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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTRE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR


ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE DORAN ES-SENIA

FACULTE DES SCIENCES


DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
LABORATOIRE DE PHYTOPATHOLOGIE

MEMOIRE
Prsent par

Mlle. GHOMARI Faza Nawel


POUR LOBTENTION DU DIPLOME DE MAGISTER

Spcialit : Microbiologie Applique


Option : Phytopathologie
Moyens de Luttes Chimique et Biologique Contre le
Fusarium oxysporum f.sp. albedinis Agent Causal du Bayoud
Chez le Palmier Dattier Phnix dactylifera L.

Soutenu le : 15-12-2009

Devant le jury compos de :

Mr. SLIMANI M.

Professeur l'Universit d'Es-Snia

Prsident

Mr. HENNI J.E.

Professeur l'Universit d'Es-Snia

Rapporteur

Mr. KIHEL M.

Professeur l'Universit d'Es-Snia

Examinateur

Mr. GUESSAS B.

Matre de Confrences l'Universit d'Es-Snia

Examinateur

Mr. HEDADJI M.

Matre de Confrences l'Universit d'Es-Snia

Examinateur

Anne Universitaire : 2008 - 2009

Table des
Matires

Table des Matires


Rsum ...................................................................................................................................... ix
Abstract ...................................................................................................................................... x

.................................................................................................................... xi
Liste des tableaux .................................................................................................................... xii
Liste des figures ..................................................................................................................... xiii
Liste des abrviations ............................................................................................................... xv
Glossaire ................................................................................................................................ xvi

Introduction........................................................................................................................... 2
Premire Partie : Synthse Bibliographique
Chapitre I : Le palmier dattier ............................................................................................... 6
1/ Distribution systmatique.................................................................................................. ....6
2/ Description morphologique ................................................................................................... 7
3/ Cycle vgtatif ou cycle de dveloppement ....................................................................... 12
4/ Ecologie du palmier dattier ................................................................................................. 13
5/ Multiplication du palmier dattier ........................................................................................ 14
6/ Rpartition gographique du palmier dattier ........................................................................ 15
7/ Importance conomique du palmier dattier ......................................................................... 15
Chapitre II : Lagent pathogne ........................................................................................... 18
1/ Historique de la taxonomie ................................................................................................ 18
1.1/ Le genre Fusarium ............................................................................................... 18
1.2/ Lespce oxysporum ............................................................................................. 18
1.3/ La forme spciale albedinis .................................................................................. 19
2/ Position systmatique .......................................................................................................... 19
3/ Lagent pathogne : Fusarium oxysporum f.sp. albedinis ................................................ 20
4/ Description morphologique .................................................................................................. 20
4.1/ Caractres macroscopiques .................................................................................. 20
4.2/ Caractres microscopiques ................................................................................... 22

ii

Table des Matires


Chapitre III : La maladie du Bayoud ............................................................................. 24
1/ Historique et progression de la maladie .............................................................................. 24
2/ Symptmes de la maladie.................................................................................................... 26
2.1/ Symptmes externes .............................................................................................. 26
2.2/ Symptmes internes ............................................................................................. 27
3/ Pntration et progression du champignon dans la plante .................................................. 27
4/ Epidmiologie ..................................................................................................................... 27
5/ Moyens de luttes .................................................................................................................. 28
5.1/ Les mesures prophylactiques ................................................................................ 28
5.2/ Les techniques culturales ...................................................................................... 28
5.3/ La lutte chimique .................................................................................................. 29
5.4/ La lutte biologique ................................................................................................ 29
5.5/ La lutte gntique ................................................................................................. 30
5.6/ la lutte intgre ..................................................................................................... 30

Deuxime Partie : Matriels et Mthodes


Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte ............................................................ 34
I/ Le parasite et sa culture ....................................................................................................... 34
1.1/ Espce tudie ...................................................................................................... 34
1.2/ Echantillonnage et isolement des souches de F.o.a. ............................................ 34
1.3/ Techniques disolement de F.o.a. ........................................................................ 34
1.4/ Purification des souches de F.o.a. ........................................................................ 37
1.5/ Identification des souches de F.o.a. .................................................................... 38
1.5.1/ Etude des caractres culturaux .............................................................. 38
1.5.2/ Etude des caractres microscopiques ................................................... 38
1.6/ Etude physiologique des souches de F.o.a. .......................................................... 39
1.6.1/ Influence de la temprature ................................................................... 40
1.6.2/ Influence des sources carbones ............................................................ 40
1.6.3/ Influence des sources azotes ................................................................ 40
1.6.4/ Influence de la lumire .......................................................................... 40
1.6.5/ Influence du pH du milieu ..................................................................... 40
1.6.6/ Influence de lhumidit........................................................................... 41

iii

Table des Matires


1.7/ Conservation des souches de F.o.a. ..................................................................... 42
II/ Lhte et sa culture ............................................................................................................. 42
2.1/ Espce tudie ...................................................................................................... 42
2.2/ Prparation des plantules de palmier .................................................................... 42
2.2.1/ Germination des noyaux de dattes ......................................................... 42
2.2.2/ Plantation des noyaux de dattes ............................................................. 42
2.2.3/ Prparation de la solution nutritive (Solution KNOP) .......................... 44
2.3/ Etude du pouvoir pathogne ................................................................................. 44
2.3.1/ Prparation de linoculum ..................................................................... 44
2.3.2/ Inoculation des plantules au niveau du systme racinaire ..................... 44
2.3.3/ Risolement du parasite ......................................................................... 45
Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique ................................................... 47
I/ Dosage des protines totales des isolats de F.o.a. ............................................................... 47
1.1/ Prparation des extraits mycliens ....................................................................... 47
1.1.1/ Culture du champignon ......................................................................... 47
1.1.2/ Obtention des extraits ............................................................................ 47
1.2/ Principe du dosage des protines .......................................................................... 47
1.2.1/ Composition du Ractif de Bradford ..................................................... 48
1.2.2/ Courbe dtalonnage ............................................................................. 48
II/ lectrophorse .................................................................................................................... 48
2.1/ Prparation des gels pour le systme PAGE ........................................................ 48
2.2/ Migration et mise sous tension ........................................................................... 49
2.3/ Rvlation des systmes isoenzymatiques ........................................................... 50
2.4/ Isoenzymes tudis ................................................................................................ 51
2.5/ Prparation des gels pour le systme SDS-PAGE ............................................... 52
2.6/ Dnaturation des chantillons .............................................................................. 52
2.7/ Rvlation des bandes .......................................................................................... 52
Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte ........................................ 54
I/ Lutte chimique contre Lisolat F13 de F.o.a. ...................................................................... 54
1.1/ Les fongicides tests ................................................................................................. 54
1.2/ Prparation des solutions de fongicides .................................................................... 54

iv

Tables des Matires


1.3/ Test sur milieu solide ............................................................................................... 55
II/ Lutte biologique .................................................................................................................. 57
2.1/ Provenance de lagent antagoniste test .................................................................... 57
2.2/ Test de lactivit antagoniste in vitro ........................................................................ 57
2.2.1/ Confrontation par contact direct sur milieu de culture ................................... 58
2.2.2/ Activit des filtrats de culture ......................................................................... 58

Troisime partie : Rsultats et Discussions


I/ Isolement du champignon ................................................................................................... 62
II/ Identification des souches de F.o.a. ................................................................................... 62
2.1/ Aspect morphologique .............................................................................................. 62
2.2/ Caractres microscopiques ........................................................................................ 66
2.3/ Effet des diffrents milieux de culture ..................................................................... 66
III/ Etude physiologique de F.o.a. ........................................................................................... 70
3.1/ Influence de la temprature ....................................................................................... 70
3.2/ Influence des sources carbones ............................................................................... 70
3.3/ Influence des sources azotes ................................................................................... 70
3.3/ Influence de la lumire .............................................................................................. 70
3.4/ Influence du pH du milieu ........................................................................................ 70
3.5 Influence du taux dhumidit ..................................................................................... 73
IV/ Estimation du pouvoir pathogne ..................................................................................... 73
V/ Dosage des protines des isolats de F.o.a. ......................................................................... 75
VI/ lectrophorse ................................................................................................................... 75
6.1/ Estrases .................................................................................................................... 75
6.2/ Phosphatases ............................................................................................................. 75
6.3/ Peroxydases ............................................................................................................... 75
6.4/ Protines totales ........................................................................................................ 75
VII/ Lutte chimique contre lisolat F13 de F.o.a. .................................................................. 79
XI/ Lutte biologique contre lisolat F13 de F.o.a. .................................................................. 83
8.1/ Lagent antagoniste ................................................................................................... 83
8.2/ Test de lactivit antagoniste de Trichoderma harzianum ........................................ 84

Tables des Matires


Discussions .......................................................................................................................... 89
Conclusion............................................................................................................................ 95
Rfrences Bibliographiques ........................................................................................ 97
Annexes .............................................................................................................................. 110

vi

Remerciements
En mon nom personnel,

Mes premiers remerciements iront Dieu le tout puissant pour mavoir aid
suivre mes tudes universitaires et les corroborer par le prsent mmoire.
Mes vifs remerciements sadressent mes trs chers parents qui ont t
toujours prsents quand il le faut.
Que Mr. HENNI J.E., Professeur la Facult des Sciences, Dpartement
de Biologie lUniversit dOran, veuille bien accepter mes remerciements les plus
sincres pour laccueil quil ma rserv durant la ralisation de ma thse au sein de
son Laboratoire de Phytopathologie, lUniversit dOran au Dpartement de
Biologie, et la mise ma disposition des moyens ncessaires pour le droulement
correct de mon travail.
Je remercie Mr. KARKACHI N., Matre assistant lUniversit dOran,
pour son suivi efficace et rigoureux. Je le remercie chaleureusement pour son aide,
sa disponibilit quil a constamment montre mon gard, son guide prcieux et
ses conseils judicieux. Quil trouve ici lexpression de ma gratitude et de mon
profond respect.
Je tiens remercier vivement Mme GHARBI KARKACHI S., Matre
assistante lUniversit Mohamed Boudiaf dOran (U.S.T.O.), pour son aide
prcieuse, sa rigueur scientifique, ses conseils aviss et ses encouragements
permanents. Quelle me soit permise de lui prouver ma profonde reconnaissance.

Je suis trs sensible lhonneur que me fait Mr. SLIMANI M., Professeur
lUniversit dOran, qui a bien voulu accepter de prsider ce Jury. Quil veuille
bien accepter lexpression de mes sincres remerciements.
Je remercie Mr. KIHEL M., Professeur lUniversit dOran et Mr.
HADADJI M., Matre de Confrences lUniversit dOran, qui ont accept
dexaminer ce travail. Quils trouvent ici le tmoignage de mon profond respect.
Je tiens remercier tout particulirement Mr. GUESSAS B., Matre de
Confrences lUniversit dOran, qui accepte de juger ce travail. Quil trouve ici
lexpression de ma respectueuse gratitude et de mon profond respect.
Mes remerciements sadressent galement toute lquipe du Laboratoire de
Phytopathologie et tous mes encouragements ma promotion de Magister.
Je suis particulirement reconnaissante mes collgues Mohamed D. Amina
A., Malika G., et Zakia H., pour leur disponibilit exceptionnelle, leur aide
physique, leurs encouragements et surtout leurs soutien moral.
Je remercie enfin, tout ce qui ont contribu de prs ou de loin et qui ont pris
une part active la ralisation de ce travail, ainsi que tous ceux qui jaurais pu
oublier et qui se reconnaitront dans la collaboration apporte la ralisation de ce
travail.

Faza Nawel GHOMARI

Rsum

Le Bayoud est une fusariose vasculaire spcifique du palmier dattier (Phnix


dactylifera L.), due un champignon tellurique, le Fusarium oxysporum f. sp. albedinis.
Gnralement les orientations de lutte sont identiques celles adoptes contre toutes les
fusarioses vasculaires.
Notre travail porter sur lisolement de 20 souches de champignon appartenant au
genre Fusarium et identifier 06 souches dentre elles de Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
La virulence de ces souches est confirme par le test de pathognicit.
Aprs lisolement et la purification, la caractrisation morphologique indique
lexistence de trois morphotypes mycliens diffrents, type cotonneux, type duveteux et type
ras muqueux. En outre, les observations microscopiques, montrent la prsence des trois spores
caractristiques dun Fusarium.
Ltude physiologique du champignon, rvle une croissance meilleure sur le milieu
PDA pH 5, avec une temprature optimale de 28 C sous une photopriode de 12 heures. La
source de carbone favorable la croissance est reprsente par les monosaccharides et la
source dazote par les nitrates de potassium et de sodium.
Ltude du polymorphisme isoenzymatique, par la rvlation de trois systmes savoir :
les estrases, les phosphatases acides et les peroxydases, montre une similarit des profils
lectrophortiques chez les isolats de Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
Les essais dune lutte chimique dune part, contre

le Fusarium oxysporum f.sp.

albedinis, par lutilisation in vitro de 20 substances fongicides incorpores au milieu PDA


solide avec diffrentes concentrations (50-100-200 et 400 ppm), rvle la prsence dune
activit inhibitrice de quelques substances sur la croissance de la colonie du champignon.
Dautre part, une lutte biologique in vitro avec le Trichoderma harzianum, comme agent
antagoniste, que ce soit dune faon directe sur milieu de culture ou par activit des filtrats de
culture, montre une inhibition de la croissance myclienne du pathogne test.
Mots cls :
Palmier dattier, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, pouvoir pathogne, identification, profils
lectrophortique, lutte chimique, lutte biologique, Trichoderma harzianum.

ix

Abstract

Bayoud is one specific vascular fusariose of the date palm (Phnix dactylifera L.), due
to a telluric fungi, the Fusarium oxysporum f.sp. albedinis. Generally the orientations of fight
are identical to those adopted against all vascular fusarioses.
Our work to be concerned the isolation of 20 strains of fungi belonging to the genre
Fusarium and to identify 06 stumps of them of Fusarium oxysporum f.sp. albedinis. The
virulence of these stumps is confirmed by the test of pathogenicity.
After the isolation and the purification, the morphological characterization indicates the
existence of three different typical morphotypes typical lifeless, downy and typical short
mucous. Besides, the microscopic observations show the presence of three characteristic spores
of Fusarium.
The physiological study of the fungi strains reveals a better growth on the PDA medium
with pH 5, with an optimal temperature of 28 C under a photoperiod of 12 hours. The source
of carbon favorable to the growth is represented by monosaccharides and the source of nitrogen
by nitrates of potassium and sodium.
The study of the isoenzymatique polymorphism, by the revelation of three systems
namely: esterase, acid phosphatases and peroxydases, shows a similarity of the electrophoretic
profils for strains of Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
The essays of a chemical fight, on one hand, against Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis, by the in vitro use of 20 fungicidal substances incorporated in the middle solid PDA
with various concentrations (50-100-200 and 400 ppm), reveals the presence of an inhibition
activity of some substances on the growth of the colony of the fungi.
On the other hand, an in vitro biological fight with Trichoderma harzianum, as
opposing agent, whether it is in a direct way on middle of culture or by activity of the filtrats of
culture, show an inhibition of the growth mycelien of pathogenic tested.
Keywords :
Date palm, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, pathogenic power, identification,
electrophoretic profils, chemical fight, biological fight, Trichoderma harzianum.


( (Phoenix dactylifera L.

.Fusarium oxysporum f.sp. albedins


.
20 Fusarium
06 Fusarium oxysporum f.sp. albedinis
.
:
.
.Fusarium
PDA pH 5

28 C 12 .
.

Fusarium oxysporum f.sp.


.albedinis
Fusarium oxysporum f.sp. albedinis 20
( 200 -100 -50
in vitro ) (PDA
)ppm 400 .
) (in vitro Trichoderma harzianum

.

:
Fusarium oxysporum f.sp. albedinis
. Trichoderma harzianum

xi

Liste des Tableaux


Tableau n 01 Production mondiale des dattes .................................................................... 16
Tableau n 02 Sites dchantillonnages et souches isoles de Fusarium ........................... 35
Tableau n 03 Dilutions de la courbe dtalonnage ............................................................. 48
Tableau n 04 Composition des gels de polyacrylamide ..................................................... 49
Tableau n 05 Les mlanges ractionnels pour les rvlations enzymatiques..................... 50
Tableau n 06 Les substances fongicides testes contre lisolat F13 de F .o.a. .................. 54
Tableau n 07 Provenance des souches T1 et T2 de Trichoderma harzianum ..................... 57
Tableau n 08 Diffrents morphotypes rencontrs chez F.o.a. et Fusarium de la rhizosphre
du palmier dattier ......................................................................................... 63
Tableau n 10 Diamtre moyen (cm) des cinq isolats sur les trois milieux de culture ........ 69
Tableau n 11 Pourcentage de mortalit des plantules de palmier dattier ........................... 73
Tableau n 12 Densit optique (D.O.) de chaque dilution ................................................... 76
Tableau n 13 Densit optique (D.O.) et concentration en protines dans chaque extrait
enzymatique des isolats de F.o.a. ................................................................ 76
Tableau n 14 Diamtre moyen (cm) de lisolat F13 confront avec la premire srie des
substances fongicides ................................................................................... 80
Tableau n 15 Taux dinhibition (%) de la premire srie des substances fongicides contre
lisolat F13 ................................................................................................... 80
Tableau n 16 Diamtre moyen (cm) de lisolat F13 confront avec la deuxime srie des
substances fongicides ................................................................................... 81
Tableau n 17 Taux dinhibition (%) de la deuxime srie des substances fongicides contre
lisolat F13 ................................................................................................... 81
Tableau n 18 Diamtre moyen (cm) de lisolat F13 confront avec la troisime srie des
substances fongicides ................................................................................... 82
Tableau n 19 Taux dinhibition (%) de la troisime srie des substances fongicides contre
lisolat F13 ................................................................................................... 82
Tableau n 20 Diamtre moyen (cm) des isolats de F.o.a. et le taux dinhibition (%) des
diffrentes souches de Trichoderma par contact direct .............................. 84
Tableau n 21 Diamtre moyen (cm) des isolats de F.o.a. et le taux dinhibition (%) des
diffrentes souches de Trichoderma par action des filtrats de culture ......... 85

