PESQUISA

INTERAO
PLANTA-INSETO
Adaptao dos insetos aos inibidores de proteinases produzidos pelas plantas
Fotos cedidas pelos autores

Marcio Castro Silva-Filho

Prof. Dr. da Escola Superior de Agricultura Luiz de

Queiroz (ESALQ/USP)
Departamento de Gentica
Laboratrio de Biologia Molecular de Plantas
mdcsilva@carpa.ciagri.usp.br

Maria Cristina Falco

Ps-Doc. do Departamento de Gentica

da ESALQ/USP
mcfalco@carpa.ciagri.usp.br

Figura 1. Pragas de importncia econmica. A) Lagarta da ma do algodoeiro

(Heliothis virescens). B) Broca da cana-de-acar (Diatraea saccharalis). C)
Lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis). D) Lagarta do algodoeiro (Alabama
argillacea). Fotografias cedidas por Heraldo Negri de Oliveira (Depto de
Entomologia ESALQ/USP)

38

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

co-evoluo de inibidores de proteinases (IPs) de

plantas e proteinases de
insetos fornece um interessante e novo paradigma para pesquisas ecolgicas, fisiolgicas e bioqumicas. As plantas parecem
ter desenvolvido IPs com extraordinrias propriedades contra proteinases
de insetos. Eles so extremamente resistentes protelise e permanecem
ativos sob diversos pHs intestinais
(Christeller et al., 1994), alm de ser
identificados como inibidores contra
quase todas as classes de proteinases.
Os IPs tendem a ser sensivelmente
amplos em seus campos de ao, e h
indicaes que eles tm propriedades
parecidas com a dos anticorpos para
precipitar proteinases intestinais, retirando-as da soluo. Por outro lado, as
pragas conhecidas apresentam diversas formas de evitar os efeitos negativos dessas protenas de defesa presentes nas plantas hospedeiras. Estas incluem o uso de proteinases para as
quais as plantas hospedeiras no tenham inibidores, a degradao proteoltica de inibidores, e mutaes adquiridas que resultam em proteinases
menos sensveis aos IPs sem a perda da
atividade proteoltica. Alm disso, o
monitoramento de mecanismos de atividade proteoltica, aparentemente leva
para uma rpida resposta aos altos
nveis de IPs na dieta. A expresso de
proteinases insensveis aos IPs parece
ser flexivelmente regulada para compensar as proteinases inibidas.
Controle de Insetos
Estima-se que as perdas provocadas por pragas e doenas na agricultura
mundial atinjam 37% da produo, dos
quais cerca de 13% devido a insetos
(Fig. 1). Atualmente os mtodos de
controle concentram-se basicamente

teo de plantas a insetos.

