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Reagente
gua milli-Q estril
Tampo da Pfu DNA Polimerase (5X)
MgCl2 (50 mM)
dNTPs (10 mM)
Primer forward (10 M)
Primer reverse (10 M)
DMSO (100%)
DNA molde (DNA genmico)
Pfu DNA Polimerase (2 U/L)
Quantidade
30,5 L
10 L
2,5 L
1 L
1 L
1 L
2,5 L
1 L
0,5 L
Concentrao Final
1X
2,5 mM
0,2 mM
0,2 M
0,2 M
5%
0,1 1 g
1U
Temperatura
95 C
94 C
69 C
72 C
72 C
4 C
Tempo
5 min
30 s
1 min
90 s
10 min
Questes
1) Compare as etapas da reao da PCR (desnaturao, hibridizao e extenso) com as etapas da replicao do
DNA na clula, destacando as diferenas e semelhanas.
2) Por que a PCR resulta em um fragmento de DNA de tamanho determinado?
3) Em uma PCR convencional, partindo de uma molcula de DNA, qual o nmero de molculas aps 30 ciclos?
4) Se fosse colocado apenas um dos primers, qual seria o nmero de molculas aps 2 ciclos? E aps 30 ciclos?
Informaes adicionais
No site NCBI (National Center for Biotechnology Information), esto disponveis sequncias de genes, RNA e
protenas de diversos organismos. No link http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6840451 encontram-se os registros
para o gene cas2 (Gene ID: 6840451).
Para mais informaes sobre as tcnicas, consultar: Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 3th Edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 2001.
B. Eletroforese do produto de PCR
Atravs de eletroforese em gel de agarose, verificaremos se o gene foi amplificado e se o tamanho do
produto de PCR est correto. Se positivo, procederemos, na prxima prtica, purificao do produto de PCR a
partir do gel de agarose para posterior ligao a um vetor de clonagem.
1)
2)
Retire 5 L do produto de PCR e adicione 1 L de tampo de amostra (soluo contendo: 20% (m/v) de Ficoll
400; 0,1 M de EDTA pH 8,0; 0,1% (m/v) de SDS e 0,25% (m/v) de azul de bromofenol).
Aplique a mistura em uma canaleta do gel de agarose 0,8%, contendo o corante Sybr Safe e, em seguida,
aplique a voltagem de 120 V por aproximadamente 40 min. Utilize o transluminador para analisar o gel no
comprimento de onda de 470 nm.