xii

Liste des Figures


Figure n 01 Construction schmatique dun palmier dattier ................................................ 8
Figure n 02 Les quatre types de racines dun palmier dattier ............................................... 8
Figure n 03 Schma dune palme ......................................................................................... 9
Figure n 04 Une inflorescence du palmier dattier .............................................................. 11
Figure n 05 Spathe mle et spathe femelle ......................................................................... 11
Figure n 06 (a) Une fleur femelle ....................................................................................... 11
Figure n 06 (b) Une fleur mle ........................................................................................... 11
Figure n 07 Fruit et graine du palmier dattier ..................................................................... 11
Figure n 08 Aspect sauvage du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis ................................ 21
Figure n 09 Macroconidies et microconidies de Fusarium oxysporum.............................. 22
Figure n 10 Situation pidmiologique du Bayoud du palmier dattier......................... 25
Figure n 11 Symptmes de la maladie du Bayoud ....................................................... 26
Figure n 12 Symptme unilatral du Bayoud sur une palme infecte ........................... 36
Figure n 13 Isolement du champignon partir de rachis infect sur milieu PDA ............. 36
Figure n 14 Germination dun noyau de datte .................................................................... 43
Figure n 15 Schma de la mthode de mesure du diamtre dans les deux sens
perpendiculaires ............................................................................................. 56
Figure n 16 Confrontation de F.o.a. avec T. harzianum par contact direct sur milieu de
culture ............................................................................................................. 59
Figure n 17 Confrontation de F.o.a. avec T. harzianum par lactivit des filtrats de
culture ............................................................................................................. 59
Figure n 18 Reprsentations des diffrents morphotypes rencontrs ................................. 64
Figure n 19 Reprsentation des diffrents aspects morphologiques des isolats de F.o.a ... 65
Figure n 20 Observations au microscope optique des trois types de spores de F.o.a. au
grossissement (X 400) .................................................................................... 67
Figure n 21 Aspect du myclium des cinq isolats sur le milieu PDA ................................ 68
Figure n 22 Aspect du myclium des cinq isolats sur le milieu Czapeck .......................... 68
Figure n 23 Aspect du myclium des cinq isolats sur le milieu Mathur ............................ 68
Figure n 24 Reprsentation graphique de linfluence des diffrents milieux de culture sur la
croissance des isolats de F.o.a. ..................................................................... 69
Figure n 25 Reprsentation graphique de linfluence des tempratures sur la croissance de
lisolat F13...................................................................................................... 71

xiii

Figure n 26 Reprsentation graphique de linfluence de la source de carbone sur la


croissance de lisolat F13 ............................................................................... 71
Figure n 27 Reprsentation graphique de linfluence de la source dazote sur la croissance
de lisolat F13 ................................................................................................. 71
Figure n 28 Reprsentation graphique de linfluence dclairage sur la croissance de lisolat
F13 .................................................................................................................. 71
Figure n 29 Reprsentation graphique de linfluence du pH du milieu sur la croissance de
lisolat F13...................................................................................................... 72
Figure n 30 Reprsentation graphique de linfluence du taux dhumidit sur la croissance de
lisolat F13...................................................................................................... 72
Figure n 31 Diffrents symptmes nots chez les plantules de palmier dattier ................. 74
Figure n 32 Courbe dtalonnage ....................................................................................... 76
Figure n 33 Profil lectrophortique des estrases chez les isolats de F.o.a ...................... 77
Figure n 34 Profil lectrophortique des phosphatases chez les isolats de F.o.a ............... 77
Figure n 35 Profil lectrophortique des peroxydases chez les isolats de F.o.a. ............... 78
Figure n 36 Profil lectrophortique des protines totales chez les isolats de F.o.a. ......... 78
Figure n 37 Effet de la substance fongicide (P2) diffrentes concentrations sur la
croissance myclienne de lisolat F13de F.o.a. ............................................. 79
Figure n 38 Reprsentation graphique du diamtre moyen (cm) de lisolat F13 confront
avec la premire srie des substances fongicides ........................................... 80
Figure n 39 Reprsentation graphique du diamtre moyen (cm) de lisolat F13 confront
avec la deuxime srie des substances fongicides ......................................... 81
Figure n 40 Reprsentation graphique du diamtre moyen (cm) de lisolat F13 confront
avec la troisime srie des substances fongicides .......................................... 82
Figure n 41 Culture de Trichoderma harzianum sur milieu Davet ................................... 83
Figure n 42 Observation au microscope optique de Trichoderma harzianum (G x 400) . 83
Figure n 43 Diamtre moyen (cm) des isolats de F.o.a. en contact direct avec les diffrentes
souches de Trichoderma pendant 4 jours dincubation .................................. 84
Figure n 44 Diamtre moyen (cm) des isolats de F.o.a. sous laction des filtrats de culture
des diffrentes souches de Trichoderma pendant 4 jours dincubation ......... 85
Figure n 45 Taux dinhibition (%) de Trichoderma harzianum contre les isolats de F.o.a.
pour les deux techniques de confrontations ................................................... 85
Figure n 46 Contact direct sur milieu de culture entre Trichoderma harzianum et F.o.a .. 86
Figure n 47 Action des filtrats de culture de Trichoderma harzianum sur la croissance de
F.o.a. .............................................................................................................. 86

xiv

Liste des Abrviations

%
C
l
m
CLA
Cm
CMI50
D.O.
Est
F.o.a.
f.sp.
g/L
M
mA
mg
ml
mm
nm
PAC
PAGE
PDA
pH
Pox
ppm
q.s.p.
SDS
Glu
Mal
Amid
Tm
Asn
Ec. con
Ob. con
Photo. 12h

: pourcent
: Degr Celsius
: microlitre
: micromtre
: Carnation Leaf Agar
: centimtre
: Concentration Minimale Inhibitrice
: Densit Optique
: Estrase
: Fusarium oxysporum f.sp. albedinis
: forme spciale
: grammes / Litre
: Molaire
: milliampre
: milligramme
: millilitre
: millimtre
: nanomtre
: Phosphatase Acide
: Poly Acrylamide Gel Electrophoresis
: Potato Dextrose Agar
: potentiel d'Hydrogne
: Peroxydase
: partie par million
: quantit suffisante pour
: Sodium Dodcyl Sulfate
: Glucose
: Maltose
: Amidon
: Tmoin
: Asparagine
: Eclairage continu
: Obscurit continue
: Photopriode de 12 heures

xv

Glossaire

Aisselle :

Rgion situe au-dessous de linsertion dune feuille sur la tige, au


sommet de langle quelle forme avec la tige.

Axillaire :

Se dit dun mode de placentation dans lequel les graines paraissent


groupes sur laxe de lovaire.

Bracte :

Petite feuille de forme spciale la base du pdoncule floral.

Carpelle :

Chacune des pices florales dont lensemble soud forme le pistil des
fleurs.

Corn :

Qui a lapparence de la corne.

Fascicule :

Racine fascicule, est celle o lon ne peut distinguer laxe principal ou


pivot.

Inflorescence :

Mode de regroupement des fleurs sur une plante.

Lancole :

Se dit dun organe termin en forme de lance.

Pne :

Se dit des feuilles et des folioles disposs de lun et de lautre ct dun


ptiole commun.

xvi

Introduction

Introduction

Le palmier dattier Phnix dactylifera L. est un arbre cultiv principalement dans les zones
arides ou dsertiques de lAfrique du Nord et du Moyen Orient.
En Algrie, prcisment au Sahara, le palmier dattier reprsente larbre fruitier par
excellence, puisquil a constitu et constitue toujours la base alimentaire des populations de
cette rgion.
Il assure la production de dattes -fruit au contenu sucr important- et donc il est une source
de revenus (trocs, changes commerciaux, exportation).
Du point de vue cologique, le palmier dattier permet de :

stabiliser les sols fragiles,

lutter contre les vents,

crer, surtout, sous son couvert, un microclimat favorable la culture de certains arbres
fruitiers et aussi toutes autres cultures cralires, fourragres ou marachres.

De plus, toutes les parties du palmier dattier (tronc, palmes, noyau du fruit,...) peuvent tre
utilises pour diffrents buts et dans diffrents domaines : industriel, agricole, levage,
construction, fabrication de meubles, de cordes et de matriel demballage

(Hodel

et Johnson, 2007).
Si pendant trs longtemps le palmier dattier a constitu le pilier sur lequel a repos tout
lcosystme oasien, cet arbre symbole se trouve menac depuis lapparition dune fusariose
vasculaire mortelle. Il sagit dune maladie cryptogamique, la plus grave et la plus dvastatrice,
appele localement Bayoud . Cette trachomycose est cause par un champignon du sol : le
Fusarium oxysporum f.sp. albedinis (Djerbi, 1991).
Depuis lapparition de cette maladie (1898) dans les palmeraies de Figuig au Maroc et Bni
Ouenif (Bchar) en Algrie, plus de 12 Millions de palmiers dattiers ont t dtruits dans ces 02
pays (Ouinten, 1996). Cest un vritable flau des zones phnicicoles de lAfrique du Nord et
une menace qui pse sur cette richesse naturelle et notamment la varit Deglet Nour trs
prise dans les pays Europens.
La stratgie de lutte contre

le Bayoud mene par les pouvoirs publics (Ministre de

lAgriculture, Ministre de lEnseignement Suprieur et de la Recherche Scientifique, Instituts


spcialiss...), sarticule principalement sur des approches complmentaires savoir :

-2-

Introduction

larrt ou plus ou moins le ralentissement de la maladie, la slection de cultivars ou de


clones rsistants au Bayoud mais ayant une bonne rentabilit et qualit dattire et enfin la
multiplication par voie rapide du matriel vgtal slectionn par la culture in vitro et sa
diffusion (Bulit et al., 1967 ; Louvet et Toutain, 1973 ; Saadi, 1979 ; Djerbi, 1982 et 1991).
Si depuis plusieurs dcennies, de nombreuses tudes, recherches ou expriences ont t
menes par des spcialistes, des chercheurs,..., en vue dlucider les causes, les comportements
de lagent pathogne, sa propagation,..., avec des rsultats non ngligeables, la solution radicale
nest pas encore trouve et donc le domaine de la recherche demeure toujours ouvert.
A la lumire de ces nombreuses tudes, recherches ou expriences et sur la base des
conclusions auxquelles elles ont dbouch, nous avons jug utile de poursuivre la recherche
dans une suite purement logique, aids en cela par notre encadreur et certains de nos
Professeurs qui se sont intresss ce domaine que nous remercions vivement en vue
dapporter une modeste contribution.
Ainsi nous avons opt pour le thme suivant : Moyens de luttes chimique et biologique
contre le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis agent causal du Bayoud chez le palmier dattier
(Phnix dactylifera L.)
Notre tude est subdivise en trois (03) parties :

La premire partie revt un caractre thorique en vue de familiariser le lecteur dune


part, au palmier dattier, son cycle de dveloppement, sa multiplication,..., et dautre part
lagent pathogne, la maladie du

Bayoud et les moyens de lutte contre cette

maladie.

La seconde partie repose sur un travail pratique men au laboratoire et qui sintgre
dans le cadre des tudes consacres lagent pathogne Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis, en vue dvaluer un essai de moyens de lutte in vitro contre ce champignon
par quelques substances fongicides pour la lutte chimique et par lagent antagoniste
(Trichoderma harzianum), pour la lutte biologique.

Dans la troisime partie, nous nous efforcerons de prsenter les observations et les
conclusions obtenues au laboratoire.

-3-

Premire Partie :
Synthse Bibliographique

Chapitre I :
Le palmier dattier

Synthse Bibliographique

Chapitre I : Le Palmier Dattier

Le palmier dattier porte le nom latin Phnix dactylifera est aussi date palm en anglais et

nakhil

en arabe. Cette appellation botanique donne par Linn depuis 1734, est

Phnix , nom donn par les Grecs de lantiquit cet

vraisemblablement drive du mot

arbre quils considraient comme larbre des phniciens, ou phoinikes en grec. Quant

dactylifera , cet adjectif drive de daktylus , qui signifie un doigt et illustre la forme du fruit

du palmier dattier, quest la datte (Zad, 2002).

1/ Distribution systmatique :
Le palmier dattier comme son nom lindique, appartient lune des plus grandes familles
dangiospermes monocotyldones, celle des Palmaceae ou Arecaceae, reprsente par 200
genres et 2700 espces, rpartie en six sous-familles. La sous-famille des Coryphodeae est elle
mme subdivise en trois tribus. Le palmier dattier fait partie de la tribu des Phniceae qui ne

comporte quun seul genre : Phnix (Bounaga, 1991). Douze espces appartiennent ce
genre, mais cinq seulement dentre elles, en dehors du palmier dattier, sont fruits
consommables : P. atlantica, P. reclinata, P. farinifera, P. humilis et P. acoulis (Munier,
1973).
La classification du palmier dattier donne par Djerbi (1994), est la suivante :

Groupe :

Spadiciflora

Embranchement :

Angiospermes

Classe :

Monocotyledones

Ordre :

Palmales

Famille :

Palmaceae

Tribu :

Phniceae

Genre :

Phnix

Espce :

Phnix dactylifera L.

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Synthse Bibliographique

Chapitre I : Le Palmier Dattier

2/ Description morphologique :
Lallure la plus commune et la plus connue du palmier dattier est arborescente
monocotyldone, avec un tronc ou stipe monopodique (non ramifi et unique), trs lanc,
vertical et cylindrique de couleur brune, pouvant atteindre 30 40 mtre de haut et portant au
sommet une couronne de feuilles ou palmes, pennes de 4 7 mtres de longueur

(Figure

n 01). Lespce est dioque et porte des inflorescences mles et femelles. Une seule fleur est
fconde, se dveloppe et forme le fruit : la datte (Hadjari et Kadi Hanifi, 2005).

2.1/ Le systme radiculaire :


La partie souterraine du palmier dattier est forme dun bulbe ou plateau racinaire,
volumineux, qui merge en partie au dessus du niveau du sol, et partir duquel, partent des
racines fascicules, c'est--dire, disposes en faisceaux, peu ramifies et nayant relativement
que peu de radicelles (Ouinten, 1996).
Le schma (Figure n 02) fait apparatre trois grands types de racines rpartis en quatre
zones denracinement : les racines de respiration (Zone I), les racines de nutrition (Zone II) et
les racines dabsorption (Zone III et IV) :
- Zone I : se sont les racines respiratoires, de 0 20 cm et mme jusqu 150 cm au-dessus du
sol. Comme leur nom lindique, ces racines servent aux changes gazeux pour le palmier
dattier.
- Zone II : se sont les racines de nutrition, allant de 20 100 cm et constituent la plus forte
proportion de racines du systme. Elles sont obliques ou horizontales.
- Zone III : se sont les racines dabsorption, qui peuvent rejoindre le niveau phratique une
profondeur allant de 1 2 mtres. Leur fonction est de chercher leau.
- Zone IV : se sont les racines dabsorption en profondeur, caractrises par un gotropisme
positif trs accentu. La profondeur de ces racines dpasse les 15 mtres (Munier, 1973 ;
Djerbi, 1994 ; Peyron, 2000).

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Synthse Bibliographique

Chapitre I : Le Palmier Dattier

Figure n 01 : Construction schmatique dun palmier dattier


(Munier, 1973; Peyron, 2000).

Figure n 02 : Les quatre types de racines dun palmier dattier (Peyron, 2000).
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Synthse Bibliographique

Chapitre I : Le Palmier Dattier

2.2/ Le systme vgtatif :


2.2.1/ Le tronc :
Appel plus justement stipe , il est cylindrique, c'est--dire dun mme diamtre de bas en
haut. Compos lintrieur par de nombreux faisceaux libro-ligneux enchevtrs entre eux, et
est engain lextrieur -de manire visible-, par les bases ptiolaires qui restent colles aprs
la mort de la palme et qui assurent une protection au tronc. Leur prsence permet de grimper
vers le sommet du palmier dattier.
Le tronc possde un seul bourgeon terminal appel phyllophore ou apex , qui assure la
croissance verticale du palmier dattier (Zad, 2002).
2.2.2/ La couronne :
On dnombre 50 200 palmes chez un palmier dattier adulte, lensemble des palmes vertes
forme la couronne ou frondaison, selon la dcomposition suivante :
- La couronne basale, forme des palmes les plus ges,
- La couronne centrale, forme des palmes en pleine activit (adultes),
- Les palmes du cur, dont celles non encore ouvertes sont dites en pinceau (Peyron, 2000).
2.2.3/ Les palmes :
Les palmes sont des feuilles composes pennes qui sincrent sur le stipe en hlices trs
rapproches, formant ainsi plusieurs couronnes. Leurs bases forment le ptiole ou rachis, de
consistance ligneuse et de limbe pineux la base, mais porte des folioles dans les deux tiers
suprieurs disposs rgulirement en position oblique le long du rachis (Figure n 03) (Ouinten,
1996).

Figure n 03 : Schma dune palme (Peyron, 2000).


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Synthse Bibliographique

Chapitre I : Le Palmier Dattier

2.2.4/ Les inflorescences :


* Les organes floraux :
Le palmier dattier est une plante dioque, c'est--dire que les organes mles et les organes
femelles sont ports par des pieds (individus) spars ; palmiers mles (dokkars) ou palmiers
femelles (nakhla). Seuls les dattiers femelles donnent les fruits.
Les inflorescences du palmier dattier, se dveloppent parmi les feuilles et naissent de la
germination des bourgeons axillaires, situs laisselle de celles-ci dans la rgion coronaire du
tronc (Figure n 04). Linflorescence est caractristique, cest une grappe dpis, enveloppe et
protge par une grande bracte membraneuse close de forme allonge, dite : spathe (Figure n
05) (Peyron, 2000).
** Les fleurs :
Les fleurs monosexues sur la plante dioque, sont petites, de couleur blanchtre, sensibles,
quasi sessiles, sans pdoncules, portes par des pdicelles ou pillets, qui sont leur tour ports
par un axe charnu dit : hampe ou spadice (Figure n 04).
Les fleurs mles sont un peu plus allonges que les fleurs femelles (Figure n 06 a et b).
Elles possdent six tamines, qui leur maturit, souvrent et librent des grains de pollen.
Quant aux fleurs femelles, sont globulaires et ont un ovaire de trois carpelles indpendants
comportant chacun un ovule. Un seul ovule par fleur est fertilis et peut mener au
dveloppement des fruits, les deux autres disparaissent (Peyron, 2000).
2.2.5/ La fructification :
Les fruits, communment appels dattes , sont des baies oblongues ou ovodes parfois
mme sphriques, de couleur jaune clair brun plus ou moins fonc, longues jusqu 8 cm, leur
poids varie de quelques grammes plus de 50 g, contenant une pulpe sucre et une seule
graine, lisse, de consistance ligneuse, avec un sillon ventral et un embryon dorsal
(Figure n 07) (Peyron, 2000).

