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GNERO VIBRIO

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Contenido
INTRODUCCIN.............................................................................................................................. 3
GNERO VIBRIO ............................................................................................................................. 4
Caractersticas Generales ............................................................................................................ 4
Reservorios................................................................................................................................... 5
VIBRIO CHOLERAE ........................................................................................................................ 6
Morfologa e identificacin ............................................................................................................ 6
Microorganismos tpicos ........................................................................................................... 6
Cultivo ....................................................................................................................................... 6
Caractersticas de crecimiento ................................................................................................. 7
Desarrollo Y Estructura ................................................................................................................ 8
Estructura antignica y clasificacin biolgica ............................................................................. 8
Enterotoxinas de Vibrio cholerae ................................................................................................. 9
Patognesis ................................................................................................................................ 11
- Prdida de lquidos ............................................................................................................... 12
- Regulacin gentica de la virulencia .................................................................................... 12
Manifestaciones clnicas............................................................................................................. 12
Pruebas diagnsticas de laboratorio .............................................................................................. 13
Muestras ..................................................................................................................................... 13
Identificacin del V. Cholerae ..................................................................................................... 16
Prueba de oxidasa .................................................................................................................. 16
Mtodo del papel de filtro humedecido .................................................................................. 16
Mtodo del hisopo .................................................................................................................. 16
Anlisis bioqumicos adicionales ............................................................................................ 17
Produccin de la toxina del clera para las pruebas de laboratorio .......................................... 22
Produccin de la toxina del clera.......................................................................................... 22
Deteccin de la toxina del clera ............................................................................................... 23
Resumen histrico de los mtodos de valoracin de la toxina del clera ............................. 23
Inmunidad ................................................................................................................................... 30
Tratamiento................................................................................................................................. 30
Epidemiologa, prevencin y control .......................................................................................... 31
OTROS VIBRIOS ........................................................................................................................... 32
1. Vibrio parahaemolyticus ......................................................................................................... 32
2. Vibrio Vulnificus ...................................................................................................................... 33
3. Otros vibrios............................................................................................................................ 33
BIBLIOGRAFA............................................................................................................................... 34

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INTRODUCCIN
Las especies del gnero Vibrio tienen una amplia distribucin en la naturaleza, la mayora de
especies del gnero vibrio son acuticas, bien de aguas dulces o saladas. El vibrio cholerae,
una de las especies ms representativas del gnero es patgeno para humanos,
constituyendo la causa especfica de la enfermedad conocida como clera; sin embargo
este organismo normalmente no afecta a otras especies. El clera es una de las
enfermedades ms comunes en pases en vas de desarrollo o subdesarrollados. El
microorganismo se transmite casi exclusivamente por va hdrica y los resultados de su
distribucin que se hicieron en el siglo XIX demostraron la importancia de la purificacin de
las aguas en zonas urbanas, como medio ms idneo para cotar los brotes colricos.
V. cholerae O1, biotipo El Tor es el responsable de la sptima pandemia que se inici en
1961 cuando apareci la bacteria como causa de epidemia de clera en Celebes (Sulawesi),
Indonesia. La enfermedad se propag rpidamente a otros pases de Asia del este y lleg a
Bangladesh en 1963, a India en 1964, y a la URSS, Irn e Irak en 1965-1966. En 1970 el
clera invadi el oeste de frica, la cual no haba experimentado la enfermedad por ms de
100 aos. La enfermedad se dispers rpidamente a varios pases de frica y se convirti
en endmica en casi todo el continente.
En 1991 el clera golpe a Latinoamrica, en donde tambin haba estado ausente por ms
de un siglo. Su ingreso fue por Per. En el primer ao se propag a 11 pases, y
subsecuentemente a travs del continente. En Uruguay en el mismo ao se crea una
comisin con el fin de prevenir, monitorear y tomar las medidas necesarias para impedir la
entrada o diseminacin de la enfermedad en el pas y que tuvo un xito en sus cometidos.
Es debido a esto, la importancia de poder conocer a este gnero de bacterias, y sobre todo
a las especies patgenas en el ser humano, destacando entre ellas el Vibrio cholerae por la
enfermedad infecciosa que produce y que en su momento fue un gran problema para los
mdicos de ese entonces. Si bien actualmente no llega a ser un gran problema su
tratamiento, no debemos descuidarnos
El vibrio parahaemolyticus es un microorganismo marino. Es una de las causas ms
comunes de casos de gastroenteritis en Japn ( donde se consume pescado crudo
rutinariamente) y tambien se ha implicado en trastornos semejantes en otras partes del
mundo incluyendo Estados Unidos.

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Caractersticas Generales
Los vibrios son unas de las bacterias ms frecuentes en las aguas de superficie de todo el
mundo. Son bacilos gramnegativos curvados (Figura 1), son extremadamente mviles y
poseen un flagelo polar, no forman esporas, son oxidasa-positivas y pueden desarrollarse
bajo condiciones aerobias, pero pueden ser anaerobios facultativos. Las clulas pueden
conectarse extremo a extremo, generando formas en S y espirales. La estructura de la
envoltura celular es similar a la de otras bacterias gramnegativas.

FIGURA 1. Vibrio cholerae (micrografa electrnica


de barrido). Observe los bacilos curvados y los
flagelos polares.

CUADRO 1. Caractersticas de Vibrio, Campylobacter y Helicobacter


BACTERIOLOGA
Organismo

Desarrollo

PATOGNESIS
Ureasa

Epidemiologa

Adherencia

Vibrio
cholerae

Facultativo

Fecal-oral,
transportado
por agua,
pandemias

Protena
b
superficial ,
pelos

Campyloba
cter jejuni

Microaerfilo

Animales, leche
no
pasteurizada

Desconocida

Helicobacte
r pylori

Microaerfilo

Secreciones
gstricas

PME

humanas

Enfermedad

TC

Toxinas
c

Diarrea
acuosa
(clera)

Desconocidas

VacA , ureasa,
h
Cag

Disentera,
diarrea acuosa

Gastritis
crnica,
lceras,
adenocarcino
ma, linfoma

a Todos son bacilos gramnegativos curvados morfolgicamente similares.


b La protena de la superficie es capaz de fijarse a la quitina y a los intestinos humanos.
c Toxina del clera.
d Lipooligosacrido, flagelina, protena principal de la membrana externa (PPME) y protena CadF fijadora de fibronectina son
adherencias potenciales.
e La toxina citoletal-distensora es una toxina potencial.
f PME, protenas de membrana externa (BabA, SabA, AlpA, AlpB, HopZ).
g Citotoxina vacuolante.
h Tcnicamente no es una toxina, pero Cag se asocia de manera poderosa con la virulencia.

