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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE

ET DE LA RECHERCHE

COLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES


Sciences de la Vie et de la Terre

MEMOIRE

Prsent par

Aurlien DENES

Pour lobtention du diplme de lEcole Pratique des Hautes Etudes

ETUDE COMPARE DE LEFFET DE DEUX PROTASES SUR


LA PRODUCTION D'HYDROLYSATS DOTS D'ACTIVITS
ANTIOXYDANTE ET ANTIRADICALAIRE.

Soutenu le 29 dcembre 2006:

Devant le jurysuivant:

- Madame Jeanine LE RHUN - Prsident de jury


- Monsieur Alain VAN WORMHOUDT - Examinateur
- Madame Fabienne GUERARD - Examinateur
- Madame Rozenn RAVALLEC-PLE Examinateur et rapporteur

Laboratoire EPHE
Evolution Molculaire et Adaptation Directeur: Dr A. Van Wormhoudt
Station de Biologie Marine (avw@mnhn.fr)
BP 225
29182 CONCARNEAU

Laboratoire d'accueil
ANTiOX Universit de Bretagne Occidentale Directrice et Matre de stage:
Ple universitaire P.J. Helias Dr F. Gurard
Creach Gwen (Fabienne.Guerard@univ-brest.fr)
29000 QUIMPER

RSUM

Lobjectif de ce mmoire est la production dhydrolysats de filets de lieu noir dots dactivits
antioxydante et antiradicalaire, ceci laide de protases commerciales dont les activits enzymatiques ont
t pralablement standardises. Les hydrolysats de protines de poisson prsentent un intrt en raison de
leurs proprits fonctionnelles et biologiques. Au cours des dernires annes, un grand nombre dhydrolysats
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gnrs partir de co-produits de la pche ont montr diverses activits: hormonales, stimulatrices de
croissance, immuno-modulatrices, anti-hypertensives, antioxydantes.

La standardisation des activits enzymatiques a t mise au point sur un substrat casine et a permis
de slectionner deux prparations enzymatiques commerciales pour la suite de ltude: lAlcalase 2.4 L et
lEsprase 8.0 L. Des hydrolyses contrles en racteur enzymatique ont t ralises sur le lieu noir dans
les conditions optimales dactivit des enzymes utilises, soit pH 8 et 55C. Les cintiques ont t suivies
pour diffrents ratios Enzyme/Substrat (E/S) par lvaluation du degr dhydrolyse (DH %) selon la mthode
du pH-stat. Les DH pH-stat (%) obtenus avec lAlcalase 2.4 L sont lgrement suprieurs ceux obtenus
avec lEsprase 8.0 L. Une tude comparative du calcul du DH par deux autres mthodes a montr que la
mthode lortho-phtaldialdhyde (OPA) permet dobtenir des valeurs de DH proches des valeurs du DH
pH-stat, les valeurs du DH Kjeldahl tant plus leves. Une tude mcanistique des facteurs limitants de
lhydrolyse a ensuite t initie pour expliquer lallure des courbes dhydrolyse obtenues. Il en ressort que le
substrat est le principal facteur limitant de lhydrolyse. Une lgre dsactivation des deux enzymes ainsi
quune faible inhibition de ces deux enzymes par les produits de lhydrolyse sont galement observes.

Les profils chromatographiques obtenus laide de lexclusion strique (SEC-FPLC) ont permis de
confirmer les diffrences de DH observes pour les deux enzymes tudies. Comparativement lEsprase
8.0 L, lAlcalase 2.4 L permet en effet dobtenir une hydrolyse plus pousse et donc une proportion plus
importante en peptides de faible poids molculaire. Les activits antiradicalaires values laide du test au
DPPH. sont faibles (infrieures 10 %). Inversement, les activits antioxydantes values par le test au ne
acide linolique sont leves et se situent en moyenne entre 60 et 65 %. Linfluence des paramtres de
lhydrolyse (temps de raction, ratio Enzyme/Substrat) sur les activits biologiques obtenues na pas pu tre
mise en vidence. Cependant, les valeurs dactivit du blanc dhydrolyse (sans enzyme) se sont avres
nulles, on peut en conclure que les activits obtenues ici sont donc exclusivement dues lhydrolyse
enzymatique.

Ces hydrolysats dots activits biologiques voient leur intrt crotre et se retrouvent de plus en plus
sur des marchs en plein essor comme la nutraceutique, les aliments fonctionnels ou bien la cosmtologie.

MOTS-CLES: Hydrolyse enzymatique, degr dhydrolyse, Alcalase 2.4 L, Esprase 8.0 L, activit
antioxydante, peptides, lieu noir, chromatographie dexclusion strique.

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES....................................................................................................... 3


LISTE DES ABREVIATIONS.............................................................................................. 5
INTRODUCTION................................................................................................................... 6

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.............................................................................................. 8
I. La valorisation des co-produits de la pche..................................................................... 8
I.1. Etat des lieux................................................................................................................ 8
I.2. Les diffrentes voies de valorisation des co-produits................................................ 8
I.3. Les principales applications des hydrolysats............................................................ 9
I.3.1. Lalimentation......................................................................................... 9
I.3.2. Les peptones.......................................................................................... 10
II. Lhydrolyse des protines.............................................................................................. 10
II.1. Les diffrents types dhydrolysats enzymatiques................................................. 11
II.1.1. Les produits ferments et les autolysats............................................... 11

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II.1.2. Les htrolysats................................................................................... 11


II.2. La classification des enzymes.................................................................................. 11
II.2.1. Les endopeptidases.............................................................................. 12
II.2.2. Les exopeptidases................................................................................ 12
II.3. Lutilisation denzymes exognes............................................................................ 12
II.3.1. Les enzymes dorigine vgtale............................................................ 13
II.3.2. Les enzymes dorigine animale............................................................ 13
II.3.3. Les enzymes dorigine microbienne..................................................... 13
II.4. Lactivit enzymatique............................................................................................. 14
II.5. Caractrisation de lhydrolysat............................................................................... 15
II.5.1. Le degr dhydrolyse........................................................................... 15
II.5.2. La caractrisation des hydrolysats par chromatographie................... 16
III. Lactivit antioxydante et antiradicalaire................................................................... 17
III.1. Les radicaux libres.................................................................................................. 17
III.1.1. Production endogne.......................................................................... 17
III.1.2. Production exogne............................................................................ 18
III.2. Le stress oxydatif.................................................................................................... 18
III.3. Les moyens de dfense contre les radicaux libres................................................ 20
III.3.1. Moyens endognes.............................................................................. 20
III.3.2. Moyens exognes................................................................................ 20
III.4. Les antioxydants..................................................................................................... 20
III.4.1. Mode daction des antioxydants......................................................... 20
III.4.2. Antioxydants naturels et de synthse................................................... 21
III.4.3. Les peptides antioxydants et antiradicalaires dorigine marine......... 22
III.5. Lvaluation de la capacit antioxydante in vitro................................................. 24

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................ 27

AAO : Activit antioxydante


AAR : Activit antioradicalaire
AC 50 : Concentration en protines qui permet dobtenir 50 % dactivit antioxydante
AGPI : Acide gras poly-insatur
ASC : Aire sous la courbe
ASR : Analyse de surface de rponse
BHA : Butylated hydroxyanisole
BHT : Butylated hydrotoluene
CAT : Catalase
DH : Degr dhydrolyse
DPPH : 1,1-diphnyl-2-picrylhydrazyl
EC : Enzyme commission
ERO : Espces Ractives de lOxygne
E/S : Rapport enzyme sur substrat
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FPC : Fish protein concentrate


FPH : Fish protein hydrolysate
GPX : Glutathion peroxydase
HAT : Hydrogen atom transfer
OPA : Ortho-Phtaldialdhyde
PM : Poids molculaire
SEC : Size exclusion chromatography
SET : Single electron transfer
SOD : Superoxyde dismutase
TCA : Acide trichloroactique
TNBS : Acide trinitrobenzenesulfonique
TROLOX : Acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramthylchroman-2-carboxylique
UA : Unit arbitraire
UT : Unit tyrosine

INTRODUCTION
Les ressources mondiales extraites du milieu aquatique reprsentent plus de 130 millions de tonnes
par an. Suivant les espces considres et le mode de transformation adopt, ces ressources gnrent par
anne de 30 85 % de dchets appels co-produits (ttes, peaux, viscres) (FAO-Sofia 2004).