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Synthse Bibliographique

Chapitre I : Le Palmier Dattier

Hampe ou spadice

Figure n 04 : Une inflorescence du


Palmier dattier (Peyron, 2000).

Figure n 06 (a) : Une fleur femelle


(Peyron, 2000).

Figure n 05 : Spathe mle et spathe femelle


(Peyron, 2000).

Figure n 06 (b) : Une fleur mle


(Peyron, 2000).

Figure n 07 : Fruit et graine du palmier dattier (Peyron, 2000).

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Synthse Bibliographique

Chapitre I : Le Palmier Dattier

3/ Cycle vgtatif ou cycle de dveloppement :


Le palmier dattier ou le genre Phnix, est unique dans sa morphologie et dans son
dveloppement, puisque cinq phases sont possibles distinguer durant la croissance dun
palmier dattier. Ces dernires sont spares sur la base de critres morphologiques, alors
quelles ne sont en ralit que des priodes physiologiques :

- Stade I : La graine
Elle possde un albumen (endosperme) dur et corn, dont lembryon est toujours trs petit par
rapport lalbumen (2 3 mm).

- Stade II : Phase germinative


A ce stade, la plantule ou la germination vit sur les rserves de lalbumen. La premire feuille
est linaire et lancole, cette forme est lune des caractristiques du genre Phnix.

- Stade III : Construction de la plantule


Cette phase post germinative est la plus importante dans le cycle dun palmier dattier, car
elle aboutit la formation de laxe primaire. La plante devient autotrophe et son systme
vasculaire commence se construire. On peut lappeler aussi phase dtablissement ,
puisquune srie de feuilles limbe para-penn puis penn sincrent dune manire spirale.

- Stade IV : Phase adulte vgtative


Durant cette phase qui peut durer 3 8 ans, le palmier dattier construit son tronc, produit des
feuilles et accumule des rserves. Le tronc couvert par les bases ptiolaires des feuilles
anciennes mortes et/ou coupes, peut atteindre 20 30 m de haut et environ 1 m de diamtre.

- Stade V : Phase adulte reproductive


Entre la 5me et la 8me anne voir mme la 10me, le palmier dattier commence produire des
inflorescences. Ce nest qu ce stade quon peut reconnatre le sexe, quil soit un palmier mle
ou femelle (Riedacker, 1990 ; Bounaga 1991).

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Synthse Bibliographique

Chapitre I : Le Palmier Dattier

4/ Ecologie du palmier dattier :


Le palmier dattier est cultiv comme arbre fruitier dans les rgions arides et semi arides du
globe, caractrises par des ts longs et chauds et un trs bas niveau dhumidit relative
(Peyron, 2000). Cet arbre peut sadapter de nombreuses conditions, grce sa grande
variabilit. Diffrents facteurs climatiques (temprature, humidit, lumire, pluies et vent..) et
mme daphiques, sont trs importants pour pouvoir dterminer la convenance dun
emplacement spcifique pour la culture dun palmier dattier (Zad, 2002). Pour cela, et pour
donner une production normale, un palmier dattier doit bnficier des paramtres suivants :
1. dun climat chaud, sec et ensoleill :
Le point 0 de la vgtation est estim + 10 C, entre 10 et 40 C, le palmier dattier est en
activit vgtative, mais le maximum de cette dernire sobserve pour des tempratures
comprises entre 32 et 38 C. La haute limite de vgtation est de + 45 C. Toutefois, 65 C
le palmier dattier ne semble pas souffrir, sil est correctement irrigu (CIRAD et GRET, 2002).
Les pluies ont une action nfaste, surtout lorsquelles sont violentes. Elles peuvent entrainer
le pollen, abaisser les tempratures et favoriser les maladies cryptogamiques. Quant aux vents,
ils ont une action mcanique et desschante. Ils peuvent provoquer la chute des fruits, la
cassure des hampes des inflorescences et la propagation de quelques prdateurs du palmier
dattier.
Le palmier dattier est une espce hliophile, c'est--dire, qui aime le soleil et la disposition
des folioles sur les palmes favorise la photosynthse (Peyron, 2000).
2. dune alimentation en eau suffisante :
Le choix des zones de plantation dpend strictement des ressources hydriques (nappes
phratiques) et des possibilits de les utiliser (Peyron, 2000).
3. dun sol neutre, profond, bien drain, assez riche ou susceptible dtre fertilis :
Le palmier dattier prfre les sols lgers, il y croit plus rapidement quen sols lourds et
atteint un dveloppement maximal, en diamtre du tronc et en nombre de palmes (Peyron,
2000 ; CIRAD et GRET, 2002). Pour cela, le palmier dattier est la vgtation caractristique
des oasis (Zad, 2002).

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Synthse Bibliographique

Chapitre I : Le Palmier Dattier

5/ Multiplication du palmier dattier :


Trois mthodes de multiplication peuvent tre utilises, pour mettre en place de nouvelles
surfaces de phniciculture ou pour lextension des palmeraies.

5.1/ Multiplication par semis (par graine) :


La reproduction par graine est longue, gnralement utilise lorsquil y a absence des rejets.
Elle ne permet pas de contrler le sexe du palmier dattier et ne permet dobtenir des pieds
productifs quau bout dune dizaine dannes. Elle est donc une technique consommatrice de
temps pour des rsultats incertains (Ben Abdallah, 1990).

5.2/ Multiplication par rejets :


Cette mthode de multiplication permet de conserver les caractristiques du pied mre et de
ses fruits. Les rejets sont prlevs de la base du tronc (lorsquils atteignent un poids de 12
25 kg), laide dun outil tranchant, en effectuant une coupe au niveau de la zone de liaison.
Cette sparation du rejet de son pied mre est une opration qui conditionne sa reprise.
Cette technique de multiplication est donc considre comme la plus stable et la plus
efficace par les phniciculteurs (CIRAD et GRET, 2002).

5.3/ Multiplication in-vitro :


Deux mthodes de micropropagation du palmier dattier sont connues :
- Voie de lorganognse, repose sur la capacit de bourgeonnement des bourgeons axillaires,
avec un cycle de 4 phases : linitiation de tissus organognes, la multiplication ou le
bourgeonnement, llongation, lenracinement et lacclimatation (Poulin et al., 1979 ; Drira,
1981 ; Anonymous, 1989 ; Djerbi, 1991).
- Voie de lembryognse somatique, qui prsente deux phases : la formation de la cal
embryogne, la rgnration et la germination des embryons (Daikh et Demarly, 1987 ;
Letouze et Daguin, 1988 ; Djerbi, 1991).

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Synthse Bibliographique

Chapitre I : Le Palmier Dattier

6/ Rpartition gographique du palmier dattier :


6.1/ Dans le monde :
Laire de rpartition du palmier dattier dans le monde, couvre les cinq continents. La culture
du palmier dattier stend depuis le sud de lIran lEst, jusqu la cte Atlantique de lAfrique
du Nord lOuest. Cette culture est concentre dans les rgions arides et semi arides du
continent Africain, o le palmier dattier forme la vgtation caractristique des oasis.
Les limites extrmes de la distribution gographique sont entre les altitudes 10 Nord
(Somalie) et 39 Nord (Elche en Espagne ou Tukmenistan). Les secteurs les plus favorables
pour cette culture sont situs entre 24 et 34 Nord (Maroc, Algrie, Tunisie, Libye, Egypte,
Irak, Iran, Arabie Saoudite, Soudan, ...). Le palmier dattier se trouve aussi aux Etats-Unis entre
33 et 35 Nord, dautres surfaces ngligeables pour la culture du palmier dattier sont
lhmisphre sud (Australie, Mexique, Argentine, ...) (Ben Abdellah, 1990 ; Zad, 2002).

6.2/ En Algrie :
Quant la rpartition en Algrie, la culture du palmier dattier occupe toutes les rgions
situes sous lAtlas saharien, soit 6000 ha depuis la frontire Marocaine lOuest, jusqu la
frontire Tuniso-libyenne lEst.
Du nord au sud du pays, la culture du palmier dattier, stend depuis la limite sud de lAtlas
saharien jusqu Regghane lOuest, Tamanrasset au centre et Djanet lEst (Matallah, 2003).

7/ Importance conomique du palmier dattier :


7.1/ Production dans le monde :
Le palmier dattier fait lobjet dune exploitation intense en Afrique du Nord, au Moyen
Orient et aux U.S.A. Deux groupes de pays sont distinguer :
-

Les pays grands exportateurs ;

Les pays principalement consommateurs.

La production mondiale des dattes est estime 5.087.000 tonnes pour lanne 2005, dont
41 % soit 2.074.000 tonnes, proviennent du bassin mditerranen dont : LEgypte, 1er pays
producteur avec 23% et lAlgrie classe au 4me rang mondial avec 10 %.

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Synthse Bibliographique

Chapitre I : Le Palmier Dattier

LAlgrie est devance par lIran 20% et lArabie Saoudite 19%.

Le tableau n 01 nous renseigne sur le dtail de cette production mondiale, selon les
statistiques de la F.A.O. publis en 2007.
Tableau n 01 : Production mondiale des dattes (statistiques de la F.A.O., 2007).

Pays
Monde
Mditerrane
Egypte
Iran
Arabie Saoudite
Algrie
Pakistan
Soudan
Libye
Chine
Tunisie
Maroc

Quantit de production
(1000 tonnes)
5 087
2 075
1 170
997
970
516
497
328
181
130
125
48

(%)
100%
41%
23%
20%
19%
10%
10%
6%
4%
3%
2%
1%

7.2/ Production en Algrie :


Le patrimoine phnicicole Algrien estim en 1996 plus de 10 Millions de palmiers
dattiers, se caractrise par une diversit exceptionnelle aussi bien dans les varits que les
techniques utilises. Malheureusement, ces palmiers se trouvent aujourdhui menacs de
disparition.
Les principales rgions productrices sont celles de lEst, avec principalement les palmeraies
de Oued Righ et des Ziban, de Oued Souf, de la cuvette de Ouargla et du Mzab. A lOuest, ce
sont les palmeraies de lOued Saoura, du Touat, du Gourara et du Tidikelt (Matallah, 2003).
Cest dans ces rgions, que les meilleures varits de dattes sont produites telle que, Deglet
Nour, souvent exporte et qui constitue ainsi, une source non ngligeable de devises pour le
pays, ainsi que dautres varits commerciales telles que : Ghars, Mech Degla et Degla Bada,
..., etc (Ouinten, 1996).

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Chapitre II :
Lagent pathogne

Chapitre II : Lagent Pathogne

Synthse Bibliographique

1/ Historique de la taxonomie :
1.1/ Le genre Fusarium :
Le genre Fusarium a t dcrit pour la premire fois par Link en 1809 (in Booth, 1985). La
dtermination des Fusarium, comme celle des autres champignons imparfaits t base
essentiellement, et jusqu ce jour, sur les critres morphologiques (pigmentation, aspect du
myclium, prsence ou absence des spores, taille, forme, nombre de cloisons, ...).
La diversit et lextrme variabilit de ces caractres au cours des repiquages successifs et
en fonction des conditions de culture des champignons appartenant ce genre, expliquent les
difficults rencontres pour la classification, do les nombreux systmes taxonomiques et les
controverses proposs. Les travaux de Wollenweber et Rincking (1935), qui ont servi de
rfrences, ont pu dcrire 65 espces, 55 varits et 22 formes, rassembles en 16 sections et 06
sous-sections (Synder et Hansen, 1940).
Le genre Fusarium a t profondment revu par Synder et Hansen (1940, 1941, 1945),
Tousson et Nelson (1968, 1975) et Messiaen et Cassini (1968, 1981).
Ils ont simplifi la classification pour ne retenir que 09 espces, dans le but de permettre une
dtermination rapide des parasites rencontrs (Bounaga, 1991).
Dautres systmes taxonomiques proposs, sappuyant sur les travaux de Wollenweber, ont
t suggrs, notamment par Raillo (1935), Bilai (1955, 1970), Gordon (1952, 1960, 1965),
Booth (1971, 1975, 1981), Joffe (1974) et Gerlach (1970, 1977, 1981), et ils ont conserv un
certain nombre de section et despces avec quelques modifications (Bounaga, 1991).
1.2/ Lespce oxysporum :
Wollenweber et Rincking (1935) ont plac lespce oxysporum dans la section Elegans ,
quils ont subdivis en 03 sous-sections, en se basant sur la forme et la taille des spores et sur
les caractres culturaux.
Ds 1940, toutes les espces de la section

Elegans sont rassembles dans une seule

espce Fusarium oxysporum, par Synder et Hansen, laquelle, Synder et al., adjoignent le
cultivar Redolens en 1957.
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Synthse Bibliographique

Chapitre II : Lagent Pathogne

Dans le genre Fusarium, lespce oxysporum, constitue 50% 70% des populations

fusariennes des sols (Guillemat et Montegut, 1958; Gorden1965 ; M.C. Mullen et Stack,

1983). Elle est considre comme colonisatrice primaire du rhizoplan et du cortex racinaire.
Elle reprsente plus de 50 % des isolats de Fusarium partir des racines de plantes diverses
(Bruel, 1976 ; MC Mullen et Stack, 1983 ; in Bounaga, 1991).
Lespce oxysporum, peut vivre en saprophyte ou en parasites de vertbrs ou de plantes
(Nelson et al., 1981 ; Rebell, 1981, in Bounaga, 1991). Sa forme parfaite nest pas encore
connue.
1.3/ La forme spciale albedinis :
Lespce est actuellement subdivise en plus de 80 formes spciales (Armestrong G. et
Armestrong J., 1981), suivant la plante hte laquelle elle sattaque et dont elle est isole.

La

reconnaissance de ces formes spciales, ne fait appel aucun critre morphologique mais
seulement la pathognicit du champignon, dont la dtermination doit se faire par la
rinoculation du pathogne dans la plante hte (Bounaga, 1991).
Ces formes spciales peuvent tre subdivises en races, bases sur la pathognicit
diffrentielle des isolats sur des varits distinctes. Mais par contre, certaines formes spciales
ont t rassembles, car elles taient susceptibles de provoquer la mme maladie dans plusieurs
htes (Armestrong G. et Armestrong J., 1981). Le Fusarium oxysporum f. sp. albedinis est la
forme spciale du palmier dattier (Bounaga, 1991).

2/ Position systmatique :
Le systme Saccardo de la classification des champignons imparfaits

Fungi imperfecti

(Henni, 1998), classe le Fusarium comme suit :


Embrancement des Thallophytes,
Classe des Deutromyctes,
Ordre des Moniliales,
Famille des Tuberculariaces,
Genre Fusarium
espce oxysporum

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Synthse Bibliographique

Chapitre II : Lagent Pathogne

3/ Lagent pathogne : Fusarium oxysporum f.sp. albedinis


Le champignon imparfait Fusarium oxysporum f.sp. albedinis est un parasite vasculaire,
isol pour la premire fois dun palmier dattier infect en 1921 et identifi en 1934 par
Malenon comme tant un Fusarium oxysporum. Les souches isoles du palmier dattier, nont
infect que cette plante, elles constituent ce que lon appelle la forme spciale albedinis.
Il existe dautres plantes telles que la luzerne (Medicago sativa L.) et le henn (Lawsonia
inermis L.), qui sont cultives en association avec le palmier dattier et qui peuvent hberger le
Fusarium oxysporum f.sp. albedinis dans leurs racines, mais sans manifester aucun symptme
externe de la fusariose vasculaire, se sont donc des porteurs sains du Fusarium oxysporum
f.sp. albedinis (Djerbi et al., 1985).
Lagent pathogne (Fusarium oxysporum f.sp. albedinis), peut tre isol dun palmier dattier
infect, partir des rachis de palmes prsentant les symptmes typiques du Bayoud, en
dposant, dans des conditions aseptiques, des petits fragments sur un milieu de culture base
de Pomme de terre ou sur un milieu slectif (milieu Komada). Le Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis peut aussi tre isol partir de stipe ou de racine mais jamais de fruits (Malenon,
1950 ; Bulit et al., 1967 ; Ouinten, 1996).

4/ Description morphologique :
4.1/ Caractres macroscopiques :
Laspect

sauvage du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis est caractris par un tapis

myclien fin fris, de couleur rose saumon la lumire et blanc ou violet lobscurit, au sein
du quel se forme de petites sporodochies (Figure n 08).
Laspect ou la forme sauvage du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis permet didentifier
lagent causal du Bayoud sans recours aux tests de virulence (Djerbi et al., 1984 ; Sedra et
Djerbi, 1984). Des sclrotes de couleur bleue noire naissent parfois groupes et mesurent de 1
3 mm de diamtre (Djerbi, 1988).

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Figure n 08 : Aspect sauvage du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.

-21-

Chapitre II : Lagent Pathogne

Synthse Bibliographique
4.2/ Caractres microscopiques :

Le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis possde un myclium hyalin cloisonn, il est fin et
rgulier en culture jeune. Ce myclium prsente des cellules hypertrophies en chaine, daspect
globuleux en cultures ges ayant une grande ressemblance avec les chlamydospores, mais sans
paississement de la paroi.
La multiplication asexue se ralise par des microphialides et des marophialides qui
produisent respectivement des microconidies et des macroconidies.
- Les microconidies : sont trs nombreuses, hyalines de forme et de dimension variables dans
une mme culture (3-15 x 3-5 m). En culture jeune elles sont globuleuses, par contre en
culture ges, elles sont plus allonges. Les microconidies sont souvent unicellulaires, parfois
bicellulaires et possdent deux cloisons.
- Les macroconidies : sont peu nombreuses, base pdiforme, et une extrmit pointue et
courte. Elles possdent trois cloisons, rarement 4 ou 5 et mesurent (20-35 x 3-5 m).
- Les chlamydospores : dans les cultures ges ou dans le sol, le Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis forme des chlamydospores, rgulires, soit globuleuses, paroi lisse et paisse, et
leur taille varie de 6 20 m. Elles sont intercalaires ou terminales et sont isoles ou groupes
par 2. Elles se forment soit sur le myclium, soit partir des macroconidies (Bulletin OEPP/
EPPO, 2003).

a : macroconidies b : microconidies c : monophialide portant les microconidies en


fausses ttes

chelle = 50 m

Figure n 09 : Macroconidies et microconidies de Fusarium oxysporum


(Leslie et Summerell, 2006).