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Los serogrupos de V. cholerae O1 y O139 producen clera en el ser humano, en tanto que
otros vibrios pueden ser causa de sepsis o enteritis. En el Cuadro 2 se presentan las
principales especies de vibrios de importancia mdica y en el Cuadro 3 los menos comunes.
CUADRO 2. Vibrios de importancia mdica
Microorganismo

Enfermedad en seres humanos

Vibrio cholerae serogrupos O1 y O139

Clera epidmico y pandmico


Diarrea coleriforme; diarrea leve; raras veces infecciones

Vibrio cholerae serogrupos no O1/ no O139

extraintestinales

Vibrio parahaemolyticus

Gastroenteritis, tal vez infecciones extraintestinales

CUADRO 3. Caractersticas de las especies menos comunes de Vibrio


ORGANISMO

CARACTERSTICAS

EPIDEMIOLOGA

ENFERMEDAD

V. mimicus

Cercanamente relacionado con V.


cholerae, enterotoxina similar al
clera

Ingestin de pescados
mariscos crudos

V.
parahaemolyticus

Produce inflamacin
enterotoxina no clara

Agua de mar costera;


ingestin de pescados y
mariscos crudos; brotes en
cruceros; comn en Japn

Diarrea
acuosa,
disentera ocasional

Agua de mar costera, en


especial cuando aumenta la
temperatura
del
agua;
ingesta de pescados o
mariscos crudos o por
contaminacin de heridas
con agua de mar

Bacteriemia fulminante
posterior a la ingestin,
celulitis
por
contaminacin
de
heridas, altas tasas de
mortandad en aquellos
con enfermedades de
+
almacenamiento de Fe

Heridas contaminadas con


agua de mar

Celulitis

V. vulnificus

intestinal,

Produce siderforos poderosos


que secuestran el hierro de la
transferrina y la lactoferrina del
hospedador

V. alginolyticus

Diarrea acuosa

Reservorios
El principal reservorio es el ser humano; observaciones en Australia, Bangladesh y Estados
Unidos han demostrado la existencia de reservorios en el ambiente, al parecer con la
participacin de coppodos u otras clases de zooplancton de aguas salobres o estuarios.
Hay microorganismos que pueden persistir en el agua por mucho tiempo y en la literatura se
menciona que el alza de la temperatura del mar, producto de la corriente del nio, favoreca
la sobrevida y su replicacin.
Las personas son infeccin asintomtica juegan un importante rol en acarrear el vibrio de un
lugar a otro, produciendo la diseminacin de las epidemias.
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VIBRIO CHOLERAE
Las caractersticas epidemiolgicas del clera son muy parecidas al reconocimiento de la
transmisin de V. cholerae en el agua y el desarrollo de sistemas sanitarios de agua.

Morfologa e identificacin
Microorganismos tpicos
En el aislamiento inicial, V. cholerae es un bacilo curvo de forma de coma de 2 a 4 m de
longitud (figura 2). Se mueve por medio de un flagelo polar. En el cultivo prolongado, los
vibrios pueden convertirse en bacilos rectos que se parecen a las bacterias entricas
gramnegativas.

FIGURA 2. Tincin de Gram de Vibrio cholerae. A menudo tienen


forma de coma o levemente curveados (flechas) y miden 1 2 a 4
m. Aumento original 1 000.

Cultivo
V. cholerae produce colonias convexas, lisas y redondas que son opacas y granulosas en la
luz transmitida. V. cholerae y la mayor parte de los dems vibrios se multiplican bien a una
temperatura de 37 C en muchas clases de medios, incluidos los medios definidos que
contienen sales minerales y asparagina como fuentes de carbono y nitrgeno. V. cholerae
se multiplica bien en agar de tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS, thiosulfate-citrate-bilesucrose), en el cual produce colonias amarillas que son fcilmente visibles sobre un fondo
de color verde oscuro de agar (figura. 3). Los vibrios son oxidasa positivos, lo que los
distingue de las bacterias gramnegativas entricas. Es caracterstico que los vibrios se
multipliquen a un pH muy alto (8.5 a 9.5) y que rpidamente sean destruidos por cido. Por
tanto, los cultivos que contienen hidratos de carbono fermentables se vuelven estriles con
rapidez.
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En zonas donde el clera es endmico, son apropiados los cultivos directos de las heces en
medios selectivos, como el TCBS y cultivos enriquecidos en agua de peptona alcalina. Sin
embargo, los coprocultivos sistemticos en medios especiales como TCBS por lo general no
son necesarios ni rentables en zonas donde es infrecuente el clera.

FIGURA 3. Colonias de Vibrio cholerae en agar de tiosulfato,


citrato, sales biliares y sacarosa (TCBS). Las colonias de color
amarillo brillante tienen un dimetro de 2 a 3 mm y estn
rodeadas por un color amarillo difuso del indicador en el agar de
hasta 1 cm de dimetro. La placa tiene un dimetro de 10 cm.

Caractersticas de crecimiento
Por lo regular V. cholerae fermenta sacarosa y manosa pero no arabinosa. Una prueba de
oxidasa positiva es un paso clave en la identificacin preliminar de V. cholerae y otros
vibrios. Las especies del gnero Vibrio son susceptibles al compuesto O/129 (fosfato de 2,4diamino-6,7-diisopropilpteridina), que los diferencia de las especies del gnero Aeromonas,
que son resistentes al compuesto O/129.
La mayor parte de las especies del gnero Vibrio son halotolerantes y el NaCl a menudo
estimula su multiplicacin. Algunos vibrios son halfilos y necesitan la presencia de NaCl
para multiplicarse. Otra diferencia entre los vibrios y las aeromonas es que los primeros
crecen en medios que contienen NaCl al 6%, y las aeromonas no.

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Desarrollo Y Estructura
V. cholerae tiene una baja tolerancia al cido, pero crece bajo condiciones alcalinas (pH 8.0
a 9.5) que inhiben a muchas otras bacterias gramnegativas. Se distingue de los dems
Vibrio por sus reacciones bioqumicas, estructura antignica lipopolisacrida (LPS) O y por
su produccin de la toxina del clera (TC). Existen ms de 150 serotipos antignicos O, slo
dos de los cuales (O1 y O139) causan el clera.
El biogrupo El Tor de V. cholerae, una variante de O1, es un biotipo de la cepa clsica. Las
cepas O139 se asemejan fenotpicamente a las cepas El Tor O1. V. cholerae posee largos
pelos fi lamentosos que forman haces sobre la superficie bacteriana y que pertenecen a una
familia de pelos cuya estructura qumica es similar a las de los gonococos y de numerosos
otros patgenos bacterianos. Todas las cepas capaces de causar el clera producen un
factor de colonizacin denominado pelo corregulado por toxina (PCT) a causa de que su
expresin se regula junto con la de la TC.

