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Un metodo para la determinacin de dos toxinas alternara, alternariol y ter

monometilicoeternariol, en productos de tomate
ABSTRACTO
Los tomates, como cualquier fruta de piel suave, son altamente susceptibles a la pudricin por
hongos. Alternaria es el gnero ms encontrado en los tomates. Un alternata y otro spp han
demostrado que producen ter monometilalternariol (AME) y alternariol (AOH) en los tomates. Se
ha desarrollado y evaluado un mtodo para determinar AME y AOH en los tomates. El mtodo
involucra extraccin con etanol, clasificacin con sulfato de amonio y particin con cloroformo.
La cuantificacin fue conducida por cromatografa liquida de alta eficiencia con detector de
diodos (DAD). El porcentaje de recuperacin fue de 98,7%
y 84,1% para AME y AOH
respectivamente. Los lmites de cuantificacin del mtodo, definidos como la cantidad mnima
que permitieron la cuantificacin y confirmacin por el detector DAD, fueron 2,0 ng/g para AME y
y 5,0 ng/g para AOH.
PALABRAS CLAVE: alternara, micotoxinas, ter monometileternaril, alternariol, tomates

INTRODUCCION
El gneroalternaria contiene muchas plantas
patgenas. Este coloniza un gran nmero de
plantas agriculturalmente importantes. Este
puede invadir tanto materiales sanos como
debilitados o muertos antes de la cosecha y
en determinadas condiciones
daar
productos almacenados, El gnero produce
71 micotoxinas y ficotoxinas conocidas Entre
las micotoxinas, alternariol (AOH) y ter
monometlicoalternariol (AME) (Fig. 1) se
informa que las toxinas producidas en
grandes
cantidades
por
toxignicaAlternariaspp. Entre las fuentes de
hongos conocidos para estas toxinasson A.
alternata, A. dauci, A. cucumerina, A. solani
y A. tenuissima.
Ambas toxinas causan efectos txicos
agudos dbilmente como se muestra por su
LD50 que es superior a 400 mg / kg de peso
corporal para los ratones. AME es citotxica
y AOH y AME muestran efectos sinrgicos.
AOH es letal para los ratones no nacido a
niveles de 100 mg / kg bw. Los estudios han
indicado que AME es carcingeno y
mutgeno tras una semana de prueba de
AMES utilizando Salmonella typhimurium, Se
actu como un fuerte mutgeno en las
pruebas con Escherichiacoli, en AOHse
observ no mutagenicidad.

Las toxinas de AME y AOH se han

encontrado en el sorgo, semillas de girasol,
cebada, trigo, avena, aceitunas, tomates,
mandarinas, naranjas, pimientos y melones.
Las cepas de Alternaria inoculadas en
manzanas, tomates, arndanos, naranjas y
limones

Producen las toxinas, demostrando

potencial de contaminacin.

su

La alternaria presenta un problema especial

para los tomates ya que es su invasor ms
frecuente. Esto abre la posibilidad de la
presencia de micotoxinas en los productos y
su evaluacin se vuelve aconsejable con el
fin de evaluar si existe un riesgo para los
consumidores.No existen tales datos sobre
los productos brasileos. Para lograr ese
objetivo se realiz una bsqueda en la
literatura
para
un
mtodo
analtico
adecuado para la AME y AOH en productos
de tomate.
se ha descrito para la extraccin de AME y
AOH a partir de tomates
el uso de
cloroformo,
cloroformo/etanol
(4:1)
acidificado y metanol/hexano (15:7), o
columna de silica abierta, se ha descrito y la
separacin final y para cuantificacin de las
toxinas de tomates y otros alimentos se ha

empleado cromatografa de capa fina o

cromatografa liquida de alta eficiencia con
deteccin por absorbancia en el ultravioleta,
por fluorescencia o por la electroqumica.
Sorprendentemente, el detector de diodos
(DAD) ha sido poco utilizado para
micotoxinas y no ha sido utilizado para AME
y AOH. Sin embargo, puede ser una
herramienta til para determinaciones de
micotoxinas. El proceso de cuantificacin
puede tambin proporcionar al analista con
los espectros UV del compuesto de inters y
del patrn empleado. Si el compuesto de
inters eluye sin interferencias, el analista
puede ser capaz de confirmar la identidad
de la toxina mediante la comparacin de los
espectros del pico de sospecha y del patrn,
esto liberar al analista de tener que utilizar
otras tcnicas para la confirmacin de la
identidad del analito. Dichas tcnicas
pueden
implicar
reacciones
qumicas,
espectrometra de masa, mtodos de
espectrometra
de
inmunoafinidad
o
infrarrojos o ultravioleta y puede ser tedioso
y costoso o, en el caso de la espectrometra
de masas, simplemente no est disponible
en la institucin donde se realiza el trabajo.