-22-

Chapitre III :
La maladie du Bayoud

Synthse Bibliographique

Chapitre III : La Maladie du Bayoud

Le palmier dattier, comme toute autre espce vgtale, se trouve sous la menace de diverses
pathologies dues des ravageurs (insectes ou acariens) ou des parasites (champignons,
bactries, ou mycoplasmes). A titre dexemple, on peut citer :

La maladie du Boufaroua , due un acarien, Oligonychus afrasiticus ;

La maladie du Djereb , due la cochenille blanche, Parlatoria blanchardi ;

La pourriture de linflorescence ou Khamedj , cause par le champignon imparfait,


Mauginiella scaetae.

La fusariose vasculaire appele Bayoud due au champignon imparfait appartenant


lespce Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.

Dautres maladies telles que la pourriture du bourgeon, la maladie du

cur qui

penche , ..., sont causes par dautres espces de champignons (Bounaga et Djerbi,
1990).
Si certaines de ces maladies, peuvent se manifester pour une priode ou une saison donne
et, par la suite, constituer linfection dont les dgts sont rversibles, en revanche, et
malheureusement, la fusariose vasculaire appele Bayoud reprsente la maladie la plus grave
et la plus dvastatrice qui provoque un dprissement irrversible du palmier dattier et, par
consquent, des dgts considrables et dfinitifs (Ouinten, 1996). Ainsi le patrimoine du
palmier dattier des rgions phnicicoles de lAfrique du Nord, est attaqu depuis plusieurs
dcennies, et continue ltre toujours, particulirement au Maroc et en Algrie (El Hadrami et
al., 2005).

1/ Historique et progression de la maladie :


Cest vraiment difficile dtablir exactement la date, le lieu et les conditions dans lesquelles
est apparue la maladie du Bayoud. Cependant, plusieurs auteurs, saccordent sur lorigine
Marocaine de la maladie (pays endmique), o elle a t observe pour la premire fois dans la
Valle du Dra, au nord du Zagora avant 1870. A cette poque, toutes les palmeraies qui
bordaient lOued du Dra ont t ravages (Malenon, 1934 ; Perreau Leroy, 1958 ; Toutain,
1965 ; Bulit et al., 1967 ; Djerbi, 1982).
Depuis lors, Le Bayoud progresse vers lOuest et atteint Foum El Hasan en 1960. Ds
1898, la maladie atteint les palmeraies de Figuig au Maroc et de Bni Ouenif en Algrie, puis

-24-

Synthse Bibliographique

Chapitre III : La Maladie du Bayoud

Bchar en 1940, par la localisation de quelques foyers. Les palmeraies proches de ces
centres sont atteintes leur tour tel que Bni Abbs en 1908 et Taghit en 1923 (Figure n 10).
Entre 1940 et 1950, deux contaminations sont particulirement importantes, la rgion dIn
Salah et celle dAdrar, respectivement vers 1943 et 1950 (Brac De La Perriere et Benkhalifa,
1991).
Bien que le Bayoud a enregistr une progression de proche en proche vers lOuest, de la
Valle du Dra au Maroc jusqu Bni Ouenif en Algrie ; il effectue au Sahara central de
lAlgrie, des bonds dsordonns, de rgions en rgions, malgr quelles soient trs loignes
gographiquement savoir :
-

700 km en 04 ans entre Bni Ouenif et Fouggarat El Arab,

300 km en 12 ans entre Bchar et Fatis,

700 km en 08 ans entre In salah et Metlili (Toutain, 1965).

Enfin, et plus rcemment, les palmeraies de Ghardaa et dEl Gola, sont contamines leur
tour en 1965 et 1978 (Djerbi, 1982 ; Brac De La Perriere et Benkhalifa, 1991). Paralllement,
certaines palmeraies algriennes sont indemnes, notamment les palmeraies de Kerzaz, de
Timimoun et de la Station de Recherche de lI.N.R.A. dAdrar (Brac De La Perriere et
Benkhalifa, 1991).

Figure n 10 : Situation pidmiologique du Bayoud du palmier dattier


(Fernandez et al., 1995).
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Synthse Bibliographique

Chapitre III : La Maladie du Bayoud

2/ Symptmes de la maladie :
2.1/ Symptmes externes :
En gnral, les premiers signes de la maladie se manifestent par un dprissement
progressif, de la base vers lextrmit, dune ou de plusieurs palmes au niveau de la couronne
moyenne. Les folioles ou les pines situs sur le mme ct de la palme se desschent et se
replient contre la nervure principale (rachis), cest lattaque hmiplgique typique de la
fusariose. Lorsque tout ce ct est atteint, le dprissement commence sur lautre ct, de
lextrmit jusqu la base (Bulletin OEPP/ EPPO, 2003).
En se desschant, la palme fini par mourir et prend laspect dune plume mouille

(Figure

n 11), avec une couleur blanchtre, do le nom du Bayoud, qui drive du mot arabe
abyed et qui veut dire blanc (Djerbi, 1990 ; Ouinten, 1996).
Lvolution du desschement sur les folioles saccompagne par lapparition dune rayure
brune longitudinale sur le rachis. Depuis, lattaque se gnralise sur la totalit des palmes du
bourgeon terminal, entranant ainsi la mort de larbre.
Le palmier dattier atteint, meurt 06 mois 12 ans, aprs lattaque par le Fusarium
oxysporum f.sp. albedinis et lapparition des premiers symptmes de la maladie (Bulletin
OEPP/ EPPO, 2003).

Figure n 11 : Symptmes de la maladie du Bayoud .

-26-

Synthse Bibliographique

Chapitre III : La Maladie du Bayoud

2.2/ Symptmes internes :


Le dracinement dun palmier dattier malade permet dobserver un nombre rduit de racines
malades rougetres, elles reprsentent la porte pour la pntration du champignon. De plus, des
coupes transversales au niveau du tronc, mettent en vidence une coloration brune rougetre
des vaisseaux conducteurs, tmoignant le passage du champignon le long du stipe (OEPP,
1994).

3/ Pntration dans le palmier dattier et progression du champignon :


La pntration du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis se fait au niveau du systme
racinaire, travers les tissus trs jeunes des radicelles proches de la coiffe ou bien travers des
ouvertures provoques par diverses causes biologiques ou mcaniques (Malenon, 1950).
Le champignon traverse les parenchymes par voie inter puis intra cellulaire jusqu
atteindre le cylindre central. Une fois arriv dans les vaisseaux conducteurs du palmier dattier,
le champignon sinstalle et la progression est ascendante.
Par la suite, le champignon fructifie et libre des conidies qui sont entranes par la sve
montante. Arrives et bloques par les cloisons transversales des vaisseaux, les conidies sont
arrtes, elles germent et donnent naissance des filaments mycliens qui traversent la cloison.
Le myclium poursuit son dveloppement et forme de nouvelles microconidies ; ce phnomne
se poursuit jusquau sommet du palmier dattier entrainant ainsi sa mort

(OEPP, 1994).

4/ Epidmiologie :
Le champignon est distribu ingalement dans le sol, prsent entre 0 et 30 cm parfois
jusqu plus de 1m de profondeur (Tantaoui, 1989). Il peut tre alternativement saprophyte ou
parasite (Bounaga, 1985). Il peut aussi se conserver pendant plusieurs annes sous forme de
chlamydospores, dans le sol, en absence de la plante hte ou dans les tissus dun palmier dattier
infect (Louvet, 1977).
La contamination seffectue dune manire rgulire par le contact entre les racines malades
et les racines saines entre les palmiers dattiers, ainsi, lirrigation importante favorise
lexpansion de la maladie.

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Synthse Bibliographique

Chapitre III : La Maladie du Bayoud

Les plantes des autres cultures, associes la phoeniciculture, dont on a dj parl, et qui
sont des porteurs sains , peuvent contribuer au maintien du Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis dans le sol.
La propagation de la maladie du Bayoud entre les palmeraies contamines et celles
indemnes, peut tre assure par la dispersion des conidies (Laville, 1973), principalement par
lchange du matriel vgtal (rejets), du sol, doutils ou de machines agricoles, ..., etc
(Bulletin OEPP/ EPPO, 2003). Ltendue de cette dispersion dpend aussi des pratiques
culturales (fertilisation, irrigation,...) et des conditions climatiques (temprature, vent,...)
(OEPP, 1994).

5/ Moyens de luttes contre la maladie du Bayoud :


5.1/ Les mesures prophylactiques :
Afin dviter ou de retarder la dissmination du Bayoud dans les rgions indemnes, les
mesures prophylactiques constituent un des moyens de luttes prventifs contre cette
trachomycose, grce la sensibilisation et laide des phoeniciculteurs, dune part, pour mieux
connatre la maladie, laire de sa rpartition, sa progression et sa surveillance et dautres parts,
pour veiller nutiliser que des rejets sains pour la plantation et dinterdire les changes de
matriel vgtal entre les palmeraies.
5.2/ Les techniques culturales :
Les techniques culturales contre les fusarioses vasculaires, consistent viter les conditions
favorisant la croissance de lagent pathogne. La maladie est moins prsente en conditions
dirrigation rduites, ainsi que dans les sols pH alcalin, riches en calcium et potassium,
pauvres en phosphore et magnsium et dont lazote est sous forme nitrique plutt
quammoniacal (Woltz et Johnes, 1981 ; Ollaguier et Renard, 1976).
Dans les parcelles contamines, il faut viter les cultures du henn et de la luzerne qui
ncessitent une irrigation abondante favorable la maladie, et qui sont des porteurs sains de
lagent pathogne, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis (Bulit et al., 1967).
En outre, le contact souterrain entre les arbres voisins doit tre vit, par lapplication des
mthodes modernes dirrigation et de plantation des palmiers dattiers (Louvet, 1991).
-28-

Synthse Bibliographique

Chapitre III : La Maladie du Bayoud

5.3/ La lutte chimique :


La lutte chimique repose sur lutilisation de nombreux produits phytosanitaires qui sont soit
thrapeutiques, appels systmiques, soit protecteurs, appels prventifs (Roger, 1990).
La dsinfection du sol est trs couteuse et difficile, ainsi, la lutte chimique nest
envisageable qu la dcouverte du foyer primaire (point de dpart dune nouvelle infection
dans une rgion saine). Dans ce cas, le traitement du sol peut tre effectu par lutilisation du
bromure de mthyle (Frederix et Den Brader, 1989).
Diffrents autres fongicides couramment utiliss en agriculture ont t tests (Saaidi et
Rodet, 1974 ; Vanachter, 1991 ; Frederiks et Dembreber, 1991), tels que :

Le bnomyl et le mthylthophanate, qui inhibent la croissance myclienne in vitro des


doses de 10 et 100 ppm respectivement (Saaidi et Rodet, 1974).

La chloropicrine, qui est une substance chimique hautement volatile avec une activit
antifongique trs leve, mais qui prsente linconvnient de ne pntrer que faiblement
dans les dbris vgtaux. Contrairement au bromure de mthyle, qui prsente une
grande capacit de pntrer dans le sol grce sa tension de vapeur leve, mais avec
une fongitoxicit relativement moins leve (Cheikh-Assa, 1990 ; Vanachter, 1991).

Cependant, si lapplication de ces fongicides a donn des rsultats encourageants pour la


lutte contre ce pathogne (Fusarium oxysporum f.sp. albedinis), lutilisation rpte de ces
produits de synthse entraine souvent la pollution de lenvironnement et lapparition chez le
parasite de nouvelles souches rsistantes et plus virulentes (Ozbaz et Newman, 2004). De plus,
leurs effets toxiques sont souvent signals pour lhomme et lanimal (Messiaen et Lafon, 1970)
et pour le dsquilibre biologique du sol.
5.4/ La lutte biologique :
Une autre alternative pour protger les plantes contre les agents pathognes est lapplication
des mthodes de biocontrle (Azco n-Aguilar et Bare, 1997), par lutilisation de diffrents
micro-organismes dous dactivit antagoniste, conduisant des phnomnes dantibiose et
dhyperparasitisme.

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Synthse Bibliographique

Chapitre III : La Maladie du Bayoud

Plusieurs chercheurs se sont intresss aux micro-organismes antagonistes tels que les
bactries, les champignons et les actinomyctes, dans lespoir de mettre au point un procd de
lutte efficace capable de limiter la gravit des fusarioses (Alabouvette et al., 1986).
Parmi les bactries utilises en lutte biologique, on peut citer les Pseudomonas fluorescens
et Serratia marcescens, et parmi mes champignons, il existe les Fusarium non pathognes et le
Trichoderma harzianum.
Amir (1991 a) et Amir et Mahdi (1993), ont slectionn des souches de Fusarium solani et
Fusarium oxysporum non pathogne, pour leur pouvoir comptitif lev et inhibiteur de deux
formes spciales : Fusarium oxysporum f.sp. lini et Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
Hibar et ses collaborateurs (2005), ont montr quil est dintrt primordial dutiliser le
Trichoderma harzianum en tant quagent de lutte biologique contre la fusariose vasculaire.
5.5/ La lutte gntique :
Le palmier dattier a lavantage de prsenter une grande diversit gntique de rsistance au
Bayoud (Bounaga et al., 1992).
Cette diversit gntique de chaque palmeraie qui est le fruit de slections autonomes et
dchanges entre les agriculteurs, a servi dans la plupart des cas luter directement contre la
fusariose par la multiplication empirique des clones les plus tolrants (Brac de la Perriere et
Bounaga, 1990). Ceci est mis en vidence, pendant 25 ans, aprs les essais de comparaison de
rsistance de 32 varits au Bayoud, dans les palmeraies infestes naturellement au Maroc.
Selon Saadi (1992), ces cultivars rsistants sont devenus susceptibles aprs 15 ans.
Lexpression de ce type de rsistance est influence par les conditions de dveloppement des
arbres et probablement par labondance et lactivit de linoculum de Fusarium pathogne dans
le sol (Louvet, 1991).
5.6/ La lutte intgre :
Amir (1991 b), propose galement une lutte intgre contre Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis comprenant lradication par fumigation et inoculation avec des antagonistes des
foyers primaires dangereux, cration de varits rsistantes nouvelles par croisement, recherche
de mutants rsistants partir des cultures in vitro, cration des ppinires et repeuplement des
palmeraies dvastes grce la multiplication in vitro de plants
-30-

Synthse Bibliographique

Chapitre III : La Maladie du Bayoud

ventuellement inoculs en antagonistes ; radication par desschement et ressalement naturel


du sol et lintroduction de la lutte prophylactique et culturale.
Ces mthodes sont complmentaires et prennent en compte la prvention, lradication des
foyers et le repeuplement des zones dvastes.

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Deuxime Partie :
Matriels et Mthodes

Chapitre I :
Etude du parasite et de la
plante hte

Matriels et Mthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte

I/ Le parasite et sa culture :
1.1/ Espce tudie :
Notre tude est base essentiellement sur le champignon phytopathogne Fusarium
oxysporum f.sp. albedinis (F.o.a), lagent causal de la fusariose vasculaire. Cette maladie
connue sous le nom du Bayoud , chez le palmier dattier, menace la majorit des palmeraies
algriennes.

1.2/ Echantillonnage et isolement des souches de F.o.a. :


Nous avons isol une vingtaine de souches de Fusarium. La liste complte est fournie dans
le Tableau n 02 avec la date et le lieu dchantillonnage ainsi que la partie disolement dont
elles proviennent.
Toutes les souches isoles ont fait lobjet de la culture monospore. Les cinq souches de
F.o.a. isoles du rachis (F1-F4-F7-F8- et F13) et lune isole du sol (F12), ont t utilises
pour le test du pouvoir pathogne, pour le dosage des protines totales et pour ltude du
polymorphisme isoenzymatique. Pour les essais dantagonisme (lutte biologique), seules les
cinq souches isoles du rachis ont t utilises.
1.3/ Techniques disolement de F.o.a. :
1.3.1/ Isolement partir des rachis infects :
Le rachis des palmes infectes, prsentant les symptmes typiques du

Bayoud

(Figure n 12), est dbarrass des tissus externes, coup dune faon transversale puis dcoup
en petits fragments. Ces derniers sont tromps dans une solution dHypochlorite de Sodium
dilue 2% pendant 03 minutes, pour une dsinfection superficielle ensuite rincs avec trois
bains successifs deau distille strile.
Les petits fragments sont dposs (la face sectionne), dans des boites de Ptri
(Figure n 13) contenant le milieu PDA (Annexe n 01). Les boites sont mises incuber dans
une chambre de culture, une temprature de 22 C, sous une photopriode de 12 heures.

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Matriels et Mthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte

Tableau n 02 : Sites dchantillonnages et souches isoles de F.o.a..

Date
dchantillonnage

Rfrence
de la souche

Partie
disolement

Site de prlvement

Wilaya

F1
F 1

El Mahdia

Adrar

18-03-2008

F 2

Aoughrout (Timimoun)

Adrar

Rhizosphre

02-04-2008

F 3

Laksour (Timimoun)

Adrar

Rhizosphre

11-03-2008

Rachis
Rhizosphre

Rachis

F4
F 4

Igli A2

F 5

Igli A3

Bchar

Rhizosphre

F6

Igli A4

Bchar

Rachis

F7

Igli A5

Bchar

Rachis

F8
F 8
F 8

Igli B

Bchar

F 9

Bni Abbes -1-

Bchar

Rhizosphre

F 10

Bni Abbes -2-

Bchar

Rhizosphre

F 11

Bni Abbes -3-

Bchar

Rhizosphre

Taghit

Bchar

Rhizosphre

Bchar
Rhizosphre

26, 27 -03-2008
Rachis
Rhizosphre

F 12
10-04-2008

F 12

21-05-2008

F 13

Ksar Ouled Aissa


(Timimoun)

Adrar

Rachis

03-07-2008

F 14

Mat (Taghit)

Bchar

Rhizosphre

03-06-2008

F 15

Ghardaa

Rachis

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Matriels et Mthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte

Figure n 12 : Symptme unilatral du Bayoud sur une palme infecte.

Figure n 13 : Isolement du champignon partir de rachis infect sur milieu PDA.

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Matriels et Mthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte

1.3.2/ Isolement partir de la rhizosphre :


Lchantillon du sol rhizosphrique est bien tamis et scher dans une tuve rgle 70 C
pendant 03 jours, et pour lisolement dun Fusarium, on procde de deux manires:
saupoudrer directement quelques graines de sol la surface dune boite de Ptri contenant le
milieu PDA additionn dantibiotique,
raliser une srie de dilutions dcimales.
En arriver la dilution 10-6, 05 06 gouttes de cette dernire, sont tales la surface
dune boite de Ptri contenant le milieu Glose 2% (Annexe n 01). Lincubation se fait
22 C, sous une photopriode de 12 heures.