Estructura antignica y clasificacin biolgica


Muchos vibrios comparten un solo antgeno H flagelar termolbil. Los anticuerpos contra el
antgeno H probablemente no intervienen en la proteccin de los hospedadores
susceptibles. V. cholerae tiene lipopolisacridos O que le confieren una especificidad
serolgica. Existen por lo menos 139 grupos de antgeno O. Las cepas de V. cholerae del
grupo O1 y del grupo O139 producen el clera caracterstico; en ocasiones, los cleras V.
cholerae no O1/no O139 producen una enfermedad parecida al clera. Los anticuerpos
contra los antgenos O tienden a proteger a los animales de laboratorio contra las
infecciones por V. cholerae.
El antgeno del serogrupo O1 de V. cholerae tiene determinantes que permiten una
tipificacin adicional: los serotipos son Ogawa, Inaba e Hikojima. Se han defi nido dos
biotipos de V. cholerae epidmico, el clsico y El Tor. El biotipo El Tor produce una
hemolisina, da resultados positivos en la prueba de VogesProskauer y es resistente a la
polimixina B. Tambin se pueden utilizar tcnicas moleculares para tipificar V. cholerae. Se
utiliza la tipificacin para los estudios epidemiolgicos y por lo general slo se llevan a cabo
las pruebas en laboratorios de referencia.
V. cholerae O139 es muy similar a V. cholerae O1 biotipo El Tor. V. cholerae O139 no
produce el lipopolisacrido O1 ni tiene todos los genes necesarios para elaborar este
antgeno. V. cholerae O139 elabora una cpsula de polisacrido, al igual que otras cepas de
V. cholerae no O1, en tanto que V. cholerae O1 no sintetiza una cpsula.

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Enterotoxinas de Vibrio cholerae


El V. cholerae invade la mucosa intestinal y se adhiere a las microvellosidades del borde en
cepillo de las clulas epiteliales intestinales. V. cholerae, casi siempre el serotipo O1 (y
O139), produce una enterotoxina termolbil con un peso molecular de 84 000. La toxina del
clera, TC (Figura 4 y 5), es una toxina ADP-ribosilante tipo A-B que consta de dos
subunidades: las subunidades txicas A, que se degrada hasta formar dos pptidos, A1 y
A2, unidos por un puente disulfuro; y cinco unidades de fijacin B (cinco pptidos idnticos).
Las unidades B se fijan al receptor GM1-ganglisido que se encuentra sobre la superficie de
muchos tipos de clulas. Una vez fijada, la subunidad A1 se libera de la molcula de toxina
mediante la reduccin del enlace disulfrico que la une a la subunidad A2 e ingresa en la
clula por translocacin. Dentro de la clula ejerce su efecto sobre el sistema adenilciclasa
asociado con la membrana sobre la superficie de la membrana basolateral. El blanco de la
subunidad txica A1 es una protena nucletida de guanina (G), Gsa, que regula la
activacin del sistema adenilciclasa. La TC cataliza la ADP ribosilacin de la protena G,
hacindola incapaz de disociarse del complejo activo de la adenilciclasa. Esto ocasiona la
activacin persistente de la adenilciclasa intracelular que, a su vez, estimula la conversin
del trifosfato de adenosina en 3, 5-monofosfato cclico de adenosina (cAMP). El efecto neto
es una acumulacin excesiva de cAMP en la membrana celular, lo que ocasiona una
hipersecrecin de cloro, potasio, bicarbonato y molculas de agua asociadas hacia el
exterior de la clula. La diarrea producida algunas veces es masiva (p. ej., 20 a 30 L/da), lo
cual da por resultado deshidratacin, choque, acidosis y hasta la muerte. Los efectos
nocivos del clera son secundarios a la prdida del lquido y al desequilibrio acidobsico; por
lo tanto, el tratamiento es la restitucin de lquidos y electrlitos.
FIGURA 4. Accin de la toxina del clera.
Se muestra a la toxina completa fijndose al receptor
GM1 - ganglisido de la membrana celular por medio
de las subunidades de fijacin (B). La porcin activa
(A1) de la subunidad A cataliza la ADP-ribosilacin
(ADPR) de la protena reguladora G (estimulante),
s

fijndola en el estado activo. Debido a que la protena


G acta para retornar a la adenilciclasa de su forma
s

inactiva a su forma activa, el efecto neto es la


activacin persistente de la adenilciclasa. El aumento
en la actividad de la adenilciclasa (AC) provoca la
acumulacin de 3, 5-monofosfato cclico de adenosina
(cAMP) a lo largo de la membrana celular. El cAMP
+

ocasiona la secrecin activa de sodio (Na ), cloro (Cl ),


+

potasio (K ), bicarbonato (HCO3 ) y agua hacia el


exterior de la clula hacia la luz intestinal.

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FIGURA 5. Accin de la enterotoxina del clera

(1) El proceso normal del trfico de iones en el


intestino y la colonizacin de Vibrio cholerae
siguiendo la liberacin de la enterotoxina y la unin
al ganglisido GM1 de las clulas del hospedador.

(2) Las toxinas A-B actan internalizando el


componente A y activando la adenilato ciclasa.

(3) Bloqueo del flujo normal de sodio (Na ).

(4) La prdida de agua en el lumen y la diarrea.

La terapia del clera se basa en la reposicin de iones y la hidratacin. El tratamiento antibitico puede acortar la
enfermedad por limitar el crecimiento de los V. cholerae, pero no tiene efecto en la toxina ya liberada.

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Patognesis
El clera, V. cholerae debe llegar al intestino delgado, nadar al interior de las criptas
intestinales, multiplicarse y producir factores de virulencia (Cuadro 4). En las personas
sanas, se requiere de la ingesta de grandes cantidades de bacterias, cuando el vehculo es
agua se requiere 1010 o ms microorganismo para infectarse y cuando el vehculo es
alimento, se necesita un mnimo de 102 a 104 microorganismos por la capacidad
amortiguadora del alimento. El clera no es una infeccin invasiva, los microorganismos no
llegan al torrente sanguneo sino que permanecen en el tubo digestivo. La colonizacin del
tracto intestinal completo desde el yeyuno al colon por V. cholerae requiere de la adherencia
a la superficie epitelial por medio de la protena antes mencionada y los pelos de su
superficie. La caracterstica sobresaliente de la patogenicidad de V. cholerae es la
capacidad que las cepas virulentas tienen para producir la TC, que es la responsable de la
enfermedad del clera. El cambio de agua y electrlitos de la clula a la luz intestinal es la
causa fundamental de la diarrea acuosa del clera.
Cuadro 4. Factores de virulencia en las especies Vibrio
Especies

Factor de virulencia

Efecto biolgico

Toxina colrica

Hipersecrecin de electrlitos y agua

Pilus corregulado por la toxina

Protena quimiotctica

Lugar de unin para CTX; media la adherencia a las


clulas de la mucosa intestinal
Factor adhesina

V. cholerae
Enterotoxina colrica
accesoria
Toxina de la znula oclusiva

Neuraminidasa

V.
parahaemolyticus
V. vulnicus

Hemolisina Kanagawa

Cpsula de polisacridos
Citolisinas, proteasas,
colagenasa

Aumenta la secrecin de lquido intestinal

Aumenta la permeabilidad intestinal


Modific la supercie celular para aumentar el nmero
de sitios de unin de GM1 para la toxina colrica
Enterotoxina que induce la secrecin del cloruro
(diarrea acuosa)
Antifagoctica