Les nouvelles contraintes de gestion des ressources halieutiques imposent dadopter de nouvelles
stratgies de valorisation des co-produits.Actuellement, ces derniers sont principalement transforms en
farine et en huile mais cest une transformation faible valeur ajoute. Aussi, le circuit dlimination des coproduits de la filire pche et aquaculture en France a subi de fortes perturbations depuis lanne 2000,
notamment lies aux rpercussions des difficults apparues dans les filires animales (encphalopathie
spongiforme bovine, dioxines). Lamlioration des performances conomiques de la filire travers une
meilleure valorisation savre donc ncessaire (OFIMER, 2004).

Lhydrolyse enzymatique applique aux co-produits marins dans le but de produire de nouveaux
actifs constitue lune des voies possibles pour mieux valoriser ces ressources. Ce procd permet la
rcupration de protines qui conservent leur teneur en acides amins essentiels et sont susceptibles de
possder des fonctions biologiques. Ce travail sinscrit dans une approche innovante par rapport aux travaux
antrieurs de valorisation de la biomasse dorigine marine, qui portaient principalement sur les aspects
nutritionnels et fonctionnels des hydrolysats.

Ce mmoire a donc pour objectif la production dhydrolysats de filets de lieu noir dots dactivits
antioxydante et antiradicalaire, ceci partir de protases commerciales pralablement standardises sur un
substrat casine. Le choix de filets de lieu noir comme modle se justifie par une ralit industrielle de
valorisation des carcasses de poisson obtenues aprs les procds de filetage.

Lhydrolyse enzymatique pralable sur un substrat casine permet de standardiser les activits
enzymatiques des prparations commerciales utilises avant les hydrolyses sur le lieu noir. Ainsi, les units
dexpression de lactivit enzymatique sont tablies partir dune mme base de rfrence. La grande
majorit des travaux actuels sur le sujet ne relate quune comparaison des protases entre elles selon le poids
ou le volume utilis, ce qui nest pas trs raliste. En effet, les units dexpression de lactivit enzymatique
employes par les diffrents fournisseurs varient selon les enzymes et les conditions opratoires.

Les hydrolyses sur le lieu noir ont t ralises partir de deux prparations commerciales:
lAlcalase 2.4 L et lEsprase 8.0 L. Leur suivi a t ralis par lvaluation du degr dhydrolyse (DH %)
selon la mthode du pH-stat. Cette mthode a t compare avec celle de Kjeldahl et celle lorthophtaldialdhyde(OPA). Une tude mcanistique des facteurs limitants de lhydrolyse a ensuite t initie
pour expliquer lallure des courbes dhydrolyse obtenues.

La caractrisation des hydrolysats par chromatographie dexclusion strique (SEC-FPLC) a permis


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dobtenir la rpartition des peptides produits suivant leur poids molculaire. Lactivit antiradicalaire a t
dtermine laide du test au DPPH. et lactivit antioxydante partir du test au ne acide linolique.
Linfluence des paramtres de lhydrolyse (temps de raction, ratio Enzyme/Substrat) sur ces activits a t
tudie.

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

I. La valorisation des co-produits de la pche

I.1. Etat des lieux

Les ressources mondiales extraites du milieu aquatique reprsentent plus de 130 millions de tonnes
par an: environ 100 millions de tonnes sont issues du milieu marin et environ 30 millions de tonnes sont
issues de leau douce; ces deux domaines comprenant chacun captures et aquaculture.
La quantit de dchets que peuvent gnrer par an ces 130 millions de tonnes de ressource est estime entre
30 et 85 % suivant les espces considres et le mode de transformation adopt (FAO-Sofia 2004).

On nomme co-produits les dchets solides issus de la transformation de la matire premire, ceux-ci
incluant: les ttes, les viscres, la peau, les artes, la chair restante sur les carcasses, les chutes de filetage,
les carapaces, les coquilles etc En France, le tonnage brut de poissons donnant lieu des co-produits a t
estim 320 000 T en 2002. Le tonnage correspondant de co-produits a t estim 150 000 T, soit 47 % du
tonnage brut (OFIMER, 2004).

En situation de raret durable de la ressource, il est regrettable que les co-produits soient dans leur
ensemble si peu valoriss. Aussi, le circuit dlimination des co-produits de la filire pche et aquaculture en
France a subi de fortes perturbations depuis lanne 2000, notamment lies aux rpercussions des difficults
apparues dans les filires animales (encphalopathie spongiforme bovine, dioxines). Lamlioration des
performances conomiques de la filire travers une meilleure valorisation des co-produits gnrs par les
activits de mareyage, conserverie et saurisserie est donc ncessaire (OFIMER, 2004).

I.2. Les diffrentes voies de valorisation des co-produits

Aujourdhui, en France, la pche et laquaculture valorisent la quasi-totalit de leurs co-produits vers


des utilisations de faible valeur ajoute : 96 % des co-produits dorigine aquatique gnrs en France font
lobjet dune valorisation de masse sous forme de farine et dhuile (52 %), dhydrolysats de protines (21
%), de hachis congels (23 %), et divers (4 %: production daromes, de glatine, de collagne, de
chondrotine-sulfate, de cuir) (OFIMER, 2004). Les composs forte valeur ajoute reprsentent donc
moins de 10 % du march.

Traditionnellement, la plupart des co-produits de lindustrie de la pche a t convertie en huile ou en


farine de poisson par un procd combinant la cuisson, la sparation des solubles et des insolubles, la
concentration des solubles et la dshydratation des insolubles (Benjakul et al., 1997). Les huiles marines,
riches en acides gras essentiels, deviennent de plus en plus recherches dans les domaines pharmaceutiques,
de l'industrie cosmtique, et en tant que complments alimentaires. Les farines ou concentrs protiques de
poisson (Fish Protein Concentrates ou FPC) possdent de bonnes valeurs nutritives et une grande teneur en
acides amins essentiels mais sont peu solubles et possdent peu de proprits fonctionnelles. Ils sont
couramment utiliss en alimentation animale comme complments protiques mais peuvent causer des
inconvnients lis leur forte teneur en sels minraux et ncessitent par ailleurs de gros investissements et
une consommation importante dnergie. Ils constituent donc une voie de valorisation faible valeur ajoute.

Limage positive des produits marins et le dynamisme de la recherche dans le secteur permettent
denvisager un bon positionnement des filires pche et aquaculture dans les marchs de la cosmtique, de la
dittique et de la nutraceutique. Les avances scientifiques sur la composition chimique des co-produits et
en particulier sur le process dhydrolyse enzymatique laissent entrevoir de nouvelles voies de valorisation
plus forte valeur ajoute : extraction de lcithines marines, de peptones (pouvant constituer des substrats
azots pour la culture bactrienne) et de nombreuses substances bioactives intressantes (OFIMER, 2004).
Ces hydrolysats de protines de poisson (FPH ou Fish Protein Hydrolysates) peuvent tre dshydrats: on
obtient alors une poudre contenant une forte teneur en protines et prsentant comparativement aux FPC une

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meilleure stabilit, de meilleures proprits fonctionnelles, une meilleure solubilit dans leau, et des
proprits mulsifiantes. Les cots de production sont sensiblement suprieurs dans le cas des hydrolysats et
les rendements sont lgrement infrieurs en raison de llimination des rsidus dartes insolubles, mais la
valeur ajoute est beaucoup plus leve.

I.3. Les principales applications des hydrolysats

I.3.1. Lalimentation

Les hydrolysats protiques de poisson peuvent tre utiliss en alimentation humaine ou animale
pour leurs proprits aromatiques, fonctionnelles ou nutritionnelles.

Les hydrolysats peuvent tre utiliss comme base aromatique, notamment dans les soupes de poissons
et de crustacs. Les petits peptides et les acides amins jouent un rle important dans la saveur du
produit.