1.4/ Purification des souches de F.o.a. :


Aprs 05 07 jours dincubation, des hyphes mycliennes apparaissent au tour de chaque
petit fragment de rachis infect, ou bien des petites tches blanches la surface de la boite pour
la technique disolement partir de la rhizosphre (technique des dilutions).
Des explants de la zone priphrique du myclium ne prsentant aucune contamination,
ainsi que ces petites taches blanches, sont prlevs et transfrs (dune manire aseptique) sur
dautres boites de Ptri contenant le milieu PDA.
Ces repiquages sont renouvels plusieurs fois jusqu lobtention dune culture pure.
A fin dobtenir une culture issue dune mme ascendance, la culture monospore reste le
procd le plus simple et le plus sr.
Cette technique consiste introduire dans un tube de 09 ml deau distille strile, un petit
fragment qui a pouss sur milieu PDA et g de 07 jours. Le tout est agit pendant 02 minutes.
Un (01) ml de cette suspension de spores, est tal la surface dune boite de Ptri contenant le
milieu Glose 2%. Aprs 24 48 heures, et laide dune loupe binoculaire, les spores germes
sont repres puis ensemences aseptiquement sur milieu PDA (05 spores en moyenne), puis
mises incuber 22 C pendant une semaine. Les cultures issues de la croissance dune seule
spore sont appeles clones.

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Matriels et Mthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte

1.5/ Identification des souches de F.o.a. :


1.5.1/ Etude des caractres culturaux :
Cette tude est ralise par un repiquage dun implant myclien de 6 mm de diamtre (de
chaque isolat), dans des boites de Ptri contenant chacune un milieu diffrent de lautre :

un milieu organique (PDA),

un milieu minral (Czapeck),

un milieu riche (Mathur) (Annexe n 01).

Laspect morphologique de la colonie, et sa pigmentation, seffectue par un examen direct


lil nu, le diamtre de la colonie est mesur quotidiennement pendant 10 jours dincubation
22 C sous photopriode de 12 heures.

1.5.2/ Etude des caractres microscopiques :


Lexamen dun implant entre lame et lamelle, dans une goutte de Bleu de Mthylne, ne
permet pas lobtention de la structure intacte du champignon cause de sa fragilit particulire.
Pour cela, deux techniques appropries pour lexamen direct au microscope, sont utilises :

1.5.2.1/ Culture en chambre humide :


Une boite de Ptri en verre doit contenir un support, sur lequel sont dposes une lame
avec sa lamelle. Le tout est strilis au four Pasteur 170 C pendant 30 minutes.
Une goutte du milieu PDA est dpose sur la lame, puis recouverte de sa lamelle ( laide
dune pince strile). Lexcs du milieu qui dborde sous la lamelle est ensemenc par la souche
de Fusarium. On fait couler quelques millilitres deau distille strile dans la boite de Ptri et la
culture est mise incuber 22 C pendant 5 7 jours.

1.5.2.2/ Repiquage sur milieu CLA :


Le milieu CLA (Carnation Leaf Agar) est un milieu substrat naturel, ce petit morceau de
feuille dillet, que contient le milieu, favorise la sporulation des macroconidies (Synder et al.,
1947, Fisher et al., 1982).

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Matriels et Mthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte

Les petits morceaux de feuilles dillet sont prpars partir dune collecte de cette plante
dillet frache non traite par des fongicides dinsecticides. Les feuilles collectes sont
dcoupes en petits morceaux de 5-8 mm2 (ils se rtrcissent aprs schage), puis schs dans
un four (~70 C) pendant 3 4 heures, ils peuvent tre schs aussi dans une micro-onde. Le
stockage de ces petits morceaux se fait dans un endroit sec de temprature ambiante jusqu 12
mois avant usage (Leslie et Summerell, 2006).
Une bouture myclienne est place ct de cette feuille dillet strile, le tout, dans une
boite de Ptri contenant le milieu Glose 2%. La boite est mise incuber dans la chambre de
culture 22 C, sous une photopriode de 12 heures.

1.5.2.3/ Observations microscopiques :


Aprs incubation de la culture en chambre humide, la lame est observe au microscope
optique au grossissement x 400.
Plusieurs espces de Fusarium sporulent sur le milieu CLA aprs 06 10 jours de
repiquage. Les cultures fongiques sur milieu CLA produisent des macroconidies de formes et
de dimensions plus constantes que celles produites sur des milieux riches tels que le milieu
PDA ou le milieu Czapek.
Le mode de formation des macroconidies sur des monophialides ou des polyphialides, la
prsence de chaines ou de fausses ttes des microconidies ainsi que la prsence des
chlamydospores, peuvent tre dtermins par un examen direct de la boite de Ptri (culture
fongique sur milieu CLA), sous microscope optique au grossissement (x 400) en suivant une
cl didentification des espces de Fusarium.

1.6/ Etude physiologique des souches de F.o.a. :


Cette tude sest applique sur un seul isolat de F.o.a. (Lisolat F13), qui a montr une
meilleure vitesse de croissance durant la priode dincubation sur les trois diffrents milieux de
culture cits prcdemment. Les expriences ont t rptes trois fois (trois boites pour chaque
facteur tudi).

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Matriels et Mthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte

1.6.1/ Influence de la temprature :


Pour dterminer la temprature optimale, des boites de Ptri contenant un seul milieu de
culture choisi : le milieu PDA, sont ensemences au centre par une bouture myclienne de 6
mm de diamtre, prleve dune prculture ge de 07 jours. Les boites sont incubes
diffrentes tempratures : 15 C, 22 C, 28 C et 35 C pendant 7 jours. La lecture des
diamtres est effectue quotidiennement.

1.6.2/ Influence des sources carbones :


Pour chercher la source de carbone la plus assimilable par notre souche, le milieu utilis
tait le milieu Czapek, dans lequel, le saccharose utilis pour les boites tmoin, tait remplac
par dautres sources de carbone : le Glucose comme monosaccharide, le Maltose comme
disaccharide et lAmidon comme polysaccharide.
1.6.3/ Influence des sources azotes :
Le milieu utilis est le milieu Czapek, dont la source dazote NaNo3 (Nitrate de Sodium)
est remplace par le KNO3 (Nitrate de Potassium) et le NH4SO4 (Sulfate dAmmonium),
comme deux sources dazote minral, et par lAsparagine comme source dazote organique.

1.6.4/ Influence de la lumire :


Le milieu utilis est le milieu PDA. Les boites de Ptri sont ensemences au centre puis
mises incubes sous : un clairage continu, une photopriode de 12heures une obscurit
continue.
1.6.5/ Influence du pH du milieu :
Pour prciser le pH optimal la croissance myclienne de F.o.a., notre souche est cultive
sur milieu PDA solide tamponn diffrents pH : 4 et 5 par le Tampon Actate de Sodium, 7 et
8 par le Tampon Phosphate.
- Tampon actate : compos de deux solutions :

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Matriels et Mthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte

Solution A = Solution dacide actique 0,2 M.


Solution B = Solution dactate de sodium 0,2 M.
X ml de la solution A + Y ml de la solution B
pH

41,0

9,0

14,8

35,2

- Tampon phosphate : compos de deux solutions :


Solution A = Solution de Na2HPO4 0,2 M.
Solution B = Solution de NaH2PO4 0,2 M.
X ml de la solution A + Y ml de la solution B
pH

39,0

61,0

94,7

5,3

1.6.6/ Influence de lhumidit :


La technique consiste placer des implants de 6 mm de diamtre de la souche de F.o.a. sur
le milieu PDA en boite de Ptri. Les boites sont tournes et les couvercles sont remplis de 9 ml
dune solution saline sature. Le tableau suivant montre la quantit de sel ajoute 100 ml
deau distille pour lobtention des diffrents taux dhumidit.

Solutions

Taux dhumidit relative

Eau distille

100 %

0,8 g Na Cl

95 %

10 g Na Cl

80 %

30 g Na Cl

74 %

32 g Na Cl

50 %

50 g Na Cl

14 %

-41-

Matriels et Mthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte

1.7/ Conservation des souches de F.o.a. :


La conservation des souches de Fusarium oxysporum f.sp. albedinis se fait par des cultures
inclines sur diffrents milieux : PDA, Glose 2%, SNA (Annexe n 01), une temprature de
- 4 C et ceci pour des utilisations ultrieures.

II/ Lhte et sa culture :


2.1/ Espce tudie :
Etant donn que notre tude porte essentiellement sur le champignon Fusarium oxysporum
f.sp. albedinis qui attaque le palmier dattier appel aussi Phoenix dactylifera L., nous avons
donc besoin dans nos essais de petites plantules de palmier dattier issues de la germination des
noyaux de dattes.
2.2/ Prparation des plantules de palmier dattier :
2.2.1/ Germination des noyaux de dattes :
La germination sest effectue au niveau de notre laboratoire, en rcoltant un nombre lev
de noyaux de dattes. Aprs la dsinfection, par trempage dans une solution dHypochlorite de
Sodium dilue 2% pendant 03 minutes, suivie de 03 bains successifs deau distille strile, les
noyaux sont dposs dans des boites de Ptri en verre tapisses dun coton imbib deau
distille, striliss auparavant lautoclave 120 C pendant 20 minutes avec une pression de
1 bar.
Les boites sont incubes une temprature de 4 C pendant 02 03 jours pour acclrer la
germination, puis sont transfres dans une tuve rgle une temprature de 28 C pour
provoquer un choc thermique aux noyaux. Aprs 07 09 jours dincubation, lembryon de
chaque noyau peut apparatre la surface (Figure n 14).
2.2.2/ Plantation des noyaux de dattes :
Les noyaux avec leurs embryons sont transfrs dans des sacs en plastique, contenant un
mlange de tourbe et de sol (V/V), puis arross avec une solution nutritive, une deux fois par
semaine. Aprs 30 40 jours, la premire feuille apparat la surface.

-42-

Matriels et Mthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte

Figure n 14 : Germination dun noyau de datte.

-43-

Matriels et Mthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte

2.2.3/ Prparation de la solution nutritive (Solution KNOP) :


Il suffit de mlanger les ingrdients suivants, un un, dans un litre deau distille :

Nitrate de Calcium

(CaNO3)

Nitrate de Potassium

(KNO3)

0,25 g

Sulfate de Magnsium

(MgSO4)

0,25 g

Phosphate monopotassique

(KH2PO4)

0,25 g

Sulfate ferreux

(FeSO4)

0,001 g

2.3/ Etude du pouvoir pathogne :


2.3.1/ Prparation de linoculum :
Sept boites de Ptri sont ensemences avec 01 ml dune suspension de spores, prpare
partir dune culture ge de 05 jours, ( raison dune boite pour chaque souche), puis sont mises
incuber 22 C pendant 08 jours. Aprs ce temps dincubation, la surface de la boite de
chaque isolat est racle avec 05 ml deau distille strile. Cette opration est rpte pour une
deuxime fois. Les 10 ml rcuprs reprsentent la suspension de spores ou linoculum qui sera
ajust par la suite 106 spores/ ml ( laide dune cellule de Malassez).
2.3.2/ Inoculation des plantules au niveau du systme racinaire :
Dans cette tude, nous nous sommes arrivs cultiver 56 plantule de palmier dattier, dont
40 plantules, ges de 03 mois 01 semaine (au stade vgtatif de 02 03 feuilles), sont
rparties en 08 lots ( raison dun lot pour chaque souche, les deux derniers tant des lots
tmoins). Chaque lot est compos de 05 plantules, cest--dire que 05 rptitions ont t
effectues.
Aprs avoir prpar et ajust la suspension de spores 106 spores / ml, linfection est
ralise par linoculation ( laide dune seringue) de 10 ml de cette suspension dans les
racines de chaque plantule, rassembles la base du sachet.
Paralllement et pour les deux lots tmoins mis en place, le premier est trait par 10 ml
deau distille strile, le second reprsente les plantules nayant subies aucun traitement.
Lensemble des plantules a t dispos sous serre.

-44-

Matriels et Mthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hte

2.3.3/ Risolement du parasite :


Aprs linoculation, la recherche du parasite dans la plante infecte a pour objectif de
montrer la capacit du champignon de pntrer dans la plante et de sassurer que les
symptmes nots sont leffet du pathogne. Ce contrle est effectu sur toutes les plantes
inocules, le champignon est recherch dans le sol, au niveau des racines et dans la tige.
Lorgane vgtal est dsinfect superficiellement (passage lthanol et flambage) et
dcoup dune manire longitudinale et en conditions aseptiques en petits fragments que lon
dpose, la face sectionne, sur milieu PDA en boites de Ptri. Lincubation de ces fragments est
ralise 22 C.

-45-

Chapitre II :
Etude du polymorphisme
isoenzymatique

Matriels et Mthodes

Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique

I/ Dosage des protines totales des isolats de F.o.a. :


1.1/ Prparation des extraits mycliens :
1.1.1/ Culture du champignon :
Des fioles de roux, contenant 100 ml de liquide de Czapeck-Dox, sont ensemences par 5
boutures mycliennes (de 6 mm de diamtre), prleves de la zone priphrique dune
prculture (5 7 jours) du champignon sur milieu PDA. Les cultures raison de 2 fioles pour
chaque isolat sont conduites 22 C pendant 10 jours sous agitation et photopriode de 12
heures.

1.1.2/ Obtention des extraits :


Le myclium est rcupr aprs filtration du milieu de culture laide dune passoire
strile. Il est ensuite broy dans un mortier maintenu au froid dans de la glace, additionn du
sable de Fontaine bleau et du Tampon Phosphate (0,1 M - pH 7,1) (P/P/V), jusqu lobtention
dune pte fine et homogne. Le broyt est rcupr dans des tubes puis centrifugs 10 000 g
pendant 20 minutes dans une centrifugeuse rfrigre (4 C) (type Biofuge).
Le surnageant est rparti rapidement dans des tubes eppendorf par fraction de 100 l. Il
peut tre utilis directement pour llectrophorse, comme il peut tre conserv au conglateur
mais, une fois dcongel, il nest jamais recongel.

1.2/ Principe du dosage des protines :


La mthode utilise dans notre exprience est celle de Bradford (1976), qui consiste une
coloration des protines par le Bleu de Coomassie G250. Lintensit de la coloration est
proportionnelle la concentration des protines et le maximum dabsorption est situ une
longueur dondes = 595 nm.

-47-

Matriels et Mthodes

Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique

1.2.1/ Composition du Ractif de Bradford :

Bleu de Coomassie

10 mg

Acide Orthophosphorique 85 %

10 ml

Ethanol 95 %

5 ml

Eau distille q.s.p.

100 ml

1.2.2/ Courbe dtalonnage :


Une solution mre de Srum Bovine Albumine (SBA) est prpare une concentration de
1 mg/ ml. De cette dernire une srie de dilutions est effectue. A chaque dilution, 2 ml de
ractif de Bradford sont ajouts pour faire la lecture au spectrophotomtre, une longueur
dondes = 595 nm, on peut aller mme jusqu 20 dilutions (Tableau n 03 ci-aprs) :
Dilution

1/2

1/3

1/4

1/5

1/6

1/7

1/8

1/9

1/10

blanc

SBA (l)

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Eau distille (l)

100

200

300

400

500

600

700

800

900

200

Bradford (ml)

Tableau n 03 : Dilutions de la courbe dtalonnage.


Pour dterminer la concentration des protines dans lextrait enzymatique de chaque
chantillon, 100 l de chaque extrait est mlang avec 2 ml de ractif de Bradford, bien agit
au vortex et aprs 2 3 minutes de repos, la lecture de la densit optique (D.O.) est faite la
longueur dondes = 595 nm.

II/ lectrophorse :
2.1/ Prparation des gels pour le systme PAGE :
Llectrophorse se fait sur gel de polyacrylamide. Les deux gels (de sparation 10% et
de concentration 5%) sont prpars selon la mthode de Laenlmli (1970), modifie de la
manire suivante (Tableau n 04 ci-contre) :

-48-

Matriels et Mthodes

Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique

Tableau n 04 : Composition des gels de polyacrylamide.

Gel de
sparation 10%

Gel de
concentration 5%

Solution dacrylamide 30%

5 ml

2,5 ml

Solution de bis-acrylamide 1%

5 ml

3,9 ml

Tampon de sparation pH = 8,8

1,95 ml

3,75 ml

0,15 ml

0,15 ml

Eau distille

4,1 ml

4,65 ml

Temed

50 l

50 l

Persulfate dAmmonium 10%

100 l

100 l

Solutions

Tampon de concentration pH = 6,8


Solution SDS 10% (pour le
systme SDS-PAGE)

La composition des tampons utiliss pour la prparation des gels et pour la migration est
donne en Annexe n 02.
Le gel se prsente sous forme de matriel glifi, form par la polymrisation dun
mlange dacrylamide et de bis-acrylamide. Le gel de concentration est coul en haut du gel de
sparation, pour permettre une entre homogne de lchantillon dans le gel de sparation. Des
pistes individuelles (puits) sont ralises laide dun peigne, qui spare le gel de concentration
en portions gales, destines la migration de chaque chantillon.

2.2/ Migration et mise sous tension :


Les extraits enzymatiques de chaque chantillon, sont dilus dans du tampon de charge
avec des proportions 5 : 1 (V/V) dans chaque puits.
Chaque extrmit du gel sera mise en contact avec le tampon de migration qui, soumis
dans un potentiel lectrique, permettra la propagation dun courant dans le gel. Ce courant
entranera les molcules constituant lchantillon.
La migration se droule en chambre froide 4 C sous tension constante de 150 V, avec
une intensit de 50 mA durant environ 2 heures.

-49-

Matriels et Mthodes

Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique

2.3/ Rvlation des systmes isoenzymatiques :


La rvlation des isoenzymes est effectue par incubation du gel (aprs dmoulage) dans
un mlange ractionnel, contenant le substrat de lenzyme tudie. Trois systmes
enzymatiques sont tudis : Estrases (Est), Phosphatases acide (PAC) et Peroxydases (Pox).
Le tableau n 05 ci-aprs, nous indique les mlanges ractionnels pour la rvlation de ces
dernires.
Tableau n 05 : Les mlanges ractionnels pour les rvlations enzymatiques.

Enzyme

Estrases Scandalios (1969)

Mlange ractionnel

Fast Blue RR

40 mg

Tampon Phosphate (0,1 M; pH = 7,1) (1)

50 ml

Un ester carboxylique + H2O


Est

un alcool + un anion
acide carboxylique

Bien dissoudre, Ajouter:


-Naphtyl Actate 2% (0,02g dans 1 ml Actone) 2 ml
-Naphtyl Actate 2% (0,02g dans 1 ml Actone) 2 ml
Rincer et Fixer.