prepararon
a
continuacin,
con
la
necesidad. Las soluciones estndar se
sometieron a ultrasonidos antes de su uso.
Preparacin de la muestra

El presente documento describe un mtodo

para la determinacin de AME y AOH en
productos de tomate. Las etapas de
extraccin y limpieza son simples de realizar
y utilizar disolventes y reactivos fcilmente
disponibles.Se utilizaron la cromatografa
lquida de alta eficiencia y la deteccin por
red de diodos (DAD) para la cuantificacin y
la confirmacin de la identidad. Tambin se
describe la evaluacin intralaboratoriodel
funcionamiento del mtodo.

Productos de tomate como el jugo de

tomate, pulpa, pasta, pur, y tomates
cocidos enteros se mezclaron o sacudidos
por homogeneidad.A 50 g portion of the
product was weighed and transferred to
blender with the help of 150 ml of
methanol.Se mezcl a baja velocidad
durante 3 minutos y se transfiri a un
embudo de vidrio equipado con un papel de
filtro estriado. Unos 50 ml de metanol
adicional se utilizaron para lavar los residuos
que quedaron en el vaso mezclador dentro
del papel de filtro, Una alcuota de 200 ml
del filtrado se recogi en un vaso de
precipitados y se aadi 60 ml de una
solucin de sulfato de amonio al 10%, La
mezcla se filtr a travs de papel de filtro
estriado. Luego se transfiri una alcuota de
200 ml del filtrado, o menos, a un embudo
de separacin y 50 ml de agua a 8 C, a
continuacin se aadieron. Se llevaron a
cabo dos extracciones con 40 ml de
cloroformo, agitando cada vez durante 2
minutos. Todo el cloroformo se recogi en un
embudo de separacin y se lav con 30 ml
de agua ultrapura a 5 - 8 C. A
continuacin, el cloroformo se transfiere a
un cilindro graduado y el volumen observ
para los clculos futuros, El extracto de
cloroformo se evapor en un evaporador
rotatorio a 35 C. El residuo se disolvi en
metanol 2 ml y se filtr a travs de sulfato
sdico anhidro.

MATERIALES Y METODOS

Cromatografia liquida

Reactivos

El sistema de HPLC consisti en un HewlettPackard HP 1050 cromatgrafo lquido

(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, EE.UU.)
equipado con una vlvula de muestra
Rheodyne equipado con un bucle de 20 ml y
un detector de matriz de diodos HP (modelo
1050, Phoenix y softwares Spectro macro).
La columna analtica fue Spherisorb ODS-2,
5 mm, 250 mm (Fase Separaciones,
Deeside, Chwyd, UK). Las soluciones de
muestra y los patrones se sometieron a
ultrasonidos durante 30 segundos antes de

Se
obtuvo
metanol
grado
analtico,
cloroformo, sodio anhidro sulfato y hepta
hidrato de sulfato de zinc y grado HPLC
metanol de Merck (Darmstadt, Alemania).
Los estndares de ter monometlico de
alternariol y alternariol fueron adquiridos de
Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Las
soluciones que contienen 0,133 mg / ml AME
y 0,500 mg / ml AOH se prepararon en
metanol. Los patrones de trabajo se