Les proprits fonctionnelles recherches pour la formulation dun aliment sont la solubilit, la
dispersabilit, les capacits moussantes et mulsifiantes et le pouvoir de rtention de leau et des
matires grasses. Ces diffrentes proprits sont dues 3 effets distincts qui accompagnent
lhydrolyse: la diminution du poids molculaire, laugmentation du nombre de groupes ionisables et
lexposition de groupes hydrophobes jusquici dissimuls (Panyam et Kilara, 1996).

Les hydrolysats peuvent servir de complments protiques en alimentation animale et humaine. Ils
permettent une meilleure assimilation des acides amins. De plus, leur teneur en acides amins
essentiels est suprieure ou gale celle de la protine standard du FAO/WHO (Barzana et GarciaGaribay, 1994 cits par Diniz et Martin, 1997 b).

En alimentation humaine, en 1990, Yu et al. ont dmontr que lutilisation dhydrolysats de protines
dOreochromis mossambicus dans les crackers (biscuits secs sals) amliore l'apparence, le
croustillant et la couleur. En 1992, des biscuits de poisson ont t dvelopps pour complter lapport
en protines ncessaires aux enfants dans les rgions conomiquement pauvres sur la cte Est de la
pninsule Malaisienne (Yu et al.). En 1994, un hydrolysat dAristichthys nobilis sch est propos
pour son utilisation comme supplment de protine dans des produits alimentaires populaires chinois
comme des crackers de poisson, des nouilles de poisson et des boules de poisson (Yu et al., 1994). A
noter par ailleurs, que pour la FAO, un hydrolysat de protines de poisson utilisable dans la
consommation humaine ne doit pas contenir plus de 0,5 % de lipides (w/w) dans le produit fini.

I.3.2. Les peptones

Les peptones sont des fractions dhydrolysats non coagulables et non prcipitables la chaleur, ce qui
permet leur utilisation en microbiologie. La croissance du domaine des biotechnologies ces dernires annes
a entran une demande plus forte concernant les milieux de culture en microbiologie. Jusqu prsent, la
casine et les dchets dabattoirs reprsentaient les seules principales sources de peptones de haute qualit.
Les diffrents travaux utilisant des protines de poisson hydrolyses dans des milieux de culture de
microorganismes font tous tat dune diminution du temps de latence ou dune augmentation de la biomasse
obtenue. Les peptones de poisson, grce leur bonne valeur nutritionnelle, se retrouvent aujourdhui de plus
en plus rfrences dans les catalogues des fournisseurs (Dufoss et al., 1997).

II. Lhydrolyse des protines

Lhydrolyse est une approche alternative pour rhabiliter les co-produits dorigine marine et qui
permet dobtenir partir de ceux-ci des produits pouvant prsenter de nouvelles proprits fonctionnelles
et/ou biologiques.

Lhydrolyse des protines peut tre obtenue par deux mthodes: lhydrolyse chimique ou
enzymatique (Gurard et al., 2005).

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Lhydrolyse des protines par des produits chimiques forts ou des solvants (acides ou basiques) est
souvent ralise dans des conditions drastiques: elle est amliore des tempratures, pressions et
pH levs. Une hydrolyse chimique ne peut pas tre contrle. On obtient donc gnralement un
mlange dacides amins libres, ayant une valeur nutritionnelle rduite et de faibles proprits
fonctionnelles. Ces produits jouent alors plutt le rle dexhausteurs de flaveur et de got pour la
viande,les gteaux secs ou les soupes (Kristinsson et al., 2000a).
Aprs acidification, lhydrolysat acide est neutralis, ce qui a pour consquence la prsence dune
forte concentration en sels dans le produit final qui devient alors difficilement tolrable en bouche.
Lhydrolyse acide dtruit galement le Tryptophane.

Dans le cas de lhydrolyse alcaline, des ractions dltres sont observes au cours de lhydrolyse
alcalinetelles que la racmisation des L-acides amins en D-AA non absorbs par lhomme, la
formation de liaisons disulfures, la destruction de certains acides amins (Cystine, Cystine,
Arginine, Mthionine). Un avantage cependant: le collagne prsente une solubilit leve en
milieu basique.

Lors de lhydrolyse enzymatique, les liaisons peptidiques des protines sont clives en milieu
aqueux, la raction tant catalyse par des protases. Un quivalent dun groupement a-carboxyl
ainsi quun groupe a-amin est form par le clivage dun quivalent dune liaison peptidique. A
noter que les peptides nouvellement forms peuvent tre de nouveaux substrats pour lenzyme
(Adler-Nissen, 1976).

II.1. Les diffrents types dhydrolysats enzymatiques

La production dhydrolysats de protines de poisson peut tre ralise de deux manires diffrentes
(Roy et Durand, 1997). Dune part, on trouve des hydrolysats traditionnelsavec les produits ferments et les
autolysats; et dautre part, on trouve les htrolysats.

II.1.1. Les produits ferments et les autolysats

Les produits ferments et les autolysats font intervenir dans le processus de transformation les
enzymes endognes prsentes dans les produits de dpart.

La fermentation est un moyen traditionnel utilis pour conserver le poisson, puisquelle permet de
limiter certaines prolifrations bactriennes par addition de sel ou de sucre. Elle permet en revanche
le dveloppement de bactries lactiques. Les protines sont hydrolyses par les enzymes endognes
et les bactries naturellement prsentes dans le mlange (Ockerman, 1992).

Les autolysats sont labors en plusieurs tapes partir de poissons entiers ou de viscres.
Lautolyse est ralise par les enzymes endognes, principalement les protases digestives (pepsine,
trypsine, chymotrypsine) ainsi que par les enzymes tissulaires (enzymes lysosomales ou
catepthiques).

Le produit rsultant de ces deux techniques est gnralement un liquide assez visqueux riche en
acides amins libres et en petits peptides. Ce produit traditionnel est la base de lalimentation de certaines
populations du sud-est asiatique apprciant les aliments got de poisson prononc: le Nuoc-mam ou sauce
de poisson saumur (Viet-nam), le Nam-pla (Thalande), le Mam-tom (Chine), le Shiokara (Japon)

II.1.2. Les htrolysats

Les htrolysats sont des hydrolysats obtenus laide de diffrentes prparations enzymatiques
commerciales et dans des conditions contrles permettant damliorer les proprits fonctionnelles du

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produit tout en conservant sa valeur nutritionnelle (Shahidi, 1995). Le paragraphe II.3nomm "lutilisation
denzymes exognes" dveloppe cette partie.

II.2. La classification des enzymes

Les enzymes utilises pour lhydrolyse des protines sont classes en tant que protases et se voient
attribuer les nombres E.C 3.4. dans la classification internationale Enzyme Commission. Dans lhydrolyse
enzymatique, le taux de clivage des liaisons peptidiques dpend principalement de deux facteurs: la
spcificit de lenzyme et laccessibilit aux liaisons peptidiques (Adler-Nissen, 1986). Parmi les enzymes
protolytiques nommes protinases, protases, ou peptidases, on retrouve deux groupes: les endopeptidases
et les exopeptidases.

II.2.1. Les endopeptidases

Elles agissent au coeur de la chane protique, coupant la protine en fragments plus petits. La liaison
entre deux acides amins adjacents dans la squence primaire est rompue donnant ainsi naissance deux
peptides. Ces enzymes sont classes selon leur mcanisme catalytique: srine, cystine (thiol), acide
aspartique et mtallo-endopeptidases. Les endopeptidases sont les enzymes les plus utilises pour lhydrolyse
des protines alimentaires de par leur plus large spcificit (Kristinsson et Rasco, 2000a).

II.2.2. Les exopeptidases

Ces enzymes hydrolysent les liaisons peptidiques par les extrmits libres de la chane protique. En
effet, elles ont besoin dun groupe amin ou carboxyle terminal libre dans le substrat pour librer des acides
amins ou des petits peptides (2-3 acides amins), elles sont alors nommes respectivement aminopeptidases
ou carboxypeptidases. Les exopeptidases sont classes selon leur mode daction. Elles peuvent par ailleurs
tre combines aux endopeptidases pour raliser une dgradation plus complte. En effet, ceci permet de
dgrader les petits peptides hydrophobes lorigine de lamertume des hydrolysats en acides amins libres
moins amers (Stevenson et al., 1998).