Media la destruccin tisular

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- Prdida de lquidos
La prdida de lquidos que se produce por la estimulacin de la clula con adenilciclasa
depende del equilibrio entre la cantidad de crecimiento bacteriano, produccin de toxina,
secrecin de lquidos y absorcin de los mismos en la totalidad del tracto intestinal. La salida
de lquidos y electrlitos es mxima en el intestino delgado, donde la capacidad de
secrecin es elevada y la capacidad de absorcin es baja. El lquido diarreico puede llegar a
muchos litros por da, con un contenido de sodio aproximadamente igual al del plasma, pero
con concentraciones entre dos y cinco veces mayores de potasio y bicarbonato. El resultado
es la deshidratacin (prdida de lquido isotnico), hipopotasemia y acidosis metablica
(prdida de bicarbonato). La mucosa intestinal permanece inalterada a excepcin de cierta
hiperemia, dado que V. cholerae no invade ni daa al enterocito de otras maneras.
- Regulacin gentica de la virulencia
La expresin de los diversos factores de virulencia de V. cholerae se controla por medio de
un sistema coordinado que involucra sensores ambientales y hasta 20 genes cromosmicos
divididos entre una isla de patogenicidad (PAI) que contiene la TC y otra que contiene PCT.
El regulador principal es una protena transmembrnica (ToxR) que detecta los cambios
ambientales en pH, osmolaridad y temperatura, que la convierten en una forma activa. En el
estado activo, ToxR puede encender los genes de TC de manera directa adems de activar
la transcripcin de una segunda protena reguladora, ToxT. ToxT, cuyo efector natural
podra ser la bilis, activa la transcripcin de los genes de virulencia que se encuentran en
ambas PAI, incluyendo PCT y TC. En apariencia, sistemas detectores de qurum parecen
desplegar esta expresin de genes de virulencia en un punto en que hay una masa crtica
de V. cholerae presente para sostenerla.

Manifestaciones clnicas
Casi 60% de las infecciones por V. cholerae clsico son asintomticas lo mismo que casi
75% de las infecciones por el biotipo El Tor. El periodo de incubacin es de uno a cuatro
das para las personas que presentan sntomas, lo cual depende en gran parte del tamao
del inculo ingerido. Hay inicio brusco de nusea y vmito y una diarrea abundante con
clicos abdominales. Las heces, que semejan agua de arroz, contienen moco, clulas
epiteliales y un gran nmero de vibrios. Hay una prdida rpida de lquidos y electrlitos, lo
cual lleva a una deshidratacin intensa, colapso circulatorio y anuria. La tasa de mortalidad
sin tratamiento es de 25 a 50%. El diagnstico de un caso de clera real no plantea
problemas cuando hay una epidemia. Sin embargo, los casos espordicos o leves no son
fciles de distinguir de otras enfermedades diarreicas. El biotipo El Tor tiende a producir
enfermedad ms leve que el biotipo clsico.

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Pruebas diagnsticas de laboratorio


Muestras
Los cultivos con sospecha de ser V. cholerae deben subcultivarse en un medio no selectivo
(por ejemplo, agar infusin de corazn [AIC] o agar triptona soya [ATS]) como preparacin
para la identificacin por serologa en lmina y pruebas bioqumicas. Las cepas de V.
cholerae requieren de 0,5% de ClNa (sal) para un crecimiento ptimo en medio de agar;
algunas formulaciones comerciales de agar nutriente no contienen sal y no deben usarse
para el cultivo de V. cholerae . En general, el anlisis con pruebas bioqumicas previo a la
prueba con los antisueros O1 y O139 no es necesario cuando se sospecha presencia de V.
cholera e en muestras de fecales. No obstante, si el suministro de antisueros somticos es
limitado, las pruebas bioqumicas pueden servir para la deteccin adicional de aislamientos,
antes de ir a las pruebas con antisueros. Las pruebas de deteccin y la serologa en lmina
tienen que hacerse con el crecimiento de un medio no selectivo. La Figura 6 presenta un
diagrama de flujo para el aislamiento y la identificacin de cepas de V. cholerae y la Figura 7
provee un modelo de planilla que puede usarse para registrar los resultados de las pruebas
de deteccin.
Procedimiento
1. Asegurarse de que la persona defeque en un recipiente aparte (bacinilla) cuidando que la
muestra no se mezcle con orina.
2. Tomar una parte de la muestra en un recipiente estril de boca ancha y tapa rosca.
3. Rotular el frasco colocando el nombre del paciente, edad y fecha de recoleccin.
4. Introducir la(s) muestra(s) en una funda plstica y cerrarla evitando que se derrame y se
mezcle con otras muestras.
5. Colocarlas en una caja, rodendolas de papel picado asegurando que los recipientes no
se muevan durante el transporte.
6. Adjuntar los formularios en donde constar nombres y apellidos de los pacientes,
procedencia, fecha de toma de la muestra, nombre y telfono de la persona que hizo la
toma.
7. Sellar la caja y colocar un rtulo a un costado indicando Peligro, Muestra Biolgica y una
flecha indicando la posicin Hacia Arriba, de manera que el transporte se haga de esa
forma.
8. Transportar las muestras rpidamente, antes de que transcurran 2 horas de su emisin.
Luego de ese tiempo la muestra no ser til.

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FIGURA 6. Diagrama de flujo para el aislamiento y la identificacin de cepas de Vibrio cholerae

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FIGURA 7. Modelo de planilla para el registro de los resultados de la prueba de deteccin de Vibrio cholerae

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Identificacin del V. Cholerae


Prueba de oxidasa
La prueba de oxidasa usa el reactivo de Kovac (una solucin al 1% [p/vol] de N, N, N, N
tetrametil-p-dihidroclorofenilendiamina) para detectar la presencia de citocromo c en la
cadena respiratoria de la bacteria; si el reactivo de la oxidasa es catalizado, se torna
prpura. La prueba de la oxidasa se puede hacer en papel de filtro o en un hisopo.
Haga la prueba de oxidasa con crecimiento fresco de la superficie inclinada (cua) del AIC o
AHTA o cualquier otro medio no selectivo que no contenga carbohidratos; no use
crecimiento de agar tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa [ATCSBS] porque puede
producir tanto resultados falsos negativos como falsos positivos. No use asa de Nicromo
para esta prueba, pues puede producir una reaccin falsa positiva. Para los propsitos de
control de calidad, los controles positivo y negativo se deben probar al mismo tiempo que se
hace la prueba del aislamiento.
Mtodo del papel de filtro humedecido
a) En una placa de Petri, aada a un pedazo de papel de filtro dos o tres gotas de reactivo
de oxidasa de Kovac y deje que el papel absorba el reactivo; el papel de filtro debe estar
hmedo (pero no mojado) despus que ha absorbido el reactivo.
b) Tome una porcin de la colonia a probar de un medio no selectivo y frtela en el papel de
filtro humedecido usando un asa de platino, un asa plstica, un hisopo estril, un aplicador
de madera estril o un mondadientes estril. (No use un asa de Nicromo.)
c) Si el aislamiento es V. cholerae, en 10 segundos debe darse una reaccin positiva
(prpura) en la regin donde el crecimiento ha sido extendido
Mtodo del hisopo
a) Escoja con un hisopo las colonias sospechosas de una placa de cultivo no selectivo o de
un crecimiento de una cua de agar no selectivo.
b) Aada una gota del reactivo de oxidasa de Kovac al hisopo usando una pipeta de
Pasteur.
c) Si el aislamiento es V. cholerae, en 10 segundos habr una reaccin positiva (prpura).
Si el aislamiento no se torna prpura a los 10 segundos de haber aadido el reactivo de
oxidasa de Kovac, no ser considerado oxidasa positiva. Los microorganismos de los
gneros

Vibrio

(cuadro

4),

Neisseria,

Campylobacter,

Aeromonas,

Plesiomonas,

Pseudomonas y Alcaligenes son todos positivos a oxidasa; todas las Enterobacteriaceae


son negativas a oxidasa.