la inyeccin en el cromatgrafo. La fase

mvil fue metanol / agua (80:20) que
contiene 300 mg ZnSO4 .H2O / L, 0,7 ml /
min. La longitud de onda de cromatogramas
de grabacin fue de 250 nm. Una curva de
calibracin se construy con fines de
cuantificacin utilizando los estndares de la
toxina y que correlacionan pico del rea
frente a la concentracin. La identidad de
pico se confirm por medio de la
comparacin del espectro del patrn con el
pico presuntamente positivo en la muestra
despus de la normalizacin.Los lmites
cuantificacin del mtodo se tomaron como
la cantidad mnima de la toxina detectada
en el producto que permiti la confirmacin
por el detector de longitud de onda mltiple.
Los lmites de deteccin de las toxinas puras
por el detector DAD se midieron como tres
veces la variacin estndar de lnea de base
en las mismas condiciones empleadas para
los productos de tomate.
RESULTADOS Y DISCUSION
Varias tcnicas para la extraccin y limpieza
de AME y AOH descrito en la literatura
fueron juzgadAs, ya sea aislados o en
combinacin, con resultados insatisfactorios
en trminos de recuperacin, el tiempo
implicado en la realizacin del anlisis, o uso
de grandes cantidades de disolventes,
alguno altamente txico. Todo esto llev al
desarrollo del procedimiento descrito en el
presente
documento,
La
evaluacin
intralaboratorial
del
procedimiento
propuesto incluy las siguientes pruebas: la
recuperacin, la precisin y el lmite de
deteccin y la robustez. Las recuperaciones
promedio de siete niveles de adicin de
patrones puros a la pasta de tomate fueron
98,7% y 84,1% para la AME y AOH,
respectivamente. Las recuperaciones de
70% o ms se consideran aceptables para
anlisis de trazas en niveles ung / g. Los
RSDs promedio entre duplicados para 14
preparaciones de muestras, para muestras
de productos de tomate de pinchos (Fig. 2),
eran 0,8% para AME y 5,4% para AOH, lo
que indica una excelente precisin para el
mtodo
propuesto.
Horwitz
et
al.
Demostrando que a niveles de 1 ng / g de
precisin entre ensayos de laboratorio bien
realizados con muestras ciegas puede

alcanzar 45%, Los duplicados de la misma

muestra analizada en el mismo laboratorio
pueden estar dentro de 2/3 o 1/2 de este
valor. Estos valores aparentemente altos
RSD son consecuencia de las dificultades
para cuantificar las sustancias a nivel de
trazas.Horwitz tambin mostr que a los 20
ng/g la mayoria de los resultados para la
misma muestra tiene valores de RSD de
30% yintralaboratorios RSD de 20%.
Los lmites de deteccin del detector DAD
para patrones puros fueron tomados como
tres veces la desviacin estndar de la lnea
de base de acuerdo con las directrices de la
Sociedad Qumica Americana Subcomit
sobre Qumica Analtica Ambiental, La
longitud de onda se estableci en 250 nm.
Los lmites de deteccin fueron de 0.6 ng y
1,0 ng de AME y AOH, respectivamente. Los
lmites de mtodo de cuantificacin para las
mismas toxinas se tomaron como la
cantidad mnima de la toxina detectada en
un producto de tomate que permiti la
cuantificacin y la confirmacin por el
detector DAD, Ellos fueron 2,0 ng / g y 5,0
ng / g de AME y AOH, respectivamente. Las
curvas de calibracin fueron lineales en el
rango de uso, 0,57 a 12,04 ng / ml, con un
coeficiente de correlacin de 0,9932, para
AME y 0,37 a 15,0 ng / ml, con un
coeficiente de correlacin de 0,9995, por
AOH. La comparacin entre los espectros de
los estndares puros y de las toxinas
aadidas a la matriz de tomate (Fig. 3)
permite la conclusin de que la separacin
de la toxina era completa y que no haba
compuestos de interferencia.
Una prueba de resistencia se llev a cabo de
acuerdo con Wernimont, Se evala el
comportamiento del mtodo en la cara de
pequeos cambios en las condiciones de
trabajo, Las condiciones evaluadas fueron la
calidad y los volmenes de disolventes,
concentracin de la solucin de sulfato de
amonio utilizado como agente clarificante, y
la temperatura utilizada para el secado final
del extracto, Las recuperaciones variaron
desde 85,9 hasta 88,6% y 76,3 a 92,8%
para l AME y para AOH, respectivamente,
Indican un buen grado de resistencia en el
procedimiento que se est probando.Los
factores aislados muestran la importancia

de algunos de los factores estudiados en las

recuperaciones de las toxinas, tambin
mostr que AME fue menos afectada por los
cambios en el procedimiento analtico.La
calidad de la cloroformo seguido por el del
metanol
fueron
las
variables
ms
importantes para la recuperacin de AOH.
Las diferentes marcas de disolventes

pueden contener diferentes cantidades y

tipos de impurezas. estas impurezas, por lo
general
otros
compuestos
orgnicos,
cambian la polaridad del disolvente y
pueden afectar a la recuperacin de
cualquier compuesto sensible a pequeos
cambios en la polaridad de una extraccin o
disolvente de elucin