Phosphatase Acide (PAC)


Pai, Endo et Oka (1975)

-Naphtyl Acide Phosphate

50 mg

Fast Garnet GBC

50 mg

Tampon Actate (0,05 M; pH = 5) (2)

50 ml

-Naphtyl Phosphate
-Naphtol Actate

PAC

Peroxydase
Shaw et Prasad

Incuber 3 heures 40 C, Rincer et Fixer.

3 Amino, 9 Ethyl Carbazole


Dimthyl formamide
Tampon Actate (0,05 M ; pH = 5)

Pox
2 H2O2

2 H2O2 + O2

Solution de Ca Cl2 (0,1 M) (3)


Solution de H2O2 30%

40 mg
5 ml
92,5 ml
2 ml
30 l

Incuber 30 60 minutes, Rincer et Fixer.

NB : Les chiffres crits en gras entre parenthses (1 3) renvoient la liste des solutions de
rvlation en Annexe n 02.
-50-

Matriels et Mthodes

Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique

2.4/ Isoenzymes tudis :


Le terme Isoenzyme a t introduit en premier par Markert et Moller (1959), pour faire
rfrence de multiples formes molculaires d'une enzyme, avec une semblable ou identique
spcificit du substrat, qui se produit dans le mme organisme (Baaziz, 2000).
- Les Estrases :
Une estrase est une enzyme de l'hydrolase qui fend les esters en un acide et un alcool,
sous une raction chimique avec l'eau appele l'hydrolyse.
Il existe une grande gamme destrases, mais qui diffrent entre elles par la spcificit du
substrat, la structure de la protine et la fonction biologique (Baaziz, 2002).

- Les Phosphatases Acides (PAC) :


Sous le terme de Phosphatase Acide, sont regroupes des hydrolases. Ces hydrolases
catalysent la dphosphorylation d'esters orthophosphoriques organiques et dont le pH d'activit
optimale est infrieur 7. Elles possdent galement une activit transfrasique, assurant le
transfert d'un phosphate sur le groupement hydroxyle d'un alcool (Moss, 1984).
- Les Peroxydases :
Une Peroxydase est une enzyme, qui contient parfois un hme, qui catalyse une raction de
la forme :
ROOR' + donneur d'lectrons (2 e-) + 2H+ ROH + R'OH
Ce type d'enzyme a notamment pour fonction de dcomposer les peroxydes, drivs
toxiques de l'oxygne (comme par exemple l'eau oxygne ou peroxyde d'hydrogne), ce qui
lui vaut son nom. Se sont des enzymes trs rpondues chez les tres vivants. Chez les plantes,
elles catalysent loxydation de diffrents substrats (des amines aromatiques, des phnols,...),
elles interviennent ainsi dans diffrents phnomnes physiologiques tels que lenracinement, la
lignification, et la rsistance aux stress biotiques et abiotiques (Qacif et al., 2006).
Certaines interviennent dans le mtabolisme de l'iode et sont ncessaires l'laboration des
hormones thyrodiennes. D'autres participent au transfert du chlore dans certaines cellules

-51-

Matriels et Mthodes

Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique

du systme immunitaire, permettant ainsi la production d'hypochlorite (la vulgaire eau de


Javel), servant la destruction des microorganismes ingrs. D'autres microorganismes utilisent
des Peroxydases pour fabriquer des antibiotiques. Ces enzymes sont donc parmi les plus
universelles du monde vivant.

2.5/ Prparation des gels pour le systme SDS-PAGE :


La diffrence qui existe entre le systme PAGE et le systme SDS-PAGE, est la prsence
de lagent dissociant le plus utilis et le dtergent anionique qui dfait la structure spatiale et se
fixe sur les protines chaud : Sodium Dodcyl Sulfate (SDS). Toutes les molcules seraient
donc charges ngativement et la sparation est uniquement fonction de la masse molculaire
(taille) (Lafont, 2005).
La prparation des gels de sparation et de concentration est la mme que celle du systme
PAGE additionne du SDS (Tableau n 04).

2.6/ Dnaturation des chantillons :


Lextrait enzymatique de chaque chantillon est dilu dans un mme volume du tampon de
charge (V/V). Le tout est port bullition dans un bain-marie pendant 5 minutes.

2.7/ Rvlation des bandes :


Aprs une migration complte, le gel est fix puis color afin de pouvoir visualiser les
bandes protiques. Les solutions de fixation, de coloration, de dcoloration et de conservation
sont portes dans une liste en Annexe n 03.

-52-

Chapitre III :
Essais in vitro de recherches
de moyens de lutte

Matriels et Mthodes

Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte

I/ Lutte chimique contre Lisolat F13 de F.o.a. :


Les mthodes du laboratoire qui permettent destimer les proprits dun produit in vitro
sont nombreuses mais reposent toutes sur le mme principe, celui de confronter le fongicide et
le champignon sur un support artificiel (Henni, 1987).
1.1/ Les fongicides tests :
Une vingtaine de substances antifongiques ont t testes vis--vis lisolat F13 de F.o.a.,
synthtises par diffrents Laboratoires de Chimie Organique. Le tableau n 06, montre la
provenance de chaque substance.
Tableau n 06 : Les substances fongicides testes contre lisolat F13 de F.o.a.

Substance

Substance

Laboratoire

Solubilit

O1

Laboratoire

Actone

Am6

Hydrosoluble

P2

de Chimie

Actone

Am7

Hydrosoluble

P3

Universit

Actone

ZS 49

Actone

M4

ES-Snia

Actone

ZS 50

Actone

M5

Oran

Actone

ZS 54

Hydrosoluble

ZS 55

Fongicide

Am1

Fongicide

Am2

Laboratoire

Hydrosoluble

ZS 60

Am3

de Chimie

Hydrosoluble

ZS 61

Am4

Universit de

Hydrosoluble

ZS 65

Am5

Sada

Hydrosoluble

ZS 66

Laboratoire

Laboratoire
de Chimie
Universit
ES-Snia
Oran

Solubilit

Actone
Actone
Actone
Actone
Actone
Actone

1.2/ Prparation des solutions de fongicides :


Chaque produit tester est soluble dans un solvant organique qui lui convient, il peut tre
lactone, le mthanol, le chloroforme, etc. Dans nos essais seul lactone est utilis, dautres
produits sont hydrosolubles (Tableau ci-dessus).

-54-

Matriels et Mthodes

Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte

Dans un premier temps, une solution mre de chaque produit est prpare une
concentration de 105 ppm (partie par million), puis des dilutions seront effectues avec un
milieu liquide base de pomme de terre, pour arriver chaque fois la concentration voulue
(50, 100, 200 et 400 ppm). Le 0 ppm comme tant le tmoin, ne contient que le solvant
incorpor dans le milieu PDA.
Les diffrentes dilutions sont obtenues en respectant la loi suivante :
C1 V1 = C2 V2

C1 : Concentration de la solution mre

V1 : Volume pris de la solution mre

C2 : Concentration prparer

V2 : Volume final voulu du milieu PDA

1.3/ Test sur milieu solide :


Des implants mycliens de 6 mm de diamtre sont prlevs de la priphrie dune
prculture de 7 jours de lisolat F13 de F.o.a., et sont dposs au centre de la boite de Ptri
contenant le milieu PDA avec les 04 concentrations pour chaque substance active tudier
(Braffio et al., 2004).
Pour chaque concentration et chaque produit, deux rptitions sont ralises. Lincubation
a t faite 22 C sous photopriode de 12 heures pendant 7 jours et la lecture se fait
quotidiennement. La mesure de la croissance radiale de la colonie est faite selon la mthode des
deux diamtres perpendiculaires (Figure n 15) (Blaise et al., 2001).
Pour chaque dose, on dtermine le pourcentage dinhibition qui se calcule selon la formule
suivante :

Taux dinhibition (%) =

(D tmoin D test) / D tmoin x 100

D : Diamtre

-55-

Matriels et Mthodes

Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte

Boite de Ptri
contenant le
milieu de culture

Implants du
myclium

Figure n 15 : Schma de la mthode de mesure du diamtre dans les deux sens


perpendiculaires (Blaise et al., 2001).

-56-

Matriels et Mthodes

Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte

II/ Lutte biologique :


Paralllement aux travaux effectus sur leffet in vitro de 20 fongicides sur la croissance de
F.o.a., et dans le but dessayer de mettre au point une lutte biologique, un agent antagoniste
actif sur divers agents pathognes est utilis : le Trichoderma harzianum (Elad et al., 1982 ;
Daami-Remadi et El Mahjoub, 2001).
2.1/ Provenance de lagent antagoniste test :
Pour lutter contre F.o.a., trois souches de Trichoderma harzianum sont testes T1, T2 et
TM. Les deux premires souches proviennent dun isolement partir de la rhizosphre
saharienne (Tableau n 07). La troisime souche (TM) nous a t fournie par Mme BENFRIHA,
Matre assistante, au Laboratoire de Phytopathologie, lUniversit de Mascara.
Les cultures utilises pour ces essais, sont ges de 10 jours.

Tableau n 07 : Provenance des souches T1 et T2 de Trichoderma harzianum.


Date

Code de la

dchantillonnage

souche

03.07.2008

T1

03.07.2008

T2

Site de

Partie

prlvement

disolement

Bchar

Haya

Sol

Bchar

Mat

Sol

Wilaya

Aprs lisolement des souches de Trichoderma (T1 et T2) partir du sol par la technique des
dilutions (similaire celle cite pour lisolement de F.o.a.), les caractres macroscopiques et
microscopiques sont tudis par la culture de cet agent antagoniste sur le milieu Davet (Annexe
01).
2.2/ Test de lactivit antagoniste in vitro :
Lactivit antagoniste in vitro de Trichoderma harzianum contre les isolats de F.o.a., a t
tudie selon deux mthodes :

-57-

Matriels et Mthodes

Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte

2.2.1/ Confrontation par contact direct sur milieu de culture :


Cette technique consiste placer, dans la mme boite de Ptri contenant le milieu PDA et
dune faon diamtralement oppose, deux pastilles gloses de 6 mm de diamtre, lune
portant le Trichoderma et lautre le F.o.a., une distance de 3 cm lune de lautre
(Figure n 16). Les repiquages sont effectus en mme temps (Benhamou et Chet, 1996).
Le tmoin est constitu par un repiquage du pathogne seul.
Lincubation se fait 25 C pendant 5 jours lobscurit. Des notations concernant
linhibition de la croissance myclienne des colonies de F.o.a. et leur envahissement par le
myclium de Trichoderma, sont effectues quotidiennement.
2.2.2/ Activit des filtrats de culture :
Une bouture myclienne prleve dans la zone de croissance dune culture de lantagoniste
est dpose dans une fiole contenant 100 ml de milieu pomme de terre liquide. Ces fioles sont
mises incuber pendant 3 semaines lobscurit 25 C (Catain et Peterson, 1966 ; Wilson et
Porter 1957 ; Henni, 1998).
Aprs ce dlai, le myclium est spar du milieu de culture par centrifugation
4000 t / min pendant 30 minutes, puis le surnageant est filtr sur filtre millipore de 0.22 . Ces
filtrats sont ensuite conservs au conglateur.
Un (01) ml du filtrat de culture est ensuite incorpor avec 10 ml du milieu PDA maintenu
en surfusion (40 45 C) dans chaque boite de Ptri. Des pastilles gloses, de chaque isolat,
de lagent pathogne g de 5 jours, sont places dans le centre de la boite

(Figure n 17).

Le tmoin est constitu par un filtrat de culture de lagent antagoniste dnatur au bainmarie pendant 5 minutes.
Ainsi,

le pourcentage dinhibition (%) est calcul (dans les deux cas de

confrontation) comme suit :


(%) dinhibition = (D Tmoin D Test) / D Tmoin x 100
D tmoin : distance radiale maximale de la croissance du champignon.
D Test : distance radiale sur une ligne en direction de lantagoniste.
-58-

Matriels et Mthodes

Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte

F.o.a.

T. harzianum
3 cm

Milieu PDA

Figure n 16 : Confrontation de F.o.a. avec T. harzianum par contact direct sur milieu de
culture.

Implant de F.o.a.

Milieu PDA contenant le


filtrat de culture de T.
harzianuum

Figure n 17 : Confrontation de F.o.a. avec T. harzianum par lactivit des filtrats de culture.

-59-

Troisime Partie :
Rsultats et Discussions

Rsultats

Rsultats

I/ Isolement du champignon :
Les isolements partir des rachis dun palmier infect ou de la rhizosphre, rvlent un
dveloppement des souches fongiques qui prsentent des colonies duveteuses cotonneuses ou
ras muqueuses, de couleur

rose saumon, rose orang ou violet pale. Lobservation

microscopique de tous les isolats, rvle la prsence de trois types de spores (microconidies,
macroconidies et chlamydospores), ce qui confirme que les isolats appartiennent au genre
Fusarium.

II/ Identification des souches de F.o.a. :

2.1/ Aspect morphologique :


Aprs quelques jours dincubation, seuls des morphotypes mycliens ont t rencontrs.
Les colonies sont gnralement caractrises par les morphotypes suivants : duveteux,
cotonneux ou ras muqueux (Tableau n 08 et Figure n 18).

Le morphotype cotonneux, prsente un myclium arien trs abondant, pais et dense avec
une couleur blanche ros. Dans ce type, les microconidies sont produites tardivement
(Figure n 18 -a-).

Le morphotype duveteux, prsente un myclium arien assez court mais dense, portant de
nombreuses microconidies. Les macroconidies et les chlamydospores sont formes tardivement
(Figure n 18 -b-).
Le morphotype ras et muqueux, est caractris par labsence du myclium arien, ce qui
donne la culture un aspect muqueux comme si elle tait envahie par des bactries. Les
microconidies sont trs abondantes, les macroconidies sont rares et les chlamydospores sont
tardives mais abondantes (Figure n 18 -c-).

-62-

Rsultats
Tableau n 08 : Diffrents morphotypes rencontrs chez F.o.a. et Fusarium de la
rhizosphre du palmier dattier.

Souches
isoles

Partie
disolement

Site de
prlvement

Morphotype

F1

Rachis

Adrar

ras muqueux
(type sauvage)

Rose violet

F.o.a.

F 1

Rhizosphre

Adrar

cotonneux

Blanc ros

Fusarium sp.

F 2

Rhizosphre

Adrar

duveteux

Rose ple

Fusarium sp.

F 3

Rhizosphre

Adrar

cotonneux

Blanc ros

Fusarium sp.

F4

Rachis

Bchar

ras muqueux

Rose orang

F.o.a.

F 4

Rhizosphre

Adrar

cotonneux

Blanc

Fusarium sp.

F 5

Rhizosphre

Bchar

duveteux

Blanc ros

Fusarium sp.

F6

Rachis

Bchar

duveteux

Rouge carmin

Fusarium sp.

F7

Rachis

Bchar

Rose orang

F.o.a.

F8

Rachis

Bchar

ras muqueux
(type sauvage)
ras muqueux
(type sauvage)

Rose orang

F.o.a.

Rouge carmin

Fusarium sp.

Rouge carmin

Fusarium sp.

Rose clair

Fusarium sp.

Bchar

Pigmentation Identification

F 8

Rhizosphre

F 8

Rhizosphre

F 9

Rhizosphre

Bchar

ras

F 10

Rhizosphre

Bchar

cotonneux

Blanc

Fusarium sp.

F 11

Rhizosphre

Bchar

ras

Orange

Fusarium sp.

F 12

Rhizosphre

Bchar

ras muqueux
(type sauvage)

Violet ple

F 12

Rhizosphre

Bchar

ras

Orange

F.o.a.
(saprophyte)
Fusarium sp.

F 13

Rachis

Adrar

ras muqueux
(type sauvage)

Rose orang

F.o.a.

F 14

Rhizosphre

Bchar

ras muqueux

Blanc

Fusarium sp.

F 15

Rachis

Ghardaa

ras

blanc

Fusarium sp.

duveteux
Bchar

duveteux

-63-

Rsultats

Figure n 18 -a- :
Morphotype cotonneux

Figure n 18 -b- :
Morphotype duveteux

Figure n 18 -c- :
Morphotype ras muqueux

Figure n 18 : Reprsentations des diffrents morphotypes rencontrs.

-64-

Rsultats

Lisolat F1

Lisolat F4

Lisolat F7

Lisolat F8

Lisolat F12

Lisolat F13

Figure n 19 : Reprsentation des diffrents aspects morphologiques des isolats de F.o.a.

-65-

Rsultats

2.2/ Caractres microscopiques :


Le champignon qui sort des tissus de palmier prsente un myclium fin blanc, cloisonn. Il
produit trois types de spores caractristiques du genre Fusarium (Figure n 20) :
* Les microconidies, sont nombreuses, le plus souvent unicellulaires et quelques fois
bicellulaires, regroupes en fausses ttes. Elles sont produites par des phialides courtes en
forme de bouteille implantes perpendiculairement sur le myclium (Figure n 20 -a-).
* Les macroconidies, sont courbes, cloisonnes de 2 3 cloisons, rarement plus, (Figure
n 20 -b-). Elles ne sont produites en quantit par le F.o.a. que lors du premier isolement en
prsence de palmier. Ds que le champignon est repiqu, il perd sa capacit produire des
macroconidies.
* Les chlamydospores, produites soit partir du myclium, soit partir des macroconidies.
Elles

sont

lisses

et

produites

en

grande

quantit

dans

les

cultures

ges

(Figure n 20 -c-).
Suivant ces caractristiques, seules les souches sauvages isoles du rachis (F1-F4-F7-F8F13) et une souche saprophyte du sol (F12) sont des Fusarium oxysporum (Figure n 19), les
autres isolats appartenaient dautres espces du genre Fusarium.
2.3/ Effet des diffrents milieux de culture :
Sous les conditions de culture utilises, trois critres morphologiques sont pris en
considration (laspect du myclium, sa pigmentation et la vitesse de croissance de la colonie).
Le myclium de tous les isolats (F1-F4-F7-F8 et F13), sest trs bien dvelopp sur le
milieu PDA, avec un aspect ras muqueux et une pigmentation naturelle (Figure n 21),
contrairement aux deux autres milieux (Czapeck et Mathur), qui permettent une bonne
croissance mais la colonie a une faible pigmentation : blanchtre sur le milieu Czapeck (Figure
n 22) et presque transparente sur le milieu Mathur (Figure n 23).
La vitesse de croissance de tous les isolats est presque similaire sur les trois milieux de
culture. Le Tableau n 10 et la Figure n 24, illustrent les rsultats du diamtre moyen, calcul
aprs 10 jours dincubation et dune manire quotidienne, selon la mthode des deux sens
perpendiculaires.