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Cuadro 4. Reacciones de Vibrio cholerae en pruebas de pesquisaje


Prueba de pesquisaje

Reacciones de Vibrio cholerae

Prueba de oxidasa

Positivo

Prueba de la cuerda

Positivo
K/A (cua roja/fondo amarillo), no produce gas, no

Agar hierro de kligler (AHK)

H2S [1824 horas]

Agar hierro triple azcar (AHTA)

de

Gram

no H2S [1824 horas]


K/K (cua prpura/fondo prpura), no produce gas,

Agar hierro lisina (AHL)


Coloracin
hmedo

A/A (cua amarilla/fondo amarillo, no produce gas,

no H2S
Montaje

a, b

[1824 horas]

Pequeos bacilos curvos gramnegativos Pequeos bacilos curvos con


motilidad rpida

K= alkaline; A= acid

An alkaline reaction (purple) in the butt of the medium indicates that lysine was decarboxylated.
An acid reaction (yellow) in the butt indicates that lysine was not decarboxylated.

Anlisis bioqumicos adicionales


La reaccin de la cuerda, el agar hierro de Kligler (AHK), el agar hierro triple azcar (AHTA)
o el agar hierro lisina (AHL), la coloracin de Gram y una preparacin hmeda de motilidad,
son otras pruebas que pueden usarse para detectar los aislamientos antes de que se
prueben con el antisuero (vase la Cuadro 4). Debe determinarse la utilidad de estas
pruebas antes de incluirlas en la rutina; la justificacin de cada prueba (por ejemplo, el uso
de la prueba de la cuerda para sacar las Aeromonas) se incluye en la descripcin de los
mtodos que figuran a continuacin.
La prueba de la cuerda
La prueba de la cuerda utiliza crecimiento fresco de un agar no
selectivo, es til para excluir las especies que no son Vibrio,
particularmente las de Aeromonas. La prueba de la cuerda puede
desarrollarse en una lmina de vidrio o en una placa plstica de
Petri, suspendiendo un crecimiento de agar infusin de corazn
(u otro medio no inhibidor) durante 1824 horas en una gota de
solucin acuosa de desoxicolato de sodio al 0,5%. Si el resultado
es positivo, las clulas bacterianas sern lisadas por el
desoxicolato de sodio, la solucin perder turbidez y el ADN se
desprender de las clulas lisadas, causando la viscosidad de la
mezcla. Se formar una cuerda mucoide cuando se introduzca
lentamente un asa de inoculacin en la suspensin (Figura 8).
Las cepas de V. cholerae son positivas, mientras que por lo
general las cepas de Aeromonas son negativas (vase el Cuadro

FIGURA 8. Prueba de la
cuerda positiva con Vibrio
cholerae

4). Otras especies de Vibrio pueden dar una reaccin positiva o dbil a la prueba de la
cuerda.
17

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Agar hierro de Kligler y agar hierro triple azcar


El AHK y el AHTA sirven para excluir las especies de Pseudomonas y ciertas
Enterobacteriaceae. Es importante que el agar hierro de Kligler y el agar hierro triple azcar
sean preparados de manera que los tubos tengan un tope profundo y una cua larga. Si el
tope no es suficientemente profundo se pueden generar reacciones engaosas en estos
medios. Se considera aceptable un tubo preparado con un tope de aproximadamente 3,5 cm
de profundidad y una cua de aproximadamente 2,5 cm. Las cuas de agar AHK o AHTA se
inoculan por puncin del tope y estriando la superficie del medio. Incube las cuas a 35C
37C y examnelas durante 1824 horas. Todas las tapas de los tubos de los medios
bioqumicos deben aflojarse antes de la incubacin; esto es de particular importancia para
las cuas de AHK o AHTA. Si las tapas estn muy ajustadas y existen condiciones de
anaerobiosis en el tubo, ocurrir una reaccin inapropiada y las reacciones caractersticas
de V. cholerae pueden no presentarse.
Las reacciones de V. cholerae en AHK que contenga glucosa y lactosa son similares a
aquellas de las Enterobacteriaceae no fermentadoras de la lactosa (cua alcalina [roja], tope
cido [amarillo], no produce gas, ni HS). Sin embargo, en AHTA las cepas de V. cholerae
producen una cua cida (amarilla), un tope cido (amarillo), no producen gas, ni H2S
(vanse el cuadro 4 y la Figura 9).
FIGURA 9. Reacciones de aislamientos de Vibrio cholerae en agar hierro de
Kligler y agar hierro triple azcar

18

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Agar hierro lisina


El AHL sirve para detectar aislamientos de Aeromonas y ciertas especies de Vibrio, las
cuales, a diferencia del V. cholerae, no decarboxilan la lisina. El AHL tiene que ser
preparado de manera que los tubos tengan un tope profundo (de aproximadamente 3,5 cm)
y una cua larga (de aproximadamente 2,5 cm). Si el extremo del AHK o del AHTA no es
suficientemente profundo, pueden generarse reacciones engaosas en este medio. En el
AHL, la descarboxilacin de la lisina ocurre solamente en condiciones de anaerobiosis y, por
insuficiencia del medio en el tubo, puede ocurrir una reaccin falsa negativa. Inocule el AHL
puncionando el tope y estriando la cua; despus de incubar durante 1824 horas a 35C
37C, examine la cua del AHL para ver las reacciones tpicas de V. cholerae. Los
microorganismos que producen lisina descarboxilasa en AHL causan una reaccin alcalina
(color prpura) en el extremo del tubo (vase la Figura 41); los microorganismos sin la
enzima producen una reaccin cida (color amarillo) en el tope del tubo. La produccin de
H2S se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. La reaccin del AHL para el V.
cholerae es tpica, con una cua y un tope alcalinos (prpura), y sin produccin de gas ni
H2S (vase el cuadro 4). Las cepas de Proteus y Providencia spp. producirn con frecuencia
una cua roja causada por desaminacin de la lisina.
Coloracin de Gram
Examinando una cua de crecimiento de toda la noche de Vibrio cholerae en agar infusin
de corazn por la coloracin de Gram, se demostrarn los tpicos bacilos pequeos, en
forma de curva o coma, gramnegativos (vase el cuadro 4). La tincin con cristal violeta es
solamente una tcnica ms rpida, que demostrar tambin la morfologa tpica de las
clulas de las especies de Vibrio.
Montaje hmedo entre cubreobjetos y portaobjetos
Se ha usado microscopias de campo oscuro y por contraste de fase para detectar
aislamientos con sospecha de ser V. cholerae. Con estas tcnicas, las suspensiones en
solucin

salina

se

examinan

microscpicamente

buscando

la

presencia

de

microorganismos, bacilos pequeos con forma tpica de curva o coma y alta motilidad
(estrella fugaz) (vase el cuadro 4).
Identificacin serolgica de aislamientos de V. cholerae O1 y O139
Si se sigue la identificacin bioqumica presuntiva de un agente como V. cholerae, es
apropiado confirmarlo por serologa. Si se sospecha que hay una epidemia de clera, el
agente causal ms comn es V. cholerae O1. Si la cepa aislada no corresponde a V.
cholerae O1, habr que probar con V. cholerae O139. Si no se asla ninguno de estos
microorganismos, ser necesario enviar las muestras de heces a un laboratorio de
referencia. Los laboratorios locales y regionales tienen que enviar al laboratorio de
19