De acordo com sua especificidade,
as proteinases podem ser divididas em
Dieta base de folhas a
Enzima
Dieta artificial
quatro classes: as serino-, cisteno-, meKm (mM)
Peso Molecular (kDa) Km (mM) Peso Molecular (kDa) talo- e aspartil-proteinases. Os IPs mais
T1
0,27
70
abundantes e estudados so aqueles
T2
0,35
67
capazes de inibir as serino-proteinases,
T3
2,4
29
2,9
29
grupo das tripsinas e quimotripsinas,
T4
15
17
*
17
enzimas encontradas majoritariamente
a
Folhas de fumo transgnico e no transgnico apresentaram os mesmos resultados em insetos da ordem Lepidoptera (Ter* Atividade no detectada
ra & Ferreira, 1994). Os inibidores de
serino- e cisteno-proteinases so amplamente distribudos em sementes e
na utilizao de agroqumicos dentro como inibidores de proteinases (IPs).
tecidos de reserva de plantas. Portanto,
de um manejo integrado de pragas. Este grupo de protenas est amplamen- alm de protegerem as plantas contra o
Entretanto, h uma grande demanda
te distribudo no reino vegetal e faz
ataque de insetos, os IPs so utilizados
por parte da sociedade pelo desenvolparte de um mecanismo de defesa das como protenas de reserva em algumas
vimento de uma agricultura limpa, que
plantas contra o ataque de pragas e
sementes.
diminua o uso de energia e produtos patgenos (Richardson, 1991). As proO mecanismo de ao de um IP
qumicos, que no deixe resduos indetenas de defesa podem ser produzidas
baseia-se na inibio competitiva de
sejveis no meio ambiente e nos aliconstitutivamente em tecidos que so uma proteinase, via bloqueio de sua
mentos, alm de reduzir as contaminaparticularmente vulnerveis ao ataque
atividade proteoltica (Fig. 2). A ingeses aos agricultores. Entre as alternatide insetos, como as sementes, ou po- to de IPs pelos insetos herbvoros
vas para contornar estes problemas esdem ser induzidos por danos mecni- interfere no processo de degradao de
to o controle biolgico e o uso de
cos, como ocorre quando um inseto se
protenas no intestino mdio. Assim
variedades resistentes.
alimenta de uma folha (Jouanin et al.,
sendo, os inibidores so considerados
Com o desenvolviagentes anti metablicos, pois
mento das tcnicas de
levam a uma deficincia probiologia molecular que
tica dos insetos. A atividade
permitem a manipulaantibitica dos IPs atribuda
o de genes de inte sua interferncia na digesresse, aliadas s metoto protica que diminui a
dologias de transfordisponibilidade de aminocimao gentica de
dos, prejudicando a sntese
plantas, uma nova e
de protenas necessrias ao
interessante abordacrescimento, desenvolvimengem no controle de
to e reproduo. Uma outra
insetos vem atraindo a
hiptese que os inibidores
ateno de pesquisaafetem o desenvolvimento de
dores em todo o munforma indireta, via um mecado. Genes que codifinismo de feedback, que
cam para protenas
levaria a um aumento da procom atividade inseticiduo de proteinases digestida tornaram-se uma
vas para compensar os baiarma bastante podexos nveis de aminocidos
rosa e com um amplo
disponveis. Os aminocidos
potencial de utilizao.
seriam deslocados para a snPor outro lado, estutese de proteinases em detridos envolvendo a inmento de outras protenas
terao entre as planessenciais. Entretanto, investas hospedeiras com seus insetos, notatigaes mais recentes mostraram que a
Figura 2damente as pragas, no se desenvolvedeficincia de aminocidos essenciais
Esquema representativo da ligao
ram com a mesma intensidade. Um dos
resultantes da hiperproduo de proteide uma serino-proteinase (tripsina)
sistemas mais fascinantes envolvendo
nases em lagartas de Spodoptera exigua
ao inibidor correspondente
esse tipo de interao baseado nos
e Heliothis zea deveu-se reduo da
(Adaptado de Bode & Huber, 1992)
estudos com inibidores de proteinases
atividade proteoltica intestinal (Broaproduzidos pelas plantas e insetos herdway, 1995).
bvoros.
Uma vez estabelecido que os IPs so
Inibidores de Proteinases de
1998). Entretanto, muitas delas so txiproduzidos pelas plantas em resposta
Plantas Contra Insetos Herbvoros
cas tambm a mamferos, o que indica
ao ataque de pragas, suas propriedades
Sabe-se h mais de 60 anos que as
que devam ser cautelosamente estudaantimetablicas foram testadas contra
plantas contm peptdeos que atuam das para uso como mecanismo de prodiversos insetos. Resultados in vitro baTabela 1. Propriedades cinticas e peso molecular de diferentes atividades
trpticas presentes em lagartas alimentadas com dieta artificial e base de folhas