II.3. Lutilisation denzymes exognes

Les diffrentes enzymes mises en jeu lors de la prparation des hydrolysats enzymatiques sont
principalement des enzymes dorigine commerciale (enzymes exognes), ajoutes la prparation afin
dacclrer le processus dhydrolyse. Ce sont ces dernires qui nous intressent ici.

Lhydrolyse acclre utilisant une enzyme unique ou un mlange de protases commerciales


prsente de nombreux avantages tels que le contrle de lhydrolyse et des proprits de lhydrolysat, et
lutilisation dune temprature de catalyse modre (Diniz et Martin, 1996). Lhydrolyse enzymatique
permet, en effet, dobtenir des produits protiques solubles avec de bonnes proprits fonctionnelles (sans
dtriorer leurs valeurs nutritives) et susceptibles dtre utiliss en alimentation humaine ou animale. Elle
permet galement de contrler la formation de peptides amers et de maintenir une qualit uniforme et une
reproductibilit du produit (Liceaga-Gesualdo et al., 1999).

Lutilisation denzymes exognes augmente aussi de manire significative la quantit de protines


libres en comparaison avec lautolyse. Shahidi et al. (1995) rapportent que lutilisation denzymes
endognes pour hydrolyser du capelan (Mallotus villosus) permet de librer 22,6 % de protines, alors que
lhydrolyse par lAlcalase 2.4 L aboutit la libration de 70,6 % de protines.

Lhydrolyse enzymatique est une mthode approprie pour la prparation de peptides faon, non
seulement cause de la disponibilit denzymes grande chelle et des cots de plus en plus modrs,
mais aussi grce la grande qualit de ces produits. Un avantage trs important est la possibilit de pouvoir
diriger lhydrolyse vers des peptides particuliers souhaits en utilisant des enzymes avec des spcificits
dtermines. Lhydrolyse enzymatique est aussi sous linfluence dautres paramtres de contrle tels que la
temprature, le pH, le ratio Enzyme/Substrat (E/S) et le temps dhydrolyse (Liaset et al., 2000).

II.3.1. Les enzymes dorigine vgtale

Les protases dorigine vgtale les plus connues sontla papane, la bromlane, et la ficine. Ces
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protases permettent dobtenir des hydrolysats de bonne qualit mais leur production dpend de nombreux
facteurs externes tels que les conditions de culture, le cycle de croissance, les recommandations climatiques,
ce qui peut susciter des problmes de cot et dapprovisionnement. Ces enzymes ne sont pas spcifiques. La
ficine savre peu stable dans le temps. La papane, plutt adapte des protines prdigres, peut conduire
au stade acide amin libre et poser des problmes damertume (Durand, 1982).

II.3.2. Les enzymes dorigine animale

Les enzymes dorigine animale (porcine et bovine) sont principalement la trypsine, la


chymotrypsine, issues du pancras et la pepsine, issue de la muqueuse gastrique. Ces trois enzymes sont des
endoprotases prsentant des spcificits diffrentes. La trypsine a une affinit pour la lysine et larginine, la
chymotrypsine pour les acides amins aromatiques (Phe, Tyr, Trp) et la pepsine principalement pour les
acides amins hydrophobes (Alder-nissen, 1982). La pepsine est lenzyme dorigine animale la plus
largement utilise. Son utilisation pH acide prsente lavantage de limiter la contamination microbienne
mais ltape de neutralisation entrane de hautes teneurs en cendres prjudiciables pour dboucher sur la
production de peptones (Dufoss et al., 1997). De plus, la pepsine peut confrer un got amer aux
hydrolysats (De gero et al., 1971).

II.3.3. Les enzymes dorigine microbienne

Les enzymes microbiennes prsentent plusieurs avantages par rapport aux enzymes dorigine
animale ou vgtale: leurs types dactivit catalytique sont plus varis, leur stabilit face aux variations de
temprature et de pH est meilleure. De ce fait, elles reprsentent aujourdhui environ 90 % des enzymes
produites pour les procds industriels.

Lhydrolyse par lAlcalase 2.4 L a t tudie par de nombreux auteurs et son efficacit est bien souvent
meilleure que celle des autres enzymes.

Quaglia et Orban (1987) ont tudi lhydrolyse de sardine par lAlcalase 2.4 L, la papane et la
neutrase dans leurs conditions optimales de pH et de temprature. Il sest avr que lAlcalase 2.4 L et la
papane permettent dobtenir les meilleurs rsultats en terme de rendement en azote. Les hydrolysats
possdent de fortes teneurs en protines, de bonnes valeurs nutritionnelles et une bonne solubilit.

Benjakul et al. (1997) ont dfini les conditions optimales pour hydrolyser des dchets de merlan par
la Neutrase et lAlcalase 2.4 L. Cette dernire est la plus efficace et permet datteindre, dans ses conditions
optimales, un degr dhydrolyse de 60 % et un rendement en azote de 70 %.

Martin et Porter (1995) ont mis au point les diffrents paramtres (temprature, temps dhydrolyse,
pH, ratio enzyme/substrat) de lhydrolyse du capelan mle entier par lAlcalase 2.4 L. Ils ont obtenu un
hydrolysat riche en protines, pauvre en lipides et faible odeur.

Hoyle et Merritt (1994) ont hydrolys du hareng par lAlcalase 2.4 L et la papane. LAlcalase 2.4
L permet dobtenir un meilleur degr dhydrolyse avec une amertume plus faible.

Diniz et Martin (1997b) ont optimis lhydrolyse de roussette par lAlcalase 2.4 L en modlisant le
degr dhydrolyse (DH) en fonction de trois paramtres: pH, temprature et ratio enzyme/substrat. Un DH
avoisinant les 19 % est obtenu avec un ratio enzyme/substrat de 3,6 % 56C et pH 8,3.

Gurard et al., en 2001 et en 2002, ont utilis respectivement lAlcalase 2.4 L et lUmamizyme
pour lhydrolyse de co-produits de thon tropical. Ils montrent que les deux enzymes ont une efficacit proche
mais que lAlcalase 2.4 L prsente une meilleure stabilit face la temprature et une plus faible sensibilit
face linhibition par les peptides solubiliss au cours de lhydrolyse.

II.4. Lactivit enzymatique

Les activits enzymatiques dclares par les fournisseurs sont souvent obtenues dans des conditions
diffrentes des conditions opratoires utilises par les chercheurs. Ces derniers dplorent dailleurs le fait que
les activits enzymatiques dclares ne le sont alors qu titre indicatif (Kristinsson et Rasco, 2000a).

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Comparer lactivit des enzymes en fonction du volume ou du poids ajout na aucune ralit. En effet,
les activits enzymatiques rapportes la quantit denzyme utilise diffrent selon les enzymes et les
conditions opratoires. Un certain nombre de mthodes ont donc t dveloppes pour standardiser les
activits enzymatiques partir dun substrat dfini, et ce, avant les hydrolyses sur le substrat dintrt.

La mthode la plus ancienne utilise comme substrat la casine ou lhmoglobine. Lhydrolyse peut
tre ralise dans les conditions de pH et de temprature souhaites sauf au pHi du substrat. La dtermination
de lactivit catalytique se fait par dosage (Lowry) des acides amins Tyrosine librs dans le surnageant au
cours de lhydrolyse. Une unit dactivit correspond alors la quantit denzyme ncessaire pour produire
en une minute et dans des conditions prcises (pH et temprature) un hydrolysat dont labsorbance X nm
est la mme quune solution de tyrosine contenant Y g (ou mol) de tyrosine par mL.

Il existe galement une mthode colorimtrique utilisant des peptides p-Na (para-nitroanilide) et une
mthode fluorimtrique utilisant des peptides-AMC (aminomthylcoumarine) comme substrats. Lutilisation
de cette dernire mthode dpend de lactivit que lon veut mettre en vidence (exemple: Suc-Leu-LeuVal-Tyr-AMC pour une activit endoprotinase; Leu-AMC, Ala-AMC, Gly-Pro-AMC pour une activit
aminopeptidase). La difficult est donc de choisir le substrat permettant de dfinir une activit enzymatique
non spcifique. Cest une mthode utilise par exemple pour les Srine-protases (Chymotrypsine, Trypsine,
Elastase) et la dtection dactivits aminopeptidases. Aspmo et al. (2004) dclarent que ce type de substrat
nest pas optimal pour toutes les prparations enzymatiques commerciales, et en particulier pour la Neutrase.

