Espectrometra de fluorescencia

La espectrometra de fluorescencia (tambin llamada fluorometra o

espectrofluorimetra) es un tipo de espectroscopia electromagntica que analiza la
fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz
ultravioleta, que excita los electrones de las molculas de ciertos compuestos y
provoca que emitan luz de una menor energa, generalmente luz visible (aunque no
necesariamente). Una tcnica complementaria es laespectrometra de absorcin.
Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluormetros o fluormetros.

TEORA DE LA FLUORESCENCIA
Las molculas tienen diferentes estados llamados niveles de energa. La
espectrometra de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y
electrnicos. En general, las especies objeto de examen tendrn un estado
electrnico basal (un estado de baja energa) de inters, y un estado electrnico
excitado de mayor energa. Dentro de cada uno de estos estados electrnicos hay
diferentes estados vibracionales.
En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la
absorcin de un fotn de luz, desde su estado electrnico basal a uno de los distintos
estados vibracionales del estado electrnico excitado. Las colisiones con otras
molculas causan que la molcula excitada pierda energa vibracional hasta que
alcanza el estado vibracional ms bajo del estado electrnico excitado.
La molcula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibracin del estado
electrnico basal, emitiendo un fotn en el proceso. Como las molculas pueden
caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibracin en el estado basal, los
fotones emitidos tendrn diferentes energas y, por lo tanto, frecuencias. As pues,
mediante el anlisis de las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometra
de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la
estructura de los diferentes niveles de vibracin.
En un experimento tpico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente
emitida por una muestra, manteniendo la luz de excitacin a una longitud de onda
constante. A esto se le llama espectro de emisin. Un espectro de excitacin se mide
mediante el registro de una serie de espectros de emisin utilizando luz de
diferentes longitudes de onda.

INSTRUMENTOS
En la espectrometra de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de
instrumentos:

* Fluormetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz

fluorescente.
* Espectrofluormetros. Usan monocromadores de retculo de difraccin para aislar
la luz incidente y la luz fluorescente.
Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema. La luz de una fuente de
excitacin pasa a travs de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra. Una
parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de las molculas de
la muestra producen una fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en todas las
direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a travs de un segundo filtro o
monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90 con
respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente
reflejada o transmitida llegue al detector.
Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitacin, incluyendo
el lser, fotodiodos y lmparas; arcos de xenn y lmparas de vapor de mercurio. Un
lser slo emite luz de alta irradiancia en un intervalo muy estrecho de longitudes
de onda, por lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el monocromador de
excitacin o el filtro. La desventaja de este mtodo es que la longitud de onda de un
lser no se puede cambiar mucho. Una lmpara de vapor de mercurio es una lmpara
lineal, lo que significa que emite luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el
contrario, un arco de xenn tiene un espectro de emisin continuo con intensidad
casi constante en el rango de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para las
mediciones hasta justo por encima de 200 nm.
En los fluormetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador
transmite luz de una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo ms comn de
monocromador utiliza un retculo de difraccin; es decir, la luz colimada entra en
una rejilla y sale con un ngulo diferente dependiendo de la longitud de onda. El
monocromador puede entonces seleccionar qu longitudes de onda transmite. Para
permitir mediciones de anisotropa se aaden dos filtros de polarizacin: uno
despus del monocromador de excitacin o filtro, y otro antes del monocromador de
emisin o filtro.
Como se mencion antes, la fluorescencia se mide ms a menudo en un ngulo de
90 en relacin a la luz de excitacin. Esta geometra se utiliza en lugar de colocar
el sensor en la lnea de la luz de excitacin en un ngulo de 180 a fin de evitar la
interferencia de la luz de excitacin transmitida. El monocromador no es perfecto y
transmitir la luz con otras longitudes de onda diferentes a las establecidas. Un
monocromador ideal slo transmite luz en el rango especificado y tiene una
transmisin independiente de la longitud de onda. Al medir en un ngulo de 90, slo
la luz dispersa por la muestra provoca luz. Esto se traduce en una mejor relacin
seal-ruido, y reduce el lmite de deteccin a un factor de aproximadamente 10000,
si se compara con la geometra de 180. Por otra parte, la fluorescencia tambin
puede ser medida desde la parte delantera, procedimiento que se utiliza a menudo
para las muestras turbias.
El detector puede ser de un solo canal o de mltiples canales. El detector de un

nico canal slo puede detectar la intensidad de una longitud de onda en cada
momento, mientras que el de mltiples canales detecta la intensidad en todas las
longitudes de onda simultneamente, con lo que el monocromador de emisin o
filtro es innecesario. Los diferentes tipos de detectores tienen sus ventajas y
desventajas.
El fluormetro ms verstil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de
excitacin continua, puede registrar tanto un espectro de excitacin como un
espectro de fluorescencia. Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de
onda de la luz de excitacin se mantiene constante, de preferencia en una longitud
de onda de alta absorcin, y el monocromador de emisin escanea el espectro. Para
medir los espectros de excitacin, la longitud de onda que pasa a travs del filtro o
monocromador de emisin se mantiene constante y el monocromador de excitacin
va escaneando. El espectro de excitacin generalmente es idntico al espectro de
absorcin, ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la absorcin.