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

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seados na combinao de extratos intestinais com diferentes inibidores, mostraram que os IPs
foram efetivos na inibio das
proteinases digestivas. Alm disso, a incorporao de IPs em
dietas artificiais mostrou-se eficiente em vrios estudos. Desta
forma, foram obtidas plantas
transgnicas resistentes a pragas
via expresso de genes de IPs
(Hilder et al., 1987; Duan et al.,
1996; Gatehouse et al., 1997).
Paralelamente aos resultados
positivos com as plantas transgnicas, um nmero crescente
de trabalhos mostrou que os
insetos eram capazes de adaptar-se presena dos inibidores
produzidos pelas plantas (para
uma reviso, veja Jongsma &
Bolter, 1997).
Mecanismos de Adaptao
dos Insetos aos Inibidores
de Proteinase
Em um trabalho pioneiro,
Jongsma e colaboradores (1995a)
observaram que lagartas de Spodoptera exigua adaptaram-se presena de
IPs expressos em plantas transgnicas
via induo de proteinases insensveis
ao inibidor. A partir de ento, estas
observaes foram extendidas uma
ampla gama de insetos-praga. No entanto, um outro mecanismo adaptativo
baseado na sntese de proteinases capazes de inativar, via degradao proteoltica, os IPs produzidos pelas plantas foi descrito por outros grupos (Giri
et al., 1998; Girard et al., 1998).
O Laboratrio de Biologia Molecular de Plantas do Departamento de
Gentica da ESALQ/USP iniciou, recentemente, estudos envolvendo o uso
de IPs visando a obteno de resistncia a pragas de importncia econmica. Os trabalhos tambm tiveram como
objetivo o estudo a nvel molecular da
interao entre plantas de interesse
econmico e insetos herbvoros. O
primeiro trabalho avaliou os efeitos da
presena do inibidor de proteinase do
tipo 2 de batata (PIN-2) em plantas
transgnicas de tabaco, sobre o desenvolvimento, metabolismo e proteinases intestinais da lagarta da ma do
algodoeiro, Heliothis virescens (Brito et
al., submetido). Os ensaios biolgicos,
realizados com apoio do Departamento de Entomologia da ESALQ/USP mostraram no haver diferenas significativas quando comparados com o trata40

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

Figura 3.
Separao das tripsinas (n)e quimotripsinas () presentes em extrato intestinal de Spodoptera frugiperda alimentadas com dieta artificial
(A) e com dieta artificial suplementada com 0,5 % (p/v) de IPs extrados de sementes de soja (B)

mento base de plantas no transformadas. Estas observaes levaram

hiptese de uma adaptao deste inseto ao inibidor. A fim de estudar o
possvel mecanismo adaptativo das
lagartas, foram caracterizadas as proteinases digestivas dos insetos, com
apoio do Laboratrio de Bioqumica
de Insetos do Departamento de Bioqumica do IQ/USP. Assim, as lagartas
foram submetidas a trs dietas distintas: 1) base de folhas de plantas
transgnicas de fumo, 2) folhas de
plantas de fumo no transformado e,
3) dieta artificial sem a presena de IPs.
A combinao de tcnicas de separao de protenas e estudos cinticos,
revelaram a presena de duas tripsinas
e uma quimotripsina no tratamentos
base de dieta sem inibidor. No entanto, em lagartas alimentadas base de
folhas transgnicas ou no, foram detectadas quatro atividades trpticas,
sendo que duas eram totalmente no-

vas (Tab. 1). Uma nica atividade

de quimotripsina foi observada.
Uma observao interessante foi
que as novas tripsinas apresentavam pesos moleculares bem superiores aos demais e maior afinidade pelo substrato. A filtrao
em gel na presena ou ausncia
de SDS, revelou que as tripsinas
de alto peso molecular seriam
originadas a partir das tripsinas de
menor peso recm sintetizadas,
via um processo de oligomerizao. Portanto, trata-se de mais um
novo mecanismo de adaptao
dos insetos aos IPs produzidos
pelas plantas.
Novas evidncias de adaptao dos insetos presena de
inibidores de proteinases foram
verificadas em um estudo envolvendo um outro inseto polfago
(mltiplos hospedeiros), a lagarta
do cartucho do milho, Spodoptera
frugiperda, e inibidores de serinoproteinases extrados de soja.
Os inibidores de proteinase de
soja Bowman-Birk e Kunitz foram
incorporados em dietas artificiais que
foram utilizadas na alimentao das
lagartas desde as primeiras fases do
desenvolvimento. Embora os ensaios
de inibio in vitro tenham mostrado
uma alta eficincia contra as proteinases da lagarta, os ensaios biolgicos
mostraram que no houve alteraes
significativas no desenvolvimento e
metabolismo de lagartas alimentadas
com dieta artificial contendo inibidores extrados da soja. Esse fato levou
investigao do mecanismo responsvel pela adaptao dos insetos presena dos inibidores. Para isso, foram
analisados extratos intestinais das lagartas alimentadas com dietas contendo os inibidores. O mecanismo adaptativo desenvolvido pelas lagartas de S.
frugiperda estava relacionado alterao na expresso das serino-proteinases. Os resultados mostraram o aparecimento de uma nova atividade trptica
e um aumento significativo na atividade quimotrptica do inseto (Fig. 3). A
polifagia do inseto pode ter facilitado
o desenvolvimento de proteinases que
tenham reduzida afinidade aos IPs da
soja. Como a eficincia de um inibidor
especfico dependente da compatibilidade estrutural do seu stio reativo
com o stio ativo da proteinase,
provvel que as enzimas digestivas
tenham sofrido alteraes nos amino-