Un substrat protique synthtique, lAzocoll, peut aussi tre utilis. Cest une prparation
majoritairement constitue de collagne (Kristinsson et Rasco, 2000a et b). Cest un test simple et donnant
des rsultats qualitativement similaires la casine (Ferreira et Hultin, 1994). Ces derniers ont galement
utilis lAzocoll pour dterminer les caractristiques cintiques de lenzyme (pH et temprature optimum).

En conclusion, quelle que soit la mthode choisie, le principal est dutiliser un substrat standard et de
travailler dans les conditions optimales de pH et de temprature de lenzyme tudie. Ces conditions
optimales doivent tre identiques celles utilises par la suite pour le substrat dintrt, sans quoi il devient
difficile de relier les informations obtenues; cest pourtant le problme majeur que lon retrouve dans la
littrature sur le sujet. Il est galement important de bien tablir comment est attribue la correspondance
activit protolytique/quantit de compos libr. Cependant, les mthodes utilisant les peptides p-Na ou les
peptides-AMC permettent difficilement de dterminer lactivit protolytique globale dune enzyme. La
mthode Azocoll est une mthode coteuse, non reproductible selon les lots, encore peu dveloppe et qui
pose le problme de larrt rapide de la raction. La mthode utilisant comme substrat la casine est la plus
intressante car moins contraignante que celle utilisant lhmoglobine. Cest une mthode longue, un peu
"laborieuse" mais fiable, et avec des protocoles bien dfinis.

II.5. Caractrisation de lhydrolysat

Un hydrolysat enzymatique est dcrit selon trois caractristiques:

la source de protines lorigine de lhydrolysat (substrat) fournit une information de base quant la
composition en acides amins,

le degr dhydrolyse (DH) est une valeur numrique (%) illustrant ltendue de la coupure de la
protine gnre par la raction,

le profil de poids molculaire (PM) quantifie la proportion (%) de peptides forms en fonction de leur
taille.

II.5.1. Le degr dhydrolyse

Diffrentes mthodes de mesure permettent de dterminer le degr dhydrolyse des liaisons


peptidiques. L es diffrentes mthodes retrouves dans la littrature sont, pour la plupart, bases sur trois
principes diffrents:

le dosage de la quantit dazote libr (par la mthode du Kjeldahl par exemple) au cours de la
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protolyse et rest soluble en prsence dun agent prcipitant, comme lacide trichloractique TCA
(Sathivel et al., 2003),

la dtermination des groupement s libres par dosage spectrophotomtrique par lacide


trinitrobenzesulfonique TNBS (Adler-Nissen, 1986) ou par lo-phtaldialdhyde OPA (Nielsen et al.,
2001),

la titration des protons librs par la mthode du pH-stat, base sur le maintien dun pH constant par
titration continue et automatique dune base ou dun acide. Dans cette mthode, le degr dhydrolyse
est dtermin par le nombre de liaisons peptidiques coupes (h) sur le nombre total de liaisons (h tot)
(Adler-Nissen, 1986). En milieu basique, pour des pH compris entre 6 et 9.5, le groupe amin sera
plus ou moins dissoci, librant ainsi des ions H+ qui seront neutraliss par les ions OH - provenant du
pH-stat. Le coefficient de dissociation du groupe amin va donc dterminer le facteur de
correspondance entre le nombre de liaisons coupes et le nombre de moles de base utilises pour
maintenir le pH constant. Adler-Nissen, en 1986, a tabli la formule suivante concernant le degr
dhydrolyse (DH) :

DH (%) = h = B.N b x 100


htot M p . htot .

Avec B : quantit de base consomme (en mL) pour maintenir le pH constant,


Nb : normalit de la base, M p : masse de protines (en g),
htot : nombre total de liaisons peptidiques dans la protine,
= (10 pH-pK) / (1 + 10pH-pK),
et pK = 7.8 + ((298 T) / (298 T)) 2400, avec T = temprature en Kelvin.

Le dosage de la quantit dazote libr par la mthode de Kjeldahl est relativement fastidieux et
ncessite dimportants volumes dchantillon. Par ailleurs, celui-ci ne peut seffectuer en continu lors du
process dhydrolyse. Cependant, cette mthode a t utilise avec succs sur des protines de poisson (Hoyle
et Merritt, 1994 cits par Kristinsson et Rasco, 2000a) et sur dautres protines alimentaires o, pour
lhydrolyse de lactosrum par la trypsine, une bonne corrlation a t relate avec la mthode du pH-stat
(Margot et al., 1994, cits par Panyam et Kilara, 1996).

La mthode du pH-stat constitue la mthode de rfrence car elle est utilise par de nombreux
auteurs pour un contrle en continu du degr dhydrolyse sur des protines alimentaires. Cest une mthode
simple, rapide, reproductible et non dnaturante. En revanche, Silvestre (1997) relate que les valeurs de DH
obtenues par cette mthode sont relatives et que leur exactitude doit tre contrle par dautres mthodes
telles celles au TNBS ou lOPA.

La mthode au TNBS, dveloppe par Adler-Nissen en 1979, est toujours utilise pour dterminer le
DH lors dhydrolyses de protines alimentaires. La mthode lOPA est cependant relate comme tant plus
facile mettre en uvre, plus rapide et plus sre dun point de vue environnemental. Elle est galement plus
sensible, mme si lOPA manque de ractivit avec la cystine et ne ragit pas avec la proline (Silvestre,
1997).

II.5.2. La caractrisation des hydrolysats par chromatographie

De nombreuses tudes ont t ralises sur la sparation des protines ou peptides par des procds
chromatographiques. La chromatographie liquide dexclusion de taille permet la caractrisation analytique de
mlanges peptidiques suivant leur poids molculaire, elle est galement utilise lchelle semi-prparative
ou prparative.

Les types de gels commerciaux utiliss le plus souvent pour une sparation basse pression sont les
gels Sephadex (Desportes et al., 2000) et Bio-gel (Franek et al., 2000). Leur domaine de fractionnement
dpend du type de gel et de leurs proprits respectives, ils peuvent tre utiliss dans la purification des

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protines mais aussi pour des mlanges peptidiques.


La colonne de type Superdex Peptide HR 10-300 GL (Amersham), qui consiste en un gel dagarose
et de dextran rticul, a t rapporte dans diverses tudes depuis 1997 pour des sparations de peptides
moyenne pression (SEC-FPLC). Cest une mthode simple et rapide et qui permet de contrler la
rptabilit de mmes hydrolysats produits dans le temps, ceci suivant la taille de leurs peptides. Son
domaine de fractionnement est compris entre 100 et 7000 Daltons. Smyth et FitzGerald (1997) ont observ
que ce gel permet une sparation performante pour les standards utiliss. Gurard et al. (2001a) ont
galement utilis cette colonne afin de caractriser un hydrolysat de protines de thon en utilisant un solvant
contenant 30 % dacetonitrile et 0,1 % de TFA dilu dans leau. Cependant, quelques effets de rtention ont
t remarqus pour des acides amins chargs ou des peptides contenant des rsidus hydrophobes, ceci
pouvant tre expliqu par des interactions hydrophobes ou lectrostatiques avec la colonne. Ces effets
peuvent tre limins par laugmentation de la concentration de la phase organique dans lluant.

III. Lactivit antioxydante et antiradicalaire

III.1. Les radicaux libres

Les radicaux libres sont des espces chimiques qui possdent un lectron non-appari (clibataire) sur
leur couche orbitale externe. Ils sont susceptibles de dgrader par oxydation les molcules biologiques et
seraient impliques dans le vieillissement cellulaire et divers tats pathologiques: inflammation,
athrosclrose, cancer.