-66-

Rsultats

-a1
2

5 m

-b-

6,8 m

-c-

6,8 m

1 : microconidies en fausse tte


2 : monophialide courte
3 : myclium
4 : macroconidie
5 : chlamydospore 6 : microconidie
Figure n 20 : Observations au microscope optique des trois types de spores de F.o.a .
au grossissement (X 400).

-67-

Rsultats

F1

F4

F13
F7

F8
F8

F7

Figure n 21 : Aspect du myclium des cinq isolats sur le milieu PDA.

F4

F1

F13
F7

F8

Figure n 22 : Aspect du myclium des cinq isolats sur le milieu Czapeck.


F8

F7

F1

F4

F13
F8

F7

Figure n 23 : Aspect du myclium des cinq isolats sur le milieu Mathur.


-68-

Rsultats

Tableau n 10 : Diamtre moyen (cm) des cinq isolas sur les trois milieux de culture.
Milieux
PDA

Czapeck

Mathur

F1

4,995

3,958

4,79

F4

4,878

5,063

4,882

F7

4,998

4,699

4,965

F8

4,877

4,783

5,015

F 13

5,413

5,211

4,911

Souches

Diamtre de la colonie (cm)

6
5
4

F1

F4

F7

F8
F 13

0
PDA

Czapeck

Mathur

Milieux de culture

Figure n 24 : Reprsentation graphique de linfluence des diffrents milieux de culture sur la


croissance des isolats de F.o.a.

-69-

Rsultats

III/ Etude physiologique de F.o.a. :


3.1/ Influence de la temprature :
Aprs 07 jours dincubation, on remarque que la temprature optimale pour la croissance
de notre souche F13 est de 28 C avec une colonie de 5,12 cm de diamtre, au-dessous et audessus de celle-ci, la croissance myclienne se voit ralentir, cest ce qui est rapport sur la
Figure n 25.
3.2/ Influence des sources carbones :
Les rsultats reprsents par la Figure n 26, montrent que le maltose et le glucose
permettent une meilleure croissance pour notre souche F13.
Lamidon constitue une source de carbone non ngligeable, par contre une croissance
moyenne de notre souche F13 est remarque chez le tmoin avec le saccharose comme source
de carbone.
3.3/ Influence des sources azotes :
Les rsultats reprsents par la Figure n 27, montrent que lutilisation des nitrates de
potassium donne une trs bonne croissance. Lasparagine est la deuxime source permettant
une bonne croissance. En revanche, le sulfate dammonium, inhibe fortement la croissance de
notre souche F13.
3.3/ Influence de la lumire :
La croissance de notre souche F13 en obscurit continue est maximale. Elle est bonne sous
photopriode de 12 heures, et moyenne sous clairage continu. Ceci est confirm par la Figure
n 28.
3.4/ Influence du pH du milieu :
On remarque quau pH extrme (pH = 4), notre souche F13 sest dveloppe mais trs
faiblement. Loptimum se situe pH 5 et une gamme allant de 5,5 jusqu 8 permet aussi une
bonne croissance (Figure n 29).

-70-

Rsultats

Diamtre (cm)
6

Diamtre (cm)
4.7

5
4.6

4.5

3
2

4.4

4.3

4.2
15 C

22 C

28 C

35 C

Figure n 25 : Reprsentation graphique de

Glucose

Maltose

Amidon

Figure n 26 : Reprsentation graphique de

linfluence des tempratures sur la

linfluence de la source de carbone sur la

croissance de lisolat F13.

croissance de lisolat F13.

Diamtre (cm)

Diamtre (cm)

0
Asparagine NH4SO4

KNO3

Figure n 27 : Reprsentation graphique de

Ec. Con.

Ob. Con.

Photo. 12H

Figure n 28 : Reprsentation graphique de

linfluence de la source dazote sur la

linfluence dclairage sur la croissance de

croissance de lisolat F13.

lisolat F13.

-71-

Rsultats

Diamtre (cm)
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
pH = 4

pH = 5

pH = 7

pH = 8

Figure n 29 : Reprsentation graphique de linfluence du pH du milieu sur la croissance de


lisolat F13.

Diamtre (cm)

Figure n 30 : Reprsentation graphique de linfluence du taux dhumidit sur la croissance


de lisolat F13.

-72-

Rsultats

3.5 Influence du taux dhumidit :


La croissance myclienne est meilleure avec un taux dhumidit de 80 %, les taux de 75 %
et 50 % permettent eux aussi une bonne croissance du champignon.
La croissance de notre souche F13 semble moyenne aux taux trs levs : 95 % et 100 %
et est sensible aux taux trs bas : 14 %. Cest ce qui confirme la Figure n 30.

IV/ Estimation du pouvoir pathogne :


Nous avons dbut les notations des symptmes, 01 mois aprs linoculation Ces notations
consistent relever le nombre de plantule mortes, provoqu par chaque souche et est exprim
en pourcentage de mortalit (Tableau n 11).
Les plantules infectes, prsentent diffrents symptmes daltrations, tel quun
jaunissement suivi dun desschement puis un dprissement des feuilles jusqu la mort totale
de la plante. Ceci est rapport sur la Figure n 31.
Pour pouvoir confirmer les symptmes constats du pouvoir pathogne de chaque souche,
le risolement du champignon, a rvl sa dans le sol, les racines et la tige de chaque plantule

Tableau n 11 : Pourcentage de mortalit des plantules de palmier dattier.

Souches de F.o.a.

Nombre de
plantules atteintes

Pourcentage de
mortalit (%)

F1

80%

F4

40%

F7

40%

F8

80%

F12

20%

F13

60%

-73-

Rsultats

A
C
E

F
D

A : Plantule de palmier dattier saine (tmoin) B : Jaunissement


C et D : Desschement
E : Dprissement
F : Mort totale de la plantule

Figure n 31 : Diffrents symptmes nots chez les plantules de palmier dattier.

-74-

Rsultats

V/ Dosage des protines des isolats de F.o.a. :


Aprs la lecture au spectrophotomtre la longueur dondes = 595 nm, les rsultats de la
densit optique de chaque dilution sont reprsents sur le Tableau n 12. Ils seront par la suite
reports sur la Figure n 32 qui constitue la courbe dtalonnage D.O. = f (concentrations).
La concentration en protine dans chaque chantillon dextrait enzymatique, est calcule
par lquation de la droite de la courbe dtalonnage (Tableau n 13).

VI/ lectrophorse :
Le gel de polyacrylamide a servi pour ltude isozymique des isolats de F.o.a. (F1-F4-F7F8-F12 et F13), rcolts des diffrentes rgions du Sahara Algrien. Trois systmes
enzymatiques ont t tudis.
6.1/ Estrases :
Ce systme rvle un profil lectrophortique de 04 bandes chez tous les isolats de F.o.a.
Les bandes sont parfaitement visibles, dune intensit variable et, dune couleur rouge brique
ou marron (Figure n 33).
6.2/ Phosphatases :
Le profil lectrophortique des phosphatases des isolats de F.o.a. rvle la prsence dune
seule bande lisible et visible dune intensit variable et dune couleur marron (Figure n 34).
6.3/ Peroxydases :
La rvlation de ce systme est ngative. Le profil lectrophortique na prsent aucune
bande visible pour les isolats de F.o.a. (Figure n 35).
6.4/ Protines totales :
La rvlation des bandes protiques sur le gel de polyacrylamide en prsence du SDS,
montre la prsence de plusieurs bandes sur un profil lectrophortique presque similaires pour
tous les isolats de F.o.a. (Figure n 36).

-75-

Rsultats
Tableau n 12 : Densit optique (D.O.) de chaque dilution.

1/2

1/3

1/4

1/5

1/6

1/7

1/8

1/9

1/10

D.O.

0,869

0,840

0,824

0,782

0,776

0,734

0,719

0,701

0,689

Dilutions

1/11

1/12

1/13

1/14

1/15

1/16

1/17

1/18

1/19

D.O.

0,666

0,660

0,631

0,578

0,573

0,560

0,552

0,532

0519

D.O.

Dilutions

Concentration de SBA (g / ml)

Figure n 32 : Courbe dtalonnage.

Tableau n 13 : Densit optique (D.O.) et concentration en protines dans chaque extrait


enzymatique des isolats de F.o.a.

Souches

F1

F4

F7

F8

F12

F13

D.O.

0,312

0,277

0,332

0,204

0,351

0,281

Concentration en
protines (g/ml)

14,65

12,93

15,63

9,35

16,56

13,13

-76-

Rsultats

F13

F12

F8

F7

F4

F13

F1

F12 F8

F7

F4

F1

(-)

(+)

Figure n 33 : Profil lectrophortique des estrases chez les isolats de F.o.a.

F1

F4

F7

F8

F12

F1

F13

F4

F7

F8

F12 F13

(-)

(+)

Figure n 34 : Profil lectrophortique des phosphatases chez les isolats de F.o.a.

-77-

Rsultats

F1

F4

F7

F8 F12 F13

Figure n 35 : Profil lectrophortique des peroxydases chez les isolats de F.o.a.

F1

F4

F7

F8

F12 F13

F1

F4

F7

F8

F12

F13

(-)

(+)

Figure n 36 : Profil lectrophortique des protines totales chez les isolats de F.o.a.

-78-

Rsultats

VII/ Lutte chimique contre lisolat F13 de F.o.a. :


Les 20 fongicides tests in vitro contre F.o.a., sont rpartis en trois sries selon leurs
natures chimiques. Ce test rvle lefficacit de certaines de ces substances fongicides,
dtermine par le calcul du diamtre moyen de la colonie, pendant les 10 jours dincubation
(Tableaux n 14-16-18) ainsi que par le calcul du taux dinhibition de chaque produit et
chaque concentration teste (Tableaux n 15-17-19).
Les rsultats obtenus sont illustrs par les Figures n 38, 39 et 40. La Figure n 37 est un
exemple de leffet dune substance fongicide (P2) sur la croissance myclienne de lisolat F13
de F.o.a.

0 ppm

50 ppm

200 ppm

100 ppm

400 ppm

Figure n 37 : Effet de la substance fongicide (P2) diffrentes concentrations sur la


croissance myclienne de lisolat F13de F.o.a.
-79-

Rsultats
Tableau n 14 : Diamtre moyen (cm) de lisolat F13 confront avec la premire srie des
substances fongicides.
O1

P2

P3

M4

M5

0 ppm

3,95

4,65

5,91

4,35

3,51

50 ppm

3,96

4,63

5,43

3,26

3,38

100 ppm

4,48

3,66

4,65

5,51

3,6

200 ppm

3,43

2,68

4,01

5,31

3,28

400 ppm

3,48

2,53

3,81

4,7

2,75

Tableau n 15 : Taux dinhibition (%) de la premire srie des substances fongicides contre
lisolat F13.

P2

P3

M4

M5

50 ppm

0,43

8,12

25,1

3,7

100 ppm

21,29

21,3

200 ppm

13,16

42,36

32,1

6,55

400 ppm

11,89

45,59

35,5

21,7

Diamtre moyen de la colonie (cm)

O1

6
5
0 ppm

50 ppm
3

100 ppm

200 ppm

400 ppm

0
O1

P2

P3

M4

M5

Figure n 38 : Reprsentation graphique du diamtre moyen (cm) de lisolat F13 confront


avec la premire srie des substances fongicides.

-80-

Rsultats
Tableau n 16 : Diamtre moyen (cm) de lisolat F13 confront avec la deuxime srie des
substances fongicides.

Am1

Am2

Am3

Am4

Am5

Am6

Am7

0 ppm

4,93

4,28

2,11

4,08

3,13

3,43

3,26

50 ppm

4,38

3,61

2,3

6,03

2,08

1,23

3,18

100 ppm

4,83

2,33

2,3

5,11

2,16

1,01

3,36

200 ppm

4,88

2,63

2,26

5,81

2,3

0,76

3,41

400 ppm

4,86

2,28

2,26

4,01

2,78

1,48

4,36

Tableau n 17 : Taux dinhibition (%) de la deuxime srie des substances fongicides contre
lisolat F13.

Am2

Am3

Am4

Am5

Am6

Am7

50 ppm

11,15

15,65

33,5

64,13

3,04

100 ppm

2,02

45,65

31

70,55

200 ppm

1,01

38,55

26,5

77,84

400 ppm

1,41

46,72

1,71

11,2

56,84

Diamtre moyen de la colonie (cm)

Am1

7
6
5
0 ppm
4

50 ppm

100 ppm

200 ppm
400 ppm

1
0
Am1

Am2

Am3

Am4

Am5

Am6

Am7

Figure n 39 : Reprsentation graphique du diamtre moyen (cm) de lisolat F13 confront


avec la deuxime srie des substances fongicides.

-81-

Rsultats
Tableau n 18 : Diamtre moyen (cm) de lisolat F13 confront avec la troisime srie des
substances fongicides.

ZS49

ZS50

ZS54

ZS55

ZS 60

ZS 61

ZS65

ZS 66

0 ppm

3,46

3,8

3,5

2,98

4,16

4,18

3,9

4,13

50 ppm

2,81

3,03

2,95

3,68

3,05

2,8

2,78

3,25

100 ppm

2,73

2,56

2,3

2,7

2,88

2,65

2,61

3,38

20 ppm

2,95

2,46

1,55

3,11

2,48

2,48

1,9

3,68

400 ppm

2,8

2,7

1,11

4,06

2,16

3,15

1,95

4,46

Tableau n 19 : Taux dinhibition (%) de la troisime srie des substances fongicides contre
lisolat F13.

ZS 50

ZS 54

ZS 55

ZS 60

ZS 61

ZS 65

ZS 66

50 ppm

18,78

20,26

15,7

27

31,87

28,71

21,3

100 ppm

21,09

32,63

34,3

9,39

31,1

35,52

33,07

18,15

200 ppm

14,73

35,26

55,7

40,7

39,65

51,28

10,89

400 ppm

19,07

28,94

68,3

48,3

23,35

50

Diamtre moyen de la colonie (cm)

ZS 49

4.5
4
3.5
0 ppm

50 ppm

2.5

100 ppm

2
1.5

20 ppm

400 ppm

0.5
0
ZS49 ZS50 ZS54 ZS55 ZS 60 ZS 61 ZS65 ZS 66

Figure n 40 : Reprsentation graphique du diamtre moyen (cm) de lisolat F13 confront


avec la troisime srie des substances fongicides.

-82-

Rsultats

XI/ Lutte biologique contre les isolats de F.o.a. :


8.1/ Lagent antagoniste :
La culture des souches de Trichoderma harzianum sur le milieu Davet rvle la prsence
dun myclium trs clair tal sur le milieu glos, avec des arborescences termines par des
formations sphriques de couleur verte irrgulires : ttes (Figure n 41).
Lobservation microscopique de Trichoderma harzianum montre que lorganisation des
structures conidiognes est telle que des ramifications qui se rpartissent perpendiculairement
et de faon oppose de part et dautre dun axe principal qui est le conidiophore (Figure n 42),
les spores paroi lisse, sont de forme ovalaire et de couleur verte.

Figure n 41 : Culture de Trichoderma harzianum sur milieu Davet.

4 m

1
2

1 : spore
2 : phialide
3 : conidiophore
3

Figure n 42 : Observation au microscope optique de Trichoderma harzianum


(G x 400).
-83-

Rsultats

8.2/ Test de lactivit antagoniste de Trichoderma harzianum :

Le repiquage simultan de Trichoderma harzianum et des isolats de F.o.a. (F1-F4-F7-F8


et F13) a montr une croissance plus rapide de lagent antagoniste que celle des isolats de
F.o.a. Au bout de quatre jours dincubation, la boite de Ptri est totalement envahie par
lantagoniste, alors que les isolats de F.o.a. noccupent quune petite surface, ce qui correspond
une inhibition de la croissance myclienne. Le diamtre moyen de la colonie myclienne de
chaque isolat de F.o .a. ainsi que le taux dinhibition pour les deux techniques du test de
lactivit antagoniste (contact direct et action des filtrats de culture), sont mentionns dans les
Tableaux n 20 et 21 et illustrs par les Figures n 43,44, et 45.
Tableau n 20 : Diamtre moyen (cm) des isolats de F.o.a. et le taux dinhibition (%) des
diffrentes souches de Trichoderma par contact direct.
F1

T.H.%

F4

T.H.%

F7

T.H.%

F8

T.H.%

F13

T.H.%

T1

2,7

22,8

1,26

54,2

2,6

16,6

2,38

28,3

2,8

30,9

T2

2,7

22,8

1,52

47,1

2,44

21,8

1,96

40,9

2,62

36,0

Tm

2,62

25,1

2,2

22,5

2,16

30,7

2,4

27,7

2,82

31,2

Tmoin

3,5

2,84

3,12

3,32

4,12

Diamtre moyen de la
colonie (cm)
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

T1
T2
Tm
Tmoin

F1

F4

F7

F8

F13

Figure n 43 : Diamtre moyen (cm) des isolats de F.o.a. en contact direct avec les
diffrentes souches de Trichoderma pendant 4 jours dincubation.

-84-

Rsultats
Tableau n 21 : Diamtre moyen (cm) des isolats de F.o.a. et le taux dinhibition (%) des
diffrentes souches de Trichoderma par action des filtrats de culture.
F1

T.H.%

F4

T.H.%

F7

T.H.%

F8

T.H.%

F13

T.H.%

T1

2,43

42,9

2,98

40,0

2,65

45,3

2,66

32,1

2,92

39,9

T2

2,43

42,9

2,31

53,4

2,15

35,6

2,08

47,0

2,45

49,6

Tm

1,26

70,2

1,63

67,1

1,5

55,0

1,4

64,3

1,8

63,0

Tmoin

4,26

4,97

3,33

Diamtre moyen de la
colonie (cm)
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
F1
F4

3,93

4,86

T1
T2
Tm
Tmoin

F7

F8

F13

Figure n 44 : Diamtre moyen (cm) des isolats de F.o.a. sous laction des filtrats de
culture des diffrentes souches de Trichoderma pendant 4 jours dincubation.

T1

T.H. (%)

T2

Tm

60

80

T.H. (%)

70
50

60

40

50

30

40
30

20

20

10

10

0
F1

F4

F7

Contact Direct

F8

F13

F1

F4

F7

F8

F13

Action des Filtrats de Culture

Figure n 45 : Taux dinhibition (%) de Trichoderma harzianum contre les isolats de


F.o.a. pour les deux techniques de confrontations.
-85-

Rsultats
Le test de lactivit antagoniste de Trichoderma harzianum contre les isolats de F.o.a., que
se soit par contact direct sur milieu de culture ou par laction des filtrats de culture, rvle un
recouvrement des isolats de F.o.a. par le myclium de lagent antagoniste sur toute la surface
de la boite de Ptri, avec lexistence de fructification de ce dernier sur les isolats de F.o.a. et la
scrtion de substance jaune dans la zone de contact (Figure n 46 et 47).