cidos que circundam o stio de ligao,

resultando em uma fraca interao com
os inibidores (Paulillo et al., no prelo).
Perspectivas na Utilizao de
Inibidores de Proteinases no
Controle de Insetos
Ao se considerar a possibilidade de
produzir plantas transgnicas expressando IPs, algumas consideraes se
fazem necessrias a fim de aumentar as
chances de sucesso. Entre estas, incluem-se os nveis de expresso do IP, sua
constante de inibio, a estabilidade do
IP no intestino do inseto e a habilidade
de adaptao do inseto aos inibidores
via alterao da expresso gnica. Fatores ambientais secundrios tambm podem interferir na severidade dos sintomas. Como os IPs agem causando uma
deficincia na disponibilidade de aminocidos, a digestibilidade do alimento,
a concentrao e a qualidade protica da dieta sero determinantes
para maximizar os efeitos dos IPs
sobre os insetos. Alm disso, inmeros compostos fitoqumicos
presentes ou induzidos pelas plantas tambm apresentam potencial
de alterar a toxicidade dos IPs
sobre os insetos hospedeiros (Broadway & Duffey, 1988).
A presso de seleo sobre os
insetos para desenvolver proteinases que so insensveis aos IPs
de plantas hospedeiras so considerveis e a evoluo de insetos
em muitas geraes por ano oferece uma vantagem significativa sobre as plantas. Mas, alm das altas
concentraes de inibidores, as
plantas podem encontrar alternativas de melhorar a eficcia de
seus inibidores envolvendo multidomnios ou variantes multimricos. Isso antes regra que exceo
entre os IPs vegetais, e uma ampla
gama de combinaes observada. Alm de serem encontrados
inibidores com stios ativos repetidos, comum encontrar inibidores de serino-proteinases em combinaes com inibidores de cisteno-, aspartil-proteinases e amilases (Richardson, 1991). Isto, por
um lado, parece uma elegante
forma de economizar protenas,
mas o significado desses mltiplos
stios pode ser muito mais complexo. Ferreira et al. (1994) tm demonstrado que as enzimas digestivas de insetos
ocorrem muitas vezes em formas multimricas. Jongsma & Bolter (1997) pro-

pem que os efeitos da combinao de

inibidores multimricos com enzimas
multimricas em quantidades equimolares devem ser muito similar aos anticorpos policlonais e antgenos com mltiplos epitopos.
Os insetos polfagos so um caso
interessante. Ao longo da evoluo,
estes insetos desenvolveram a capacidade de atacar uma grande variedade
de espcies vegetais, incluindo mono e
dicotiledneas. Consequentemente, eles
foram capazes de responder a uma
gama de diferentes inibidores vegetais.
Isso vai de encontro aos resultados
obtidos pelo nosso grupo e descritos
acima. Recentes experimentos com plantas transgnicas utilizando genes de IPs
de monocotiledneas expressos em dicotiledneas e vice-versa, sugeriram que
aqueles insetos que normalmente se