Les radicaux libres sont trs instables de par leur configuration lectronique et leur dure de vie est
trs courte (environ 10-4 s). Leur ractivit rside dans le fait quils recherchent un lectron pour rapparier
leur lectron clibataire, entranant la propagation du phnomne par cration dun nouveau radical libre. Il
se produit ainsi des ractions en chane qui peuvent aboutir des dnaturations ou destructions au niveau
cellulaire (Gards-Albert, 2003). Les radicaux libres peuvent tre produits par notre propre organisme au
cours de ractions particulires, il sagit de la voie endogne de production de radicaux libres. Les radicaux
libres peuvent galement avoir une origine exogne lie notre environnement.

III.1.1. Production endogne

Loxygne que lon respire est ncessaire aux ractions chimiques nous permettant de produire notre
nergie. Cest au cours de ce mtabolisme normal de loxygne (rduction de l'oxygne molculaire en eau)
dans les mitochondries que la plupart des radicaux libres se forment. Le passage dune molcule doxygne
deux molcules deau ncessite laction de quatre lectrons: O2 + 4 e- + 4 H+ 2 H2 O.

Cependant, et jusqu 5 % des cas, on peut assister une rduction incomplte de loxygne en eau.
Cette rduction incomplte aboutit la production de loxygne singulet ( 1O2) mais surtout de lanion
superoxyde (O2 l_ ). La dismutation de O2 l_ va donner naissance au peroxyde d'hydrogne (H2 O2 ) puis
indirectement au radical hydroxyl (OH l). Lexpression Espces Ractives de lOxygne (ERO) dsigne
ces radicaux libres issus de loxygne, et les molcules non radicalaires (H2 O2 , HOCl, oxygne singulet)
pouvant engendrer des radicaux libres.

Les radicaux libres peuvent galement tre produits lors de la dfense antibactrienne. Les cellules
phagocytaires actives pendant la raction inflammatoire vont librer un anion superoxyde O2 l_ . Ce
phnomne est appel la flambe respiratoire. Les radicaux superoxydes forms peuvent alors subir eux aussi
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des transformations donnant naissance aux drivs oxygns toxiques prsents ci-dessus.

III.1.2. Production exogne

Lorganisme humain est soumis lagression de diffrents agents extrieurs capables de donner
naissance des espces oxygnes ractives (Favier, 2003):

Les rayonnements UV (par lintermdiaire dagents photosensibilisants) et les radiations ionisantes


induisent la synthse de radicaux libres drivs de loxygne tels que O 2 l_ , OH l, 1 O2 et de molcules
gnratrices de radicaux libres.
Loxyde dazote (NO) et le dioxyde dazote (NO 2 ), des toxiques prsents dans notre environnement (suie,
goudron, tabac, polluants industriels) sont galement responsables de la synthse de radicaux libres. Ils
sont lorigine dune auto-oxydation des acides gras poly-insaturs (AGPI) des alvoles pulmonaires.
Il a aussi t montr que lingestion dalcool pouvait tre lorigine de la production de radicaux libres.
Ils sont produits au cours de loxydation de lactaldhyde, principal mtabolite de lthanol.
Enfin, certains mdicaments anti-cancreux comme les anthracyclines peuvent aussi gnrer des radicaux
libres.

III.2. Le stress oxydatif

Le stress oxydatif apparat donc quand un dsquilibre se forme dans la balance anti/prooxydants. Cest seulement ce moment que les ERO vont exercer leur action dltre sur lorganisme.

Les radicaux libres sont responsables de dommages sur toutes les molcules biologiques comme les
lipides, les protines, les acides nucliques, ou les hydrates de carbone(Favier, 2003):

Au niveau de lADN, les radicaux libres peuvent induire des effets mutagnes ou un arrt des rplications.

Les lipides sont une cible privilgie des radicaux libres. Ceux-ci provoquent en effet loxydation des
acides gras poly-insaturs (AGPI) des phospholipides membranaires (principaux constituants des
membranes des cellules), mais aussi des organites cellulaires et des noyaux. Ce phnomne est appel
peroxydation lipidique ou lipoproxydation.

Les radicaux libres peuvent aussi agir sur les macromolcules en provoquant des inactivations
enzymatiques, des fragmentations de ces molcules (collagne, protoglycannes, acide hyaluronique) et la
formation de dimres ou dagrgats protniques dans les membranes cytoplasmiques.

Les mcanismes doxydation des composs insaturs biologiques (acides gras, carotnodes,
polyphnols) sont souvent des ractions radicalaires avec loxygne molculaire et prsentent trois phases
principales (Huang et al., 2005).

Une phase dinitiation qui peut tre due lintervention dun radical hydroxyle HO l qui arrache un atome
dhydrogne en position

RH + HO l Rl + H2 O

Larrachement du proton est facilit tant par la chaleur (agitation molculaire) que par les
rayonnements ou les catalyseurs (mtaux tels que Cu, Fe, Co, Mn, Ni).

Une phase de propagation: en prsence doxygne, il se forme un radical peroxyde (ROO) qui
dstabilise une deuxime molcule dAGPI et conduit un hydroperoxyde lipidique (ROOH) et un
nouveau radical, assurant ainsi la propagation du processus:

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Rl + O2 ROOl
ROOl + RH ROOH + Rl

Une phase de terminaison, o se recombinent diffrents radicaux forms pour aboutir des
composs stables:
Rl + Rl RR
ROOl + Rl ROOR
ROOl + ROOl ROOR + O2

III.3. Les moyens de dfense contre les radicaux libres

III.3.1. Moyens endognes

Le systme de dfense endogne aux organismes comprend:

La dfense enzymatique (Favier, 2003) : la suproxyde dismutase (SOD), la glutathion peroxydase


(GPX) et la catalase (CAT). La SOD est lune des rares enzymes avoir un radical libre comme substrat, en
loccurrence lanion superoxyde, O2 l_ . Le proxyde dhydrogne produit sera ensuite dtoxifi par la
catalase et la glutathion peroxydase, empchant ainsi la production du radical hydroxyle.

La dfense non enzymatique(Nakazawa et al., 1996) : le glutathion, agent antiradicalaire, est compos
de 3 acides amins: cystine, acide glutamique et glycine. Les deux derniers acides amins sont produits
rapidement par lorganisme mais la cystine est un acide amin semi-essentiel, qui doit donc tre prsent
dans notre alimentation. Le glutathion a, en plus de son rle de cofacteur des peroxydases, le pouvoir de
capter directement les radicaux libres, notamment OH l.

La cruloplasmine est une protine plasmatique dont la fonction normale est de transporter le cuivre.
Il a t dmontr in vitro quelle possdait une activit de pigeage de O2 l_ et OH l.

Lacide urique, la bilirubine, lalbumine, la ferritine, la transferrine et la lactoferrine ont galement un


rle dantioxydant vis--vis dOHl en agissant comme chlateurs de mtaux de transition (fer et cuivre) et
donc en inhibant la raction de Fenton. De plus, lacide urique et la bilirubine participeraient au pigeage de
O2 l_ , OH l et lalbumine au pigeage de OH l.

III.3.2. Moyens exognes

Les moyens exognes qui permettent de se dfendre contre les radicaux libres ncessitent un apport
extrieur en composs que lorganisme est incapable de fabriquer. Ces composs, que lon peut regrouper
sous le terme gnral d"antioxydants" peuvent tre de nature varie. Le paragraphe suivant y est consacr
(cf III.4).

III.4. Les antioxydants

Un antioxydant est dfini comme une substance qui, ajoute faible dose un produit naturellement
oxydable lair, est capable de ralentir ou dinhiber le phnomne doxydation (Park et al., 2001). Cette
dfinition peut tre largie et le terme "antioxydant" englobe ainsi toutes les substances qui protgent les
systmes biologiques contre les effets dltres potentiels des processus ou ractions qui engendrent une
oxydation excessive (Berthou, 2002).

III.4.1. Mode daction des antioxydants

Indpendamment de leur localisation, les antioxydants peuvent agir deux niveaux : en prvenant la

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formation de radicaux libres oxygns ou en purant les radicaux libres oxygns. En complment de cette
double ligne de dfense, lorganisme est en outre capable de rparer ou dliminer les molcules
endommages par lattaque radicalaire (Gards-Albert, 2003).