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referencia los aislamientos que requieran pruebas con el antisuero O139; si el laboratorio
nacional de referencia no est capacitado para confirmar la identificacin de un aislamiento
de V. cholerae como O1 u O139, algn laboratorio internacional de referencia puede guiarlo.
Para conservar recursos, el laboratorio puede probar primero con los antgenos somticos
O1 de V. cholerae y despus, con el antisuero O139 solo en caso de que el aislamiento no
d una reaccin de aglutinacin positiva con el antisuero O1.
Identificacin presuntiva usando los antisueros O1 y O139
Para la prueba de aglutinacin en lminas con los antisueros polivalentes O1 u O139, se
debe usar crecimiento fresco con sospecha de ser V. cholerae en medio de agar no
selectivo. El uso de crecimiento de agar tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa (ATCBS)
puede dar una reaccin falsa negativa. Despus de 5 a 6 horas de incubacin, el
crecimiento en la superficie de la cua es casi siempre suficiente para realizar la prueba de
aglutinacin en lmina con el antisuero; si no, incube por un perodo ms largo. Si el
aislamiento no aglutina con el antisuero O1, pruebe con el antisuero O139. Si la reaccin
con el polivalente O1 o con el antisuero O139 es positiva, el aislamiento puede ser notificado
presuntamente como de V. cholerae O1 u O139. Estos aislamiento presuntivos de V.
cholerae O1 pueden probarse con antisueros monovalentes de Ogawa e Inaba (mtodos
que se presentarn a continuacin). Una vez que una colonia de una placa ha sido
identificada como V. cholerae O1 u O139, no es necesario seguir probando otras colonias
de la misma placa.
Confirmacin de V. cholerae O1 con antisueros Inaba y Ogawa
El serogrupo O1 de V. cholerae se ha dividido en otros tres serotipos: Inaba, Ogawa y
Hikojima (el cual es muy raro). La identificacin de serotipos se hace por aglutinacin en
antisueros monovalentes por tipo especfico de antgenos O (Cuadro 5). Una reaccin
positiva con cualquiera de los antisueros Inaba u Ogawa es suficiente para confirmar la
identificacin de un aislamiento de V. cholerae O1. Los aislamientos cuya aglutinacin es
dbil o lenta con el antisuero del serogrupo O1 y que no aglutinan con el antisuero de Inaba
o Ogawa, se consideran que no pertenecen al serogrupo O1. La identificacin con estos
antgenos es vlida solamente para los aislamientos del serogrupo O1. Por esta razn, los
antisueros Inaba y Ogawa nunca deben usarse con cepas que son negativas con el
antisuero polivalente O1. Con frecuencia, las cepas de un serotipo producen una
aglutinacin lenta o dbil con el antisuero de otro serotipo, dependiendo de lo bien que
hayan sido absorbidos los antisueros especficos para el serotipo. Por esta razn, se deben
examinar simultneamente las reacciones de aglutinacin con los antisueros de Inaba y
Ogawa; debe usarse la reaccin ms fuerte y ms rpida para la identificacin del serotipo.
Con antisueros adecuadamente absorbidos, son raras, si las hay, las cepas que aglutinan
muy fuerte y similarmente con ambos antisueros (Ogawa e Inaba). Si se sospechara de
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tales reacciones, las cepas deben ser remitidas a un laboratorio de referencia ms


exmenes y pueden considerarse como posible serotipo Hikojima.
Cuadro 5. Reacciones de aglutinacin en antisuero absorbido de serotipos de Vibrio cholerae serogrupo O1

V. c hol erae serotipo O1

antisuero Ogawa

Ogawa
Inaba

Hikojima

antisuero Inaba

+ indica una reaccin de aglutinacin positiva en el antisuero absorbido.


indica una reaccin de aglutinacin negativa en el antisuero absorbido.
si existe una reaccin positiva en ambos antisueros (Ogawa y Inaba) y se sospecha el serotipo Hikojima, enve el aislamiento a un laboratorio de
referencia internacional.
b
c

Procedimiento para la aglutinacin en lmina


Las pruebas de aglutinacin para los antgenos somticos O para V. cholerae pueden
realizarse en una placa de Petri o en una lmina de cristal limpia.
a) Divida la lmina en secciones con un lpiz de cera y coloque una pequea gota de
solucin salina fisiolgica en cada seccin de la lmina.
b) Saque una porcin del crecimiento de la superficie del medio de AHK, AHTA o AIC u otro
medio de agar no selectivo usando un asa de inoculacin o aguja, un palillo aplicador estril
o un mondadientes. (No se deben hacer las pruebas serolgicas con crecimiento de medios
selectivos como agar MacConkey o agar DXL, porque puede generar resultados serolgicos
falsos.) Emulsione el crecimiento en cada gota de solucin salina fisiolgica en la lmina y
mezcle completamente para crear una suspensin moderadamente lechosa.
c) Aada una pequea gota de antisuero a una de las suspensiones; la segunda suspensin
sirve como control. Para conservar antisuero, se pueden usar volmenes muy pequeos,
por ejemplo 10 l; si no se dispone de micropipeta, se puede usar un asa curva de
inoculacin para dispensar pequeas cantidades de antisuero (vase la Figura 32). Por lo
regular, los volmenes aproximadamente iguales de antisuero y de suspensin del
crecimiento se mezclan, aunque el volumen de la suspensin puede llegar a ser el doble del
volumen del antisuero.
d) Mezcle bien la suspensin y el antisuero a modo de mecedora, mueva la lmina varias
veces para observar la autoaglutinacin (vase la Figura 2). Se ve mejor la aglutinacin si se
observa la lmina bajo una luz brillante y sobre un fondo negro. Si la reaccin es positiva, a
los 30 segundos o 1 minuto aparecer el precipitado (vase la Figura 42). Examine la
suspensin de salina cuidadosamente para estar seguro de su uniformidad y de que no
muestra grumos resultantes de la autoaglutinacin. Si hay autoaglutinacin, el cultivo se
caracteriza como rugoso y no puede ser serotipificado.
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Confirmacin de V. cholerae O139


Los aislamientos sospechosos de ser V. cholerae que reaccionan con antisuero O139 pero
no con el antisuero polivalente O1 deben enviarse a un laboratorio de referencia. La
confirmacin de V. cholerae O139 incluye las pruebas para la produccin de enterotoxina
colrica y la verificacin del antgeno O139 por aglutinacin en lmina con antisuero O139.
No se han identificado serotipos del serogrupo O139. Los ensayos de enterotoxinas (PCR,
IE y ADN) son complejos y no estn comprendidos en este manual. Hay pocos laboratorios
capaces de hacer estas pruebas, por lo que principalmente se lleva a cabo en laboratorios
internacionales de referencia. Despus de identificado el agente, se puede comenzar con
las pruebas para identificar los patrones de susceptibilidad a los antimicrobianos, si es que
se van a usar los ltimos para el tratamiento del clera.