Figura 4.
A metodologia do Phage Display
(Adaptado de Webster, 1996)

alimentam de mono ou dicotiledneas

so capazes de se adaptar a IPs de
diversos tipos de plantas (Lepl et al.,
1995). Para contornar estes problemas
de adaptao, seria interessante utilizar
IPs de espcies vegetais bastante separadas evolutivamente daquelas cujos
insetos so predadores. Duan et al.,
(1996) demonstraram que isso possvel a partir da obteno de plantas
transgnicas de arroz expressando o
inibidor de proteinase do tipo 2 de
batata. Os autores mostraram que as
plantas transgnicas foram protegidas
contra o ataque da praga Sesamia inferens.
Esta possibilidade est sendo
testada no nosso laboratrio com a
broca da cana-de-acar (Diatraea saccharalis) e os inibidores de proteinases
de soja (Kunitz e Bowman-Birk). Os
resultados da caracterizao das
proteinases das lagartas, seguido
da realizao de ensaios biolgicos com a incorporao dos IPs
de soja em dieta artificial, mostraram-se muito promissores (Patrcia Pompermayer, comunicao pessoal). Assim, os genes
que codificam para os IPs da soja
foram clonados e utilizados na
transformao gentica da canade-acar (Maria Cristina Falco,
comunicao pessoal).
Uma outra alternativa seria a
gerao de novas molculas de
inibidores de proteinases especficos contra enzimas de pragas
de importncia econmica. Esta
estratgia pode ser testada utilizando-se IPs engenheirados, com
suas afinidades otimizadas por
modelos computacionais, como
descrito por Urwin et al. (1995),
ou por phage display, como
proposto por Jongsma et al.
(1995b). Na metodologia do
phage display, mltiplas sequncias de genes inibidores, que
diferem apenas no stio da protena que interage com a proteinase do inseto so geradas, utilizando-se a tcnica da Reao da
Polimerase em Cadeia -PCR e
oligonucleotdeos degenerados.
A biblioteca clonada em um
fagomdeo ou um vetor M13
fusionado ao gene da capa protica - g3 - do fago, que expe as
protenas em sua superfcie. Esses fagos
so selecionados contra uma protena
de interesse (proteinase digestiva de D.
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

41

saccharalis, por exemplo), imobilizada

em suporte slido (uma placa Elisa, p.
ex.). Subseqentes lavagens eliminam
os fagos sem ou com pouca afinidade.
As partculas do fago com alta afinidade
so selecionadas para transformao de
E. coli, fornecendo novos genes e codificando inibidores de proteinase mais
especficos (Fig. 4). Essa metodologia
foi utilizada para a famlia de inibidores
do tipo Kunitz, gerando inibidores potentes e especficos contra vrias proteinases do tipo serina (Roberts et al.,
1992; Dennis & Lazarus, 1994). Esta
estratgia vem sendo explorada em
nosso laboratrio com o IP BowmanBirk de soja, dirigido contra as proteinases digestivas da broca da cana-deacar, D. saccharalis (Marcia O. de
Mello, comunicao pessoal).
Provavelmente algum mecanismo adaptativo ocorrer, apesar da
utilizao desta tecnologia. O que se
procura, na verdade, que esta adaptao seja mais lenta, de forma a permitir
um maior tempo de cultivo sem que a
presena dos insetos cause danos econmicos significativos cultura. A utilizao de vrios mtodos de controle
dentro do manejo integrado de pragas,
a diversificao do material cultivado,
de forma a diminuir a presso de seleo sobre a praga, rotao de culturas e
prticas culturais, retardariam o aparecimento de insetos resistentes.
A maioria das pesquisas atuais esto
focadas na expresso de inibidores de
proteinases nicos em plantas transgnicas. O sucesso deve ser mais significativo quando combinaes de IPs cobrirem o espectro de proteinases intestinais. Isto tornar mais difcil para o
inseto superar os efeitos dos IPs simplesmente aumentando a expresso de
genes de proteinases insensveis aos
IPs. Alguns desses genes podem ser
encontrados na natureza, mas a engenharia gentica tem permitido alter-los
de forma a torn-los mais eficientes.
Na verdade, necessrio compreender melhor o modo de ao dos IPs
sobre os insetos e as formas pelas quais
eles se adaptam. Esta promete ser uma
linha de pesquisa com muito espao
para crescer nos prximos anos.
Agradecimentos
Agradecemos a colaborao dos professores Walter R. Terra (Depto. de
Bioqumica, IQ/USP) e Jos Roberto P.
Parra (Depto. de Entomologia, ESALQ/
USP), FAPESP pelo suporte financeiro,
ao Bilogo Heraldo Negri de Oliveira
42

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

(Depto. de Entomologia, ESALQ/USP),

pelas fotografias.
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