Les antioxydants prventifs ont une action stabilisatrice en dcomposant par exemple les peroxydes
en des produits stables de terminaison ce qui empche directement la formation des radicaux libres. Ils
peuvent aussi chlater les catalyseurs des ractions doxydation tels que les ions mtalliques ou bien ragir
avec loxygne.

Les pigeurs des EROrentrent en comptition avec des radicaux dj existants et contribuent
bloquer la phase de propagation. On diffrencie deux types de pigeage(Huang et al., 2005):

- le premier par libration dun atome dhydrogne, souvent par une structure aromatique (cas des
drivs du phnol: tocophrols, polyphnols, flavonodes):

- et le deuxime par libration dun lectron.

La combinaison de ces antioxydants prventifs et pigeurs peut gnrer des effets synergiques.

III.4.2. Antioxydants naturels et de synthse

La prsence dantioxydants dans les aliments permet dviter le rancissement d loxydation cause
par loxygne, la lumire, la chaleur ou le contact de certains mtaux. Cest souvent le cas des aliments
riches en lipides comme les huiles. Loxydation peut galement entraner la formation de composs
secondaires potentiellement toxiques (Moure et al., 2001). Cest pourquoi les industriels ajoutent des
molcules dans les aliments pour augmenter leur dure de vie. Leur prsence savre galement ncessaire au
sein des produits pharmaceutiques, cosmtiques ou des plastiques afin dviter leur dgradation.

Il existe plusieurs groupes dantioxydants naturels:

- Les vitamines: la vitamine A, ou bien son prcurseur le ne, la vitamine E (tocophrol) ou encore la
vitamine C (acide ascorbique). On les trouve dans de nombreux fruits et lgumes. Des antioxydants naturels
comme le b-carotne et le lycopne de la tomate prviennent les lsions cellulaires (Norman, 2001).

- Les composs phnoliques: en effet, la plupart des antioxydants de synthse ou dorigine naturelle
possdent des groupes hydroxyphnoliques dans leurs structures. Les composs phnoliques naturels les plus
connus sont les polyphnols comme les flavonodes (catchines, flavonols, antocyanidols) et les tannins que
lon retrouve en grande quantit dans le vin. Le th est galement une source importante de composs
phnoliques (Gards-Albert, 2003).

- Les oligolments: le slnium, le cuivre, le manganse, ou encore le zinc. Ils ont une valeur hautement
protectrice du fait de leur prsence dans de nombreuses mtallo-enzymes action antiradicalaire.
Parmi les antioxydants dorigine naturelle, on remarque que les tocophrols prsentent une faible
efficacit pour un cot de production lev. Quant lacide ascorbique, il peut se comporter comme une
substance pro-oxydante forte concentration (Moure et al., 2001).

Les antioxydants de synthse:

Dans la famille des gallates (esters de lacide gallique), le gallate de propyle (E310) est le plus
rencontr. Les plus efficaces rencontrs par rapport leur faible cot pour retarder loxydation lipidique sont
le BHT (ButylHydroxyTolune) et le BHA (ButylHydroxyAnisole). Cependant, il a t montr que ces
antioxydants de synthse pouvaient tre toxiques (Yu et al., 2000). En effet, le BHA convertirait certains
produits ingrs en substances toxiques ou carcinognes en augmentant la scrtion des enzymes
microsomales du foie et des organes extra-hepatiques (Barlow, 1990). Le BHT prsenterait des effets
carcinognes chez le rat (Ito et al., 1985).

De nouvelles recherches sont donc menes afin de dcouvrir de nouveaux antioxydants dorigine
naturelle. Ainsi, de nombreuses tudes se sont intresses aux proprits antioxydantes des pices, du soja
(Gibbs et al., 2004) ou de nombreux fruits ou lgumes (Garcia-Alonso et al., 2004; Karadeniz et al., 2005).
Les colorants ont galement fait lobjet de recherches ce sujet et il a t rvl que la chlorophylle a
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(Lanfer-Marquez et al., 2004) ou les anthocyanines contenues dans les baies (Khknen et al., 2004)
possdaient des proprits antioxydantes intressantes.

Par ailleurs, de nombreuses tudes ont dj dcrit lactivit antioxydante dhydrolysats de protines
tels que la casine du lait (Suetsuna et al., 2000a), le soja (Chen et al., 1995, 1996, 1998), les protines du
jaune duf (Park et al., 2001; Sakanaka et al., 2004), lalbumine de blanc duf (Uchida et al., 1992), les
protines de porc (Saiga et al., 2004).

Des tudes menes ces dernires annes ont galement dmontr les proprits antioxydantes
dhydrolysats dorigine marine.

III.4.3. Les peptides antioxydants et antiradicalaires dorigine marine

Depuis quelques annes, les hydrolysats de protine ou les extraits dorigine marinevoient leur intrt
augmenter. Daprs la littrature, lactivit antioxydante / antiradicalaire semble lie certaines
caractristiques communes des peptides bioactifs.

v La taille des peptides actifs: en effet, tous les peptides antioxydants recenss ont une taille infrieure
20 acides amins.

v La composition en acides amins semble jouer un rle important sur lexpression de lactivit des
peptides actifs. Chen et al. (1995) ont isol, dans un hydrolysat de protines de graines de soja, six
peptides inhibant fortement lauto-oxydation de lacide linolique. Ces peptides sont composs dacides
amins hydrophobes (Val ou Leu) en position N-terminale et des acides amins Pro, His, Tyr dans
leurs squences. Uchida et al. (1992) ont montr que 4 peptides sur les 6 isols contiennent des rsidus
Histidine, les deux autres contiennent des rsidus Tyrosine, donneurs potentiels dlectrons. Des
rsultats similaires ont t obtenus par Park et al. (2001), dans un hydrolysat de lcithine de jaune
duf: les deux peptides prsentant la plus forte activit antioxydante, composs de 10 et 15 acides
amins, contiennent chacun un acide amin Leu en position N-terminale. Par rapport la composition
en acides amins, il se dgage de la littrature certaines tendances quant lactivit antioxydante et/ou
antiradicalaire des peptides actifs.

Les acides amins aromatiques (Tyr, Trp, Phe) joueraient un rle de pigage des radicaux
libres par libration datomes dhydrogne (Kim et al., 2001; Saito et al., 2003).

Les acides amines hydrophobes (Val, Leu, Phe) favoriseraient les interactions entre peptides
et acides gras (Chen et al., 1998; Moure et al., 2005).

LHistidine aurait une capacit donner des atomes dhydrogne, piger les radicaux
peroxyles lipidiques et chlater les ions mtalliques du fait de la prsence du groupement
imidazole (Chan et Decker, 1994).

Les acides amins basiques (Asn, Gln), du fait de leur capacit accepter des lectrons,
bloqueraient la chane doxydation (Suetsuna et al., 2000a).

Les acides amins chargs (Lys, Arg), de par leur groupement amine/carbonyle,
participeraient la chlation des ions mtalliques (Pena-Ramos et al., 2004; Gibbs et al.,
2004).

Il est constat galement une rcurrence de certaines squences dans les peptides
antioxydants(ex: Glu-Pro-Hyp) (Kim et al., 2001).

v Cependant, lactivit antioxydante de peptides contenant des rsidus His et dautres acides amins
excde celle de ces mmes acides amins libres dans un mlange aqueux (Yee et al., 1980). En effet,
Yamaguchi et al. (1975) ont montr que des dipeptides prsentant Tyr et Trp en position N terminale et
His et Met en position C terminale ont une meilleure activit antioxydante que les mmes acides
amins libres dans une solution aqueuse.
Il semble donc que lagencement des acides amins au sein des peptides prsente galement une

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importance. Afin dapprofondir la comprhension de ce phnomne, Chen et al. (1996) ont utilis le
plus petit peptide squenc en 1995 (LLPHH) comme modle afin de caractriser les proprits
antioxydantes. En effet, la dltion de la Leu en position N-terminale naffecte pas lactivit
antioxydante. Par contre, la dltion de lHis en position C-terminale provoque la diminution de
lactivit, montrant ainsi que le segment HH joue un rle majeur dans lactivit antioxydante du peptide
et que laddition de Leu ou Pro en position N-terminale augmente lactivit antioxydante. La squence
N-terminale pourrait donc avoir un rle cl dans lactivit de ce peptide. Le peptide synthtis
prsentant la plus forte activit antioxydante a pour squence PHH (Pro-His-His). Le positionnement
correct des groupements imidazoles est donc essentiel. Cependant, la relation entre la structure et
lactivit des peptides contenant des acides amins His nest pas encore bien dfinie ce jour.