Produccin de la toxina del clera para las pruebas de laboratorio


Las condiciones ideales para su produccin varan de acuerdo con el medio que se utilice.
En general, se ha encontrado que es mejor una temperatura de incubacin de 30 C que
una de 37 C para la produccin de toxina con V. cholerae de cualquier biotipo. Con las
cepas EI Tor, utilizando el medio de Craig, la mejor combinacin de tiempo y temperatura es
30 C durante 48 horas sin aeracin. Para las cepas del biotipo clsico, una temperatura de
30 C con agitacin vigorosa durante 48 horas permite la mejor produccin de la toxina. Si
se utilizan temperaturas de incubacin de 37 C se recomienda el medio AKI. Aunque este
medio permite la produccin de toxina del clera a 37 C, tiene el inconveniente de una vida
corta de almacenamiento, lo que exige su preparacin semanal. V. cholerae EI Tor cultivado
en medio AKI debe incubarse a 37 C durante 20 horas sin agitacin. EI medio AKI no se ha
evaluado con respecto a la produccin de toxina por las cepas del biotipo clsico.
Produccin de la toxina del clera
1) Los cultivos que se van a someter a prueba se siembran mediante estriacin en un medio
de plano inclinado no selectivo (como agar de infusin de corazn) y se incuban de 18 a 24
horas a una temperatura de 35 C a 37 C. Se incluyen cuatro cepas testigo (dos positivas y
dos negativas).
2) Se inoculan las cepas en 5 ml de medio de Craig en tubos de tapa de rosca de 16 X 125
mm. Se mantienen los tapones poco apretados y se incuban los tubos a 30 C durante 48
horas sin agitar.
3) Se centrifugan los tubos para sedimentar las clulas bacterianas, y se retira el
sobrenadante con una pipeta Pasteur. EI sobrenadante se almacena a 4 C hasta utilizarse.
Si el sobrenadante ha de almacenarse por ms de 7 das, se congela a -70 C.

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Deteccin de la toxina del clera


Resumen histrico de los mtodos de valoracin de la toxina del clera
1. Biovaloraciones
Mtodos que utilizan animales
Modelo de infeccin en conejo adulto (1950). Despus de la exteriorizacin y ligadura del
intestino delgado, se inyecta un sobrenadante acelular en cada asa ilegal y se mantiene
cerrado el abdomen durante 18 horas. Se realiza la eutanasia, se extirpa el intestino y las
asas se miden y se pesan para determinar la cantidad de lquido acumulado en virtud de la
estimulacin de la toxina. Los resultados se expresan como el volumen de lquido por la
longitud del asa intestinal.
Modelo de infeccin en conejo lactante (1955), los conejos lactantes de 7 das de edad se
infectan con el microorganismo mediante intubacin o por inyeccin directa intragstrica o
intraluminal (en el intestino delgado). Se mantienen bajo observacin para detectar diarrea
acuosa y muerte por deshidratacin. Otra opcin consiste en matarlos despus de un
periodo de incubacin de 7 horas.
La prueba en la piel del conejo, o valoracin del factor de permeabilidad vascular. En la
espalda afeitada de un conejo adulto joven se inyectan por va intradrmica un
sobrenadante acelular de un cultivo de V. cholerae y diluciones de antisueros, 18 h despus
se aplica una inyeccin intravenosa del colorante azul de Evans. El aumento de la
permeabilidad capilar mediado por la actividad de la toxina del clera conduce a la difusin
del colorante en la piel (reaccin de azulete), con induracin localizada en los sitios de
inyeccin. La zona de "azulete" se mide con relacin a un testigo negativo.
Mtodos de cultivo de tejidos
Los cultivos de clulas suprarrenales Y-1 de ratn (Y-1) y de ovario de hmster chino han
sido las pruebas modelo para la deteccin de la toxina del clera y de la toxina termolbil,
aunque tambin son sensibles otras Ineas celulares como las clulas vero de rin de
mono. Si la toxina del clera est presentes en los sobrenadantes de los cultivos
bacterianos agregados a las clulas, estimularan la produccin de adenilciclasa, la cual
eleva la concentracin intracelular de AMPc. Las cantidades aumentadas de este
compuesto dan por resultado una respuesta estructural que se puede observar al
microscopio (las clulas de ovario de hmster chino se alargan y las clulas Y-1 se
redondean). Las reacciones positivas pueden confirmarse mediante neutralizacin de los
efectos txicos en el cultivo celular con antisuero contra toxina del clera o con ganglisido
GM1. Para la prueba de la toxina, se coloca una suspensin de clulas Y-1 en placas de
microtitulacin (microplacas) de 96 pozos.

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FIGURA 10. La fotografa de la izquierda muestra el redondeo tpico de las clulas Y-I suprarrenales de
ratn causado por la presencia de la toxina del clera. Se muestran clulas Y-I normales en las fotografa de
la derecha.

2. Inmunovaloracin
ELISA
Para realizar la prueba GM1-ELlSA, se agregan los sobrenadantes del cultivo a los pozos de
la microplaca revestidos con ganglisido GM1. La toxina unida a los receptores GM1 se
detecta a continuacin agregando antisuero contra la toxina del clera, seguida por
anticuerpo antiglobulina conjugado con enzima. En lugar de utilizar GM1 para revestir la
placa, se puede recurrir a otro anticuerpo que se una a la toxina. Si se utiliza una microplaca
de 96 pozos para el estudio de la toxina, es factible probar 30 sobrenadantes por duplicado
en cada microplaca.

FIGURA 11. Diagrama del ensayo GM1-ELISA para la deteccin de la toxina del clera (TC).

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Cuadro 6. ELISA para la deteccin de la toxina del clera (TC)


Paso

Reactivo

Diluyente

Recubrimiento

GM1

Bloqueo

Albumina srica de
bovino (ASB)

PBS

Muestra

Sobrenadante
del cultivo

Bloqueo

Concentracin

Volumen/pozo

Tiempo de incubacin

100 l

De un da para otro

1%

150 l

30 minutos

Ninguno

Sin diluir

100 l

60 minutes

Albumina srica de
bovino (ASB)

PBS

1%

150 l

30 minutos

Anticuerpo

Anticuerpo contra
TC preparado en cabra

PBS con ASB al 0,1 %

1:2.000

100 l

60 minutes

Conjugado

IgG anticabra marcada con fosfatasa


alcalina

PBS con ASB al 0,1 %

1:5.000

100 l

60 minutes

Sustrato

p-nitrofenil fosfato disdico

Amortiguador de dietanolamina
H2O

1 mg/ml

100 l

10 a 20 minutos

Detener la reaccin

NaOH

H2O

3M

50 l

Ninguno

PBS
2 g/ml

La dilucin ptima de cada reactivo se determinara mediante titulacin.

