Brown-Forsythe calculado para os grupos.
3 , | , |3 so correspondentes a
,
e | .
9 >?=-AX= - 8|- |; | : |3 , 2B
Onde:
P o valor p que corresponde rea integrada da funo t de student com t =
tL e n1 n2 2 graus de liberdade, considerando a funo bicaudal.
157
ANEXO 4 PARMETROS DE QUALIDADE PARA ALGUMAS

AMOSTRAS COMERCIAIS DE BIODIESEL UTILIZADAS NESTE
TRABALHO
Parmetro
10
Aspecto (23 C)
LII
LII
LII
LII
LII
LII
LII
LII
LII
LII
881
884
889
879
879
881
879
882
880
880
4,2
4,4
4,4
4,3
4,3
4,6
4,4
4,2
4,6
4,8
Ponto de Fulgor, C
125
138
169
129
155
131
133
174
170
166
gua, mg/kg
452
441
395
369
424
481
459
487
422
456
Contaminao Total, mg/kg
11
18
22
15
21
Cinzas Sulfatadas, %massa
0,02
0,02
0,02
0,02
0,02
0,02
0,02
0,02
0,02
0,02
Enxofre, mg/kg
2,5
3,8
2,7
8,9
7,2
7,5
8,5
8,3
5,2
6,3
-2
-4
-1
-5
-4
-1
0,01
0,02
0,02
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
0,02
0,02
ndice de Acidez, mgKOH/g
0,42
0,34
0,36
0,33
0,29
0,46
0,25
0,29
0,37
0,35
ndice de Iodo, g/100g
115
118
125
123
130
110
115
104
109
102
0,14
0,07
Glicerol livre, %massa
0,02
0,02
0,01
0,01
0,02
0,02
0,01
0,02
0,02
0,02
Glicerol Total, %massa
0,22
0,18
0,22
0,24
0,15
0,22
0,20
0,19
0,21
0,20
Monoacilglicerol, %massa
0,62
0,50
0,66
0,75
0,34
0,62
0,59
0,48
0,57
0,53
Diacilglicerol, %massa
0,18
0,12
0,14
0,16
0,18
0,18
0,16
0,19
0,18
0,18
Triacilglicerol, %massa
0,09
0,11
0,14
0,08
0,11
0,09
0,09
0,14
0,12
0,12
Sdio + Potssio, mg/kg
2,8
3,1
1,5
1,8
1,8
1,6
1,7
2,1
2,0
1,6
Clcio + Magnsio, mg/kg
ND
ND
0,9
ND
0,4
0,7
2,0
1,1
ND
ND
Fsforo, mg/kg
0,5
1,5
1,2
1,9
2,5
1,0
ND
1,5
ND
ND
7,5
6,6
6,9
8,8
7,1
9,5
9,9
7,2
10,4
10,2
97,6
96,9
97,4
98,1
98,2
97,0
96,7
98,0
97,7
97,4
Massa Especfica a 20 C,
kg/m
Viscosidade Cinemtica a 40
2
C, mm /s
Corrosividade ao Cobre (3h a

50 C)
Ponto de Entupimento de
filtro a frio, C
Nmero de Cetano*
Resduo de Carbono, %
massa
Metanol ou Etanol,
%massa**
Estabilidade Oxidao a
110 C, h
Teor de ster, % massa
(*) O Nmero de Cetano um ensaio exigido ao produtor apenas trimestralmente, no necessitando

14
constar em todos os certificados de qualidade .

14
(**) O ensaio de Metanol ou Etanol no exigido caso o Ponto de Fulgor esteja acima de 130 C .

WaldemarPacheco deOliveiraFilho Revisado

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I

UTILIZAO DE CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA PARA

Tese apresentada como requisito

Ao Senhor, por ter tornado possvel a concluso deste

Biodiesel is a renewable fuel composed by alkyl esters generated from

3.1.2 Controle de qualidade do biodiesel

3.1.3 Histrico do biodiesel no Brasil

3.1.4 O processo de oxidao do biodiesel

3.2.1 Uso de antioxidantes em biodiesel

3.2.2 Metodologias desenvolvidas para determinao de antioxidantes

3.3 Cromatografia em Fase Gasosa

3.3.3 Mtodos de derivatizao

3.3.4 Cromatografia Gasosa e o biodiesel

3.4 Validao de mtodos

3.4.1 Metrologia e Validao

3.4.2 Incerteza de Medio

4.1.1 Reagentes e solventes

4.1.2.1 Solues estoque de antioxidantes sintticos

4.1.2.2 Solues de calibrao preparadas a partir das solues

4.1.2.3 Preparo de solues de amostras

4.1.3.2 Instrumentos volumtricos

4.1.5 Instrumentao analtica

4.1.5.1 Aparelhagem utilizada nos experimentos de

4.1.5.2 Aparelhagem utilizada nas demais etapas experimentais

4.2.1 Caracterizao dos antioxidantes sintticos

4.2.2 Desenvolvimento do mtodo proposto

4.2.3 Otimizao do mtodo

4.2.4 Validao do mtodo

4.2.5 Incerteza de medio

4.2.6 Aplicabilidade do mtodo

5.1 Caracterizao dos antioxidantes sintticos

5.2 Desenvolvimento do mtodo proposto

5.3 Otimizao do mtodo

5.4 Validao do mtodo

5.4.3 Fidelidade Repetibilidade de reas

5.4.4 Fidelidade Repetibilidade de tempos de reteno

5.4.6 Limite de Deteco

5.4.7 Limite de Quantificao

5.4.11 Intervalo de aplicao

5.5 Incerteza de medio

5.6 Aplicabilidade do mtodo

ANEXO 1 Trabalhos publicados

ANEXO 2 Equaes Complementares utilizadas nas

ANEXO 3 Equaes utilizadas nos testes estatsticos para

ANEXO 4 Parmetros de qualidade para algumas amostras

2. Parmetros de qualidade para o biodiesel

4. Mtodos de cromatografia gasosa em anlises

5. Parmetros gerais para validao de mtodos

7. Solues estoque de antioxidantes sintticos

9. Preparo de solues para leitura de amostras

10. Condies de operao CG-EM

11. Condies de operao

12. Protocolo de validao

13. Teor de gua nas amostras utilizadas inicialmente no

14. Teor de gua para o novo conjunto de amostras

15. Resultados da validao

16. Teste Jacknife para TBHQ

17. Teste Jacknife para BHT

18. Teste Ryan-Joiner para TBHQ

19. Teste Ryan-Joiner para BHT

20. Teste de Durbin-Watson para TBHQ

21. Teste de Durbin-Watson para BHT

22. Teste de Brown-Forsythe para BHT