En conclusion, ltude bibliographique ralise sur les peptides activit antioxydante et


antiradicalaire rvle que quelques caractristiques communes ces peptides ont t mises en vidence.
Cependant, on ne peut de manire gnrale tablir de relation claire entre la structure de ces peptides actifs et
lactivit antioxydante.
III.5. Lvaluation de la capacit antioxydante in vitro

Les antioxydants peuvent ragir diffrentes tapes du procd doxydation et ils peuvent avoir plus
dun mcanisme daction, ce qui ne facilite pas leur classification (Frankel et Meyer, 2000).

Selon Huang et al. (2005), les mthodes dvaluation de lactivit antioxydante in vitro peuvent tre
divises en deux grandes catgories suivant les ractions mises en jeu :

Les tests bass sur le transfert dun atome dhydrogne (HAT, Hydrogen Atom Transfer), dans
lequel lantioxydant et le substrat sont en comptition pour les radicaux peroxyles ROOl:
ROOl + AH ROOH + Al
ROOl + LH ROOH + Ll

Les tests bass sur le transfert dun lectron (SET, Single Electron Transfer), dans le cadre desquels
on mesure la capacit dun antioxydant rduire un oxydant, qui change de couleur quand il est rduit:

M(n) + e - (de AH) AH l+ + M(n-1)

Les lipides sont les principaux constituants alimentaires vulnrables loxydation, qui se traduit par
une dtrioration gnralise de laliment. La dgradation oxydative des lipides conduit des modifications
de texture, dodeur, de got (volution vers le rancissement), il sensuit une perte de stabilit de laliment,
qui se rpercute alors sur sa dure de conservation. Diverses mthodes de dosage de lactivit antioxydante
in vitro dans des aliments ou dans des systmes biologiques, induisent loxydation de lipides ou lipoprotines
dans des conditions standardises. Lactivit antioxydante est dtermine partir de la mesure de
linhibition de cette oxydation.

Dautres protocoles de dosage mesurent lactivit antioxydante par pigeage des radicaux libres,
cest--dire lactivit antiradicalaire.

En rsum, il nexiste pas de test in vitro de rfrence pour valuer lactivit antioxydante dun
chantillon, sachant de plus que cet chantillon peut prsenter divers mcanismes daction. Il faut donc
combiner les rponses obtenues laide de tests diffrents et complmentaires pour avoir une indication
sur la capacit antioxydante de lchantillon tester.

Les tests qui ont t raliss dans le cadre de ce mmoire sont les suivants:

- Le test au ne acide linolique,bas sur la destruction oxydative du ne sous leffet de la


chaleur, de la lumire et de loxygne, ce qui entrane la dcoloration du ne. Lactivit antioxydante est
dtermine partir de la mesure de linhibition de cette oxydation (Miller, 1971).

Le test au DPPHl (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), bas sur le pigeage du radical libre stable DPPHl
par une molcule antiradicalaire, ce qui entrane la dcoloration du DPPHl (Morales et JimenezPerez, 2001)
Lavantage de lutilisation combine de ces deux diffrents tests rside dans leur complmentarit. En
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effet, le premier est bas sur linhibition de la peroxydation lipidique et mesure une activit antioxydante; le
deuxime est bas sur le pigage de radicaux libres et mesure une activit antiradicalaire. Aussi, le test au
DPPHl, test rapide et facile mettre en uvre, seffectue temprature ambiante, ceci permettant dliminer
tout risque de dgradation thermique des molcules testes. Dautre part, le test au ne acide linolique a
t choisi car cest une mthode un peu laborieuse mais reproductible et fiable.

Le test ORAC (

Le test au nitrobleu de ttrazolium (NBT) (Vivas et al., 1997), bas sur la rduction du ttrazolium
en bleu de formazan par les radicaux superoxides, fait aussi partie du savoir-faire du laboratoire, mais na
pas t utilis dans le cadre de ce mmoire.

Actuellement en cours de validation au laboratoire, deux nouveaux tests peuvent tre cits: la mesure
du pouvoir rducteur (Jayaprakasha et al., 2001) et lactivit de chlation des ions Fe2+ (Huang, et al., 2005).
Le test sur le pouvoir rducteur met en avant la capacit dune molcule rduire un oxydant en lui cdant
un lectron. Cette molcule pourra donc rduire les radicaux libres.
Le test sur la chlation des ions Fe2+ quand lui, met en avant la capacit dune molcule fixer les ions
Fe2+. Les ions Fe2+ jouent un rle important lors de la production des radicaux libres notamment lors de la
raction de Fenton, qui survient chaque fois quune molcule dH2 02 est en contact dions Fe2+ et qui est
lorigine de la production des radicaux hydroxyl (OH), un des radicaux les plus ractifs. Le fer joue aussi un
rle dans la phase de propagation de la lipoperoxydation ainsi que dans la formation du radical O2
Le laboratoire dveloppe galement des tests plus volus sur modle cellulaire. Il sagit de tester
deux effets des hydrolysats: le premier est leurcytotoxicit sur les cellules et le deuxime est leffet
protecteur des hydrolysats sur les cellules soumises un stress oxydant dorigine chimique (H2 O2 ) ou
physique (rayonnement UV).
Le test au MTT en est un exemple. Il est bas sur le clivage du sel de ttrazolium MTT en bleu de formazan
(suivi par spectrophotomtrie 570 nm) par une enzyme mitochondriale, la succinate dshydrognase. Cette
conversion a lieu dans les cellules vivantes uniquement et la quantit de formazan produite est
proportionnelle au nombre de cellules prsentes, le MTT est donc un indicateur de lactivit cellulaire. La
viabilit peut tre teste sur diffrents types de cellules comme des hpatocytes de rat, des fibroblastes de
poumon humain, des cellules de la muqueuse intestinale de rats, des neuroblastes humainsCes cellules sont
alors soumises un stress oxydatif au t-BHT (tert-butylhydroperoxyde), aux "cumene hydroperoxides" ou au
H2 O2 . Les cellules vivantes sont rvles par le bleu de Tripant (Rajapakse et al., 2005; Mendis et al.,
2005). Le test de cytotoxicit consiste valuer limpact de concentrations croissantes en chantillon sur la
viabilit des cellules. Le test de leffet protecteur consiste examiner la rponse des cellules face un stress
quand elles ont t mises en contact avec lchantillon.

lheure actuelle, lvaluation du stress oxydant sur modle animal ou humain est peu pratique car
ces mthodes in vivo sont complexes et coteuses. Toutefois, il existe des tests permettant dvaluer le
potentiel global de dfense antiradicalaire comme le test KRL, et dvaluer la capacit antioxydante totale.
Le test KRL est effectu sur un chantillon sanguin qui est soumis une attaque radicalaire et on mesure le
temps ncessaire la lyse de 50 % des cellules. Ces mesures de rsistance antiradicalaire sont reprsentatives
du potentiel global. Le test sur la capacit antioxydante totale est galement effectu sur un chantillon de
sang. Il consiste valuer la capacit que possde le sang complet inhiber la production despces
ractives de loxygne gnres par un systme in vitro. Selon le docteur Nataf il existe quatre marqueurs
possdant un intrt dans le dosage du stress oxydatif. Il sagit du 8ohdG urinaire, un marqueur de la
dgradation oxydative de lADN, du F2 alpha, un marqueur de la peroxydation lipidique, du malonyldialdhyde, galement un marqueur de la peroxydation lipidique dont le dosage se fait par chromatographie
et de lallantone, un marqueur des dommages oxydatifs dans la cellule lis leffort physique (Nutranews,
2005).

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