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FIGURA 12. En el ensayo GM,-ELISA para la toxina del clera, la aparicin


de un color amarillo distintivo en los pozos de la microplaca indica una
reaccin positiva.

Coaglutinacin
La coaglutinacin de la enterotoxina termolbil de E. coli se realiza de manera rpida y
sencilla, y requiere poco equipo especializado y capacitacin del personal de laboratorio; sin
embargo, esta prueba nunca se ha usado para detectar toxina del clera a partir de
sobrenadantes de cultivo de V. cholerae O1.
Aglutinacin de ltex
En la prueba de aglutinacin de ltex se utilizan anticuerpos especficos contra la toxina del
clera o la termolbil de E. coli unidos a partculas de ltex. Requiere antisuero de alta
calidad o anticuerpos purificados, una preparacin adecuada de ltex y material de
laboratorio de fcil adquisicin.

FIGURA 13. Microplaca con resultados de la prueba VETRPLA (Oxoid


Limted). La muestra 1 es negativa; las muestras 2, 3, 4, 5 Y 6 son
positivas.

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3. Anlisis basados en el DNA


Sondas de DNA
Las secuencias especficas de DNA en el gen o los genes que codifican la toxina del clera
se han usado como sondas para detectar secuencias de DNA homologas en aislamientos
de V. cholerae toxignico. Primero se marca la sonda con una molcula de fcil deteccin,
como es un radioistopo, una enzima o un ligando, y entonces se hibrida al DNA del
microorganismo de prueba. La sonda solo hibrida aquellos fragmentos de DNA de
microorganismos que contengan secuencias homlogas. La sonda no hibridada se desecha,
y la sonda hibridada remanente se detecta por medio de una prueba especfica que la pone
en evidencia.

FIGURA 14. Resultados de la hibridacin con una sonda marcada


con digoxigenina para ctxA; el color morado oscuro indica una
reaccin positiva.

Reaccin en cadena de la polimerasa


En la PCR se utiliza la enzima DNA polimerasa para sintetizar o amplificar copias mltiples
de una secuencia especfica de DNA (ampliacin), la cual puede entonces detectarse en un
gel de agarosa o con sondas de DNA. La ampliacin de DNA se define por la localizacin de
dos oligonucletidos cortos y especficos de DNA que sealan la secuencia de inters y son
utilizados como iniciadores por la DNA polimerasa. Al igual que las sondas de DNA, el
blanco de la PCR es un gen de virulencia, o una secuencia de DNA exclusivo de un
microorganismo patgeno. Algunas pruebas de PCR pueden amplificar los segmentos de
DNA directamente de las muestras fecales, alimentarias o ambientales; as, se puede
determinar la presencia de un microorganismo en una muestra sin cultivarlo.

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Producto de PCR - 564


pb

FIGURA 15. Localizacin de los iniciadores y tamao del fragmenta de DNA amplificada en la prueba de la
PCR para la deteccin de ctxA

ABCDEFGHIJKL

564-bp

FIGURA 16. Gel de agarosa con resultados de una prueba PCR tpica de la toxina del clera. Las bandas
A, C, D, E, F, cepas de prueba positivas; las bandas B, J, cepas de prueba negativas; bandas G, K, testigos
positivos; bandas H, I, testigos negativas; banda L. escalera de ADN de 1 kb.

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EI Cuadro 7 resume las caractersticas importantes de algunas de las pruebas ms comunes que se utilizan para la deteccin de la toxina del clera.
Cuadro 7. Mtodos comunes para la deteccin de la toxina del clera
Prueba

Sensibilidad por ml

Tipo de prueba

Objetivo especfico de la prueba

30 ng

Biovaloracin

Estimular la acumulacin de lquido

Sobrenadante del cultivo

Biovaloracin

Estimular la acumulacin de lquido

Cultivo en caldo o sobrenadante del cultivo

0,1 a 3,5 ng

Biovaloracin

Factor de permeabilidad

Sobrenadante del cultivo

Clulas suprarrenales Y1 de ratn

10 pg

Biovaloracin

Acumulacin de AMPc

Sobrenadante del cultivo

Clulas de ovario de hmster chino

10 pg

Biovaloracin

Acumulacin de AMPc

Sobrenadante del cultivo

ELISA GM 1

10 pg

Inmunitaria

Subunidad B

Coaglutinacin

50 ng

Inmunitaria

Subunidad B

1 a 2 ng

Inmunitaria

Subunidad B

Sondas de DNA

Detecta el gen ctx

Gentica

Gen ctx

DNA (improntas de colonias)

PCR

Detecta el gen ctx

Gentica

Gen ctx

DNA (lisado de la clula en bruto)

Asa ileal de conejo

Valoracin en conejo lactante

Prueba en la piel del conejo

Aglutinacin inversa pasiva en ltex

250 a 500 ng

Sensibilidad para la deteccin de la toxina del clera utilizando antisuero contra la enterotoxina termolbil de E. coli

Subunidad 8 de la molcula de la toxina del clera.

Muestra estudiada

Sobrenadante del cultivo

Lisados del cultivo

Sobrenadante del cultivo

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Inmunidad
Las defensas no especficas tales como la acidez gstrica, la motilidad intestinal y la mucosa
intestinal son importantes en la prevencin de la colonizacin por V. cholerae . Por ejemplo,
en las personas que carecen de acidez gstrica (gastrectoma o aclorhidria por
desnutricin), la tasa de ataque del clera es ms elevada. Un ataque de clera va seguido
de inmunidad contra la reinfeccin, pero se desconoce la duracin y el grado de inmunidad.
El estado inmune se ha asociado con IgG dirigida en contra de la LPS de la pared celular y
con la produccin de IgA por los linfocitos en las reas subepiteliales del tracto
gastrointestinal. Despus de la infeccin se presentan en el suero anticuerpos similares pero
slo duran algunos meses. Los anticuerpos vibriocidas en el suero (ttulo 1:20) se han
relacionado con proteccin contra la colonizacin y la enfermedad. La presencia de
anticuerpos antitoxina no se ha relacionado con proteccin.

Tratamiento
El desenlace del clera depende de equilibrar el lquido diarreico y las prdidas inicas con
un adecuado reemplazo de lquidos y electrlitos. Esto se logra mediante la administracin
oral, intravenosa, o ambas, de soluciones con glucosa con concentraciones casi fisiolgicas
de sodio y cloro y concentraciones mayores a las fisiolgicas de potasio y bicarbonato. Hay
disponibilidad de las formulaciones exactas en forma de paquetes secos a los que se aade
un volumen especificad de agua. El reemplazo oral, en especial si se inicia de manera
puntual, es suficiente para todos los casos