1 Jour dincubation

4 Jour dincubation

Tmoin

Croissance rapide de lagent

Envahissement total de la boite de

Croissance de lagent pathogne

antagoniste (pastille droite) ds le

Ptri par lagent antagoniste avec

seul (tmoin) en absence de lagent

premier jour dincubation par

la scrtion de la substance jaune.

antagoniste.

rapport lagent pathogne


(pastille gauche).

Figure n 46 : Contact direct sur milieu de culture entre Trichoderma harzianum et F.o.a.

-86-

Rsultats

1 Jour dincubation

4 Jour dincubation

Tmoin

Croissance de lagent antagoniste

Envahissement total par lagent

Croissance de lagent pathogne

partir du filtrat de culture et

antagoniste et production de

seul (tmoin) en absence du filtrat

envahissement de la boite de Ptri

fructifications sur lagent

de culture de lagent antagoniste.

par rapport lagent pathogne

pathogne (pastille du centre).

(pastille du centre).

Figure n 47 : Action des filtrats de culture de Trichoderma harzianum sur la croissance de


F.o.a.

-87-

Discussions

Discussions

Notre travail de recherche sinscrit dans le cadre de ltude de la caractrisation


morphologique et physiologique de lespce Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, lagent
causal de la maladie du Bayoud (fusariose vasculaire) du palmier dattier, avec comme
objectif : essayer un moyen de lutte in vitro, par des substances fongicides, dun ct et par
lutilisation de lagent antagoniste le Trichoderma harzianum, dun autre ct.
1/ Ltude morphologique de nos isolats, a fait apparatre trois morphotypes diffrents : laspect
cotonneux, laspect duveteux et laspect ras muqueux.
Cette diversit morphologique du genre Fusarium obtenue est identique celle observe dans
les travaux de (Ouinten, 1996) sur la mme espce Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, ainsi
que ceux mens par (Guessas, 1993 ; Henni, 1998 et Hamini, 2002) sur Fusarium oxysporum
f.sp. lycopersici.
2/ Ltude microscopique des souches nous a dmontr que le myclium est cloisonn avec
lapparition des trois sortes de spores ; les microconidies, les macroconidies et les
chlamydospores.
Ces rsultats sont concordants avec ceux auxquels ont abouti (Armstrong et Armstrong, 1981 ;
Henni, 1998; Toshiaki et Takashi, 2004).
3/ Sagissant de ltude physiologique,
3.1/ Le test dinfluence de la source carbone sur la croissance du Fusarium oxysporum
f.sp. albedinis fait apparatre une prfrence pour le glucose et le maltose. Une bonne
croissance est enregistre sur le milieu contenant lamidon comme source de carbone, et ce,
linstar des rsultats obtenus dans les diffrents travaux mens auparavant par (Lopez et Fergus,
1965; Bounaga, 1970; Henni, 1998 et Hamini, 2002).
3.2/ Linfluence de la source azote sur la croissance du Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis nous a montr une meilleure croissance sur des milieux contenant les nitrates de
sodium et les nitrates de potassium, confirmant ainsi les conclusions des diffrents auteurs qui
estiment que la plupart des Fusarium pathognes prfrent lazote organique que lazote
minral (Wolf, 1966 ; Lopez et Fergus, 1965 ; Hamini, 2002).

-89-

Discussions

Par ailleurs, Une croissance inhibe de notre souche a t remarque sur le milieu
contenant le sulfate dammonium comme seule source azote. Les mmes constatations ont t
faites par (Guessas, 1993 ; Ameziane, 1997).
4/ Ltude du pouvoir pathogne, nous a permis de constater que tous les isolats du Fusarium
oxysporum f.sp. albedinis, issus du rachis, taient pathognes (aprs une priode de 3 mois et
plus ou moins quelques semaines), sur les plantules du palmier dattier obtenues aprs la
germination des noyaux de dattes, avec un degr de pathognicit variable. Nos observations
concordent avec celles obtenues par (Ouinten, 1996).

Parmi les 05 plantules inocules, nous avons enregistr 04 plantules dtruites pour chacun des
isolats F1 et F8, avec un pourcentage de mortalit de 80 % et 03 plantules pour lisolat F13 o
le taux de mortalit a atteint 60 %.
Chez les isolats F4 et F7, le taux de mortalit enregistr a atteint 40 %, soit 02 plantules sur la
totalit.
Par ailleurs, nous avons constat que, seul lisolat F12, issu de la rhizosphre dgage le
nombre le plus faible des plantules atteintes (01 seule), soit un taux de mortalit de 20 %.
5/ Ltude du polymorphisme isoenzymatique, par la rvlation des estrases et des
phosphatases acides, ainsi que les protines totales de nos isolats du Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis, nous a montr une similarit des profils lectrophortiques entre les isolats pour
chaque systme rvl. Le mme constat a t fait par (Bounaga, 1985).
Nous avons, en ce qui nous concerne enregistr une absence totale de bandes pour la rvlation
des peroxydases, chez tous les isolats de F.o.a., peut tre que le ractif de rvlation tait
prim.

A la lumire des rsultats obtenus dans les tudes morphologiques, microscopiques et


physiologiques (cites prcdemment), nous avons lanc nos essais des luttes chimique et
biologique contre le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, pendant plusieurs mois pour enfin,
aboutir aux constats suivants :

-90-

Discussions
Dans la premire srie des substances fongicides, nous navons pas pu calculer le taux
dinhibition pour le produit O1 ( 50 et 100 ppm), le produit M4 ( 100, 200 et 400 ppm) et le
produit M5 ( 100 ppm) ; puisque le diamtre de lisolat F13 dans ces concentrations (le test),
dpasse celui du tmoin (0 ppm).
Le taux dinhibition de la croissance myclienne de lisolat F13, calcul pour cette srie de
substances fongicides, varie considrablement de 0,43% (le taux le plus faible) 45,59 % (le
taux le plus lev).
Les meilleurs pourcentages dinhibition sont obtenus avec le produit P2 (42,36 % 200 ppm et
45,59 % 400 ppm) et le produit P3 (32,1 % 200 ppm et 35,5 % 400 ppm). Cela implique
que la CMI50 de ces deux produits (P2 et P3), dpasse la concentration 400 ppm.
Dans la deuxime srie des substances fongicides, nous avons constat quil existe une
diffrence dans lefficacit entre chaque produit test.
En premier lieu,
les produits Am3 - Am4 et Am7, ne montrent aucune inhibition de lisolat F13 ;
autrement dit, ces 03 produits nont aucun effet sur la croissance myclienne du champignon.
Le produit Am1, quant lui, prsente un taux trs faible de 11,15 % ( 50 ppm), qui
devient ngligeable dans les concentrations qui suivent (2,02 % 100 ppm, 1,01 200 ppm et
1,41 400 ppm).
En second lieu, le produit Am5 prsente une dgradation du pourcentage dinhibition, o
lefficacit commence avec un pourcentage de 33,5 % 50 ppm, puis dcroit 31% 100 ppm
et chute enfin 11,2 % 400 ppm.

En dernier lieu, et concernant les 02 produits restants (Am2 et Am6), nous avons pu enregistrer
pour le premier, un taux dinhibition relativement lev 46,72 % 400 ppm par contre, le
second a dgag le taux le plus lev soit 77,84 % 200 ppm. Dans ce cas, nous pouvons
estimer la CMI50 suprieure 400 ppm, pour le produit Am2 et infrieure 400 ppm pour le
produit Am6.

-91-

Discussions
Dans la troisime srie des substances fongicides, les molcules de triazoles ZS54,
ZS60 et ZS6 testes sur la souche fongique F.o.a. F13, ont exerc un effet inhibiteur sur sa
croissance myclienne une concentration de 400 ppm avec un taux de 68.3 %, 48.3 % et 50 %
respectivement.
Avec les autres substances testes on remarque une inhibition au niveau des
concentrations 50 ppm, 100 ppm et 200 ppm; mais avec la concentration de 400 ppm on note
un rehaussement de la croissance de la souche F13 qui fait penser lhypothse de rsistance
ou de mutation.
Parmi ces substances on citera la ZS50 et ZS61 o la croissance 400 ppm est plus
importante que celle note avec les concentrations 50 ppm et 100 ppm. Elles enregistrent un
taux dinhibition maximal avec les concentrations 100 et 200 ppm, soit 35 % 200 ppm et 39,
6 % 200 ppm respectivement.
Les substances ZS55 et ZS66 nont aucune activit inhibitrice envers la croissance
myclienne de la souche F13 du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
Les rsultats obtenus dans la lutte biologique contre le Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis par lagent antagoniste Trichoderma harzianum, nous a montr une nette rduction du
diamtre moyen de la croissance myclienne, une zone dinhibition ds le 1er jour et un
envahissement total de la boite de Ptri par lagent antagoniste au bout de 4 jours dincubation.

Sagissant de la confrontation directe sur milieu de culture entre le Fusarium oxysporum


f.sp. albedinis et les 03 souches de Trichoderma harzianum, elle nous a dmontr que la
croissance radiale maximale des isolats ne dpasse les 30 mm, ce qui nous a permis
denregistrer linhibition la plus leve avec les taux de :

54 % obtenu par la souche (T1) contre lisolat (F4),

47 % obtenu par la souche (T2) contre le mme isolat,

31 % obtenu par la souche (Tm) contre lisolat (F13).


Quant laction des filtrats de culture de lagent antagoniste Trichoderma harzianum,

contre le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, elle a dmontr un ralentissement de la


croissance myclienne, travers les taux dinhibition suivants :

-92-

Discussions

45 % avec la souche (T1) contre lisolat (F7),

53 % avec la souche (T2) contre lisolat (F4),

70 % avec la souche (Tm) contre lisolat (F1).


Dans ce mme sens, lobservation est faite par (Benhamou et Chet, 1996) en ralisant

une confrontation directe sur milieu de culture entre cet antagoniste et un autre champignon
tellurique, le Pythium ultimum et ce au bout de quatre cinq jour aprs linoculation. DaamiRemadi et El Mahjoub (2001), ont signal, en testant lactivit antagoniste de Trichoderma
harzianum, vis--vis de deux espces de Pythium, que pendant les trois premiers jours, la boite
de Ptri est totalement envahie par Pythium spp. et que Trichoderma harzianum ne commence
exercer son activit antagoniste qu partir du quatrime jour dincubation. Quant Hibar et
al., 2005, qui ont travaill sur le Trichoderma harzianum contre le Fusarium oxysporum f.sp.
radicis-lycopersici, ont trouv que les isolats de lagent pathogne noccupent quune surface
de 20 mm de diamtre, ce qui correspond une inhibition de 65 %. Le tmoin cultiv seul
occupe une surface denviron 50 mm de diamtre.

-93-

Conclusion

Conclusion
Notre travail au Laboratoire de Phytopathologie, Dpartement de Biologie, lUniversit
dOran Es-Snia, a port principalement sur trois axes de recherche :
1- Lidentification et la caractrisation des isolats de Fusarium oxysporum f.sp. albedinis
par une tude morphologique des caractres macroscopiques et microscopiques ainsi
que linfluence de quelques facteurs physico-chimiques sur la croissance myclienne.
2- Ltude du polymorphisme isoenzymatique des isolats de Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis par la rvlation des protines totales et de trois systmes enzymatiques
savoir : les estrases, les phosphatases acides et les peroxydases.
3- Les effets ou rsultats de la lutte contre Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, que ce soit
une lutte chimique par des substances fongicides ou une lutte biologique par lagent
antagoniste Trichoderma harzianum.
Lexprience mene au Laboratoire, pendant plusieurs mois, sous lil vigilant de notre
encadreur, qui fut aussi riche en vnements et leons que frustrante (notamment lanalyse
lectrophortique), nest pas sans insuffler une certaine fiert, dans la mesure o, elle nous
a permis de constater de visu, essentiellement, les oprations suivantes :

Le processus infectieux (le pouvoir pathogne),

Linhibition de la maladie sous leffet des substances fongicides,

Leffet nettement antagoniste de Trichoderma harzianum contre le Fusarium


oxysporum f.sp. albedinis.
Il faut croire et reconnaitre que des actions substantielles, difficiles et voire

douloureuses ont t menes, avec un dvouement constant, en vue de parvenir aux rsultats
souhaits et prsenter un travail qui puisse tre utile aux lecteurs dune manire gnrale et aux
professionnels dune manire particulire.
Les rsultats auraient t meilleurs, neussent t :
-

La vtust du matriel et des quipements,

Lexigut du Laboratoire,

Le travail discontinu (afin de permettre dautres tudiantes et tudiants deffectuer leurs


travaux),

La raret de certains produits chimiques.


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-108-

Annexes

Annexes

Annexe n 01 : Composition des milieux de culture


- Tous les milieux de culture sont striliss lautoclave 120 C pendant 20 minutes sous une
pression de 1 bar.

* Milieu PDA (g/ l) :


Pomme de terre
Glucose
Agar agar
Eau Distille q.s.p.

..
..
..
..

200 g
20 g
20 g
1000 ml

- La pomme de terre est pluche, coupe en petits ds puis cuite dans un litre deau distille.
Aprs cuisson, le filtrat est rcupr, ajust 1000 ml puis ajuster le pH 5,5.

* Milieu Czapek (g/ l):


Saccharose
KH2PO4
KCl
Na2No3
MgSO4 7H2O
FeSO4
Agar agar
Eau Distille q.s.p.
pH = 5,6

..
..
..
..
..
..
..
..

30 g
1 g
0,5 g
2 g
0,5 g
0,1 g
20 g
1000 ml

..
..
..
..
..
..
..

0,5 g
2,72 g
1,5 g
1,23 g
2,8 g
20
g
1000
ml

* Milieu Mathur (g/ l):


Extrait de levure
KH2PO4
Peptone
MgSO4 7H2O
Glucose
Agar agar
Eau Distille q.s.p.
pH = 5,6

-110-

Annexes

* Glose 2 % :
Agar agar
Eau Distille q.s.p.

..
..

20 g
1000 ml

..
..
..
..
..
..
..
..

1
1
0,5
0,5
0,2
0,2
20
1000

* Milieu SNA (g/ l) :


KH2PO4
KNO3
KCl
MgSO4 7H2O
Glucose
Sucrose
Agar agar
Eau Distille q.s.p.

g
g
g
g
g
g
g
ml

- Placer une deux pices de papier filtre strile par autoclavage (1 cm2), sur la surface du
milieu aprs quil soit glifi (pour la sporulation et comme autre source de carbone).

* Milieu Davet (g/ l) :


Ca (NO3)2
CaCl2
KNO3
MgSO4 7H2O
KH2PO4
Saccharose
Acide citrique
Agar agar
Eau Distille q.s.p.
pH = 4,5

..
..
..
..
..
..
..
..
..

1
1
250
250
125
2
50
25
1000

g
g
mg
mg
mg
g
mg
g
ml

-111-

Annexes

Annexe n 02 : Composition des solutions dlectrophorse

* Tampon de charge (PAGE) :

Glycrol
Bleu de bromophnol 1%
Eau Distille q.s.p.

..
..
..

5 ml
1 ml
10 ml

Le tampon est rparti raison de 0,5 ml par tube hmolyse avant dtre conserv au
conglateur jusquau moment de lemploi.
* Tampon de charge (SDS-PAGE) :

(Tris-HCl: 0,125 M; SDS: 4%; Glycrol: 20%; 2- Mercaptoethanol 0,04 %; pH= 6 ,8)
Tris-HCl (0,5 M)
SDS 10 %
Glycrol
2- Mercaptoethanol
Bleu de Bromophnol 1 %
Eau Distille q.s.p.

..
..
..
..
..
..

1,25
2
5
0,5
1
10

ml
ml
ml
ml
ml
ml

Le tampon est rparti raison de 0,5 ml par tube hmolyse avant dtre conserv au
conglateur jusquau moment de lemploi.
* Tampon de migration :

(Tris : 0,25 M ; Glycine : 1,92 M ; SDS : 0,1 % ; pH=8,3)


Tris
Glycine
SDS (pour le systme SDS-PAGE)
Eau Distille q.s.p.

..
..
..
..

3,03
14,4
1
1000

g
g
g
ml

Le tampon est conserv au rfrigrateur.

-112-

Annexes

* Tampon de sparation (Tris-HCl : 1,5 M ; pH = 8,8) :

Tris
Eau Distille q.s.p.

..
..

36,3 g
100 ml

Le pH est ajust avec environ 24 ml dHCl 1N, puis complt 200 ml avec de leau
distille. Aprs filtration la solution est conserve 4C.
* Tampon de concentration (Tris-HCl : 0,5 M ; pH = 6,8) :

Tris
Eau Distille q.s.p.

..
..

3 g
20 ml

Le pH est ajust avec environ 24 ml dHCl 1N, puis complt 200 ml avec de leau
distille. Aprs filtration la solution est conserve 4C.
* Tampon Na-phosphate 0,1 M pH = 7,1 (1) :

Solution A : KH2PO4, H2O


Solution B : Na2HPO4, 2 H2O

2,76 g dans 100 ml H2O


7,12 g dans 100 ml H2O

Ajuster le pH de la solution A 7,1 avec la solution B.


* Tampon Actate 0,05 M pH = 5 (2) :

Actate de Sodium, 3H2O


Eau Distille q.s.p.

..
..

3,4 g
475
ml

Ajuster pH = 5 avec HCl 1N, Complter 500 ml avec H2O.


* Solution CaCl2 0,1 M (3) :
CaCl2
Eau Distille q.s.p.

..
..

1,1 g
100
ml

-113-

Annexes

Annexe n 03 : Composition des solutions pour la rvlation des bandes


protiques
* Solution de fixation :

Acide actique
Eau Distille q.s.p.

..
..

200 ml
1000 ml

* Solution de coloration :

Bleu de coomassie G250


Ethanol
Acide actique
Eau Distille q.s.p.

..
..
..
..

1,5
250
40
1000

..
..
..

250 ml
20 ml
1000 ml

..
..

70 ml
1000 ml

g
ml
ml
ml

* Solution de dcoloration :

Ethanol
Acide actique
Eau Distille q.s.p.

* Solution de conservation :

Acide actique
Eau Distille q.s.p.

-114-