ANLISIS DE LOS DATOS

A bajas concentraciones, la intensidad de fluorescencia es, por lo general,
proporcional a la concentracin del fluorforo.
A diferencia de la espectrometra visible o ultravioleta 'estndar',
los espectros independientes del dispositivo no son fciles de alcanzar. Son varios los
factores que influyen y distorsionan los espectros, y son necesarias correcciones para
lograr el espectro 'verdadero', es decir, independiente de la mquina.
Los distintos tipos de distorsiones se pueden clasificar en relacin al instrumento o a
la muestra. En primer lugar, veamos las distorsiones derivadas del instrumento.
Como punto de partida, la intensidad de las fuentes de luz y las caractersticas de la
longitud de onda varan con el tiempo durante cada experimento. Por otra parte,
ninguna lmpara tiene una intensidad constante en todas las frecuencias. Para
corregir esto, se puede aplicar un haz separador despus del filtro o monocromador
de excitacin, para dirigir una porcin de luz a un detector de referencia.
Adems, debe tenerse en cuenta el rendimiento de transmisin de los
monocromadores y los filtros, ya que tambin puede cambiar con el tiempo. La
eficacia de la transmisin del monocromador vara dependiendo de la longitud de
onda. Esta es la razn por la que debe colocarse un detector de referencia despus
del filtro o monocromador de excitacin. El porcentaje de fluorescencia recogido
por el detector tambin depende del sistema. Por otra parte, la eficiencia cuntica
del detector, es decir, el porcentaje de fotones detectados, vara entre los
diferentes detectores, segn la longitud de onda y el tiempo.
La correccin de todos estos factores instrumentales para conseguir un "estndar"
del espectro es un proceso tedioso, que slo se aplica en la prctica cuando es
estrictamente necesario. Es el caso de las mediciones de rendimiento cuntico o
cuando se encuentra la longitud de onda con la mayor intensidad de emisin, por

ejemplo.
Como se mencion anteriormente, tambin surgen distorsiones de la muestra. Por lo
tanto, algunos aspectos de la muestra deben tenerse en cuenta tambin. En primer
lugar, la fotodescomposicin puede disminuir la intensidad de fluorescencia con el
tiempo. La dispersin de la luz tambin debe tenerse en cuenta. Los tipos ms
importantes de dispersin en este contexto son la dispersin de Rayleigh y la de
Raman. La luz dispersa por dispersin de Rayleigh tiene la misma longitud de onda
que la luz incidente, mientras que en la dispersin Raman la luz cambia a longitudes
de onda ms largas. La dispersin de Raman es el resultado de un estado electrnico
virtual inducido por la luz de excitacin. A partir de este estado virtual, las
molculas pueden volver a un nivel vibracional distinto del estado basal. En los
espectros de fluorescencia siempre se observa una diferencia de nmero de onda
constante en relacin con la excitacin; por ejemplo, en el agua el pico aparece a
un nmero de onda 3600 cm-1 inferior a la luz de excitacin.
Otros aspectos a considerar son los efectos del filtro interior. Estos incluyen la
reabsorcin, que ocurre porque otra molcula o parte de una macromolcula
absorbe las longitudes de onda en la que el fluorforo emite radiacin. Si este es el
caso, una parte o la totalidad de los fotones emitidos por el fluorforo pueden ser
absorbidos de nuevo. Otro efecto del filtro interno se produce a causa de las altas
concentraciones de absorcin de las molculas, incluyendo el fluorforo. El
resultado es que la intensidad de excitacin de la luz no es constante a lo largo de la
solucin. Como resultado, slo un pequeo porcentaje de la luz de excitacin llega a
los fluorforos que son visibles para el sistema de deteccin. Los efectos del filtro
interior cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por tanto, deben ser
considerados al analizar el espectro de emisin de luz fluorescente.

APLICACIONES
La espectrometra de fluorescencia se utiliza en anlisis bioqumicos, mdicos,
qumicos y de investigacin de compuestos orgnicos. Tambin se ha utilizado para
diferenciar los tumores malignos de piel de los benignos.
La fluorescencia tambin puede utilizarse para reorientar los fotones.

Fluorescencia del triptfano

Este tipo de fluorescencia es una prueba importante que puede ser usada para
estimar la naturaleza del microambiente del triptfano (un aminocido). Cuando se
realizan experimentos con desnaturalizantes, surfactantes u otras molculas
anfiflicas, el microambiente del triptfano puede cambiar. Por ejemplo, si
una protena que contiene un nico triptfano en su ncleo "hidrofbico" se
desnaturaliza con el aumento de temperatura, aparece un cambio de color en el
espectro de emisin del rojo. Esto se debe a la exposicin del triptfano a un medio

ambiente acuoso en contraposicin a una protena hidrofbica interior. En contraste,

la adicin de un tensioactivo a una protena que contiene triptfano, que se
encuentra expuesto al solvente acuoso, causar un cambio al espectro azul de
emisin si el triptfano est incrustado en la vescula o micela de surfactante. Las
protenas que carecen de triptfano puede ser enlazadas a un fluorforo.
A 295 nm, el espectro de emisin del triptfano es dominante sobre la fluorescencia
ms dbil de la tirosina y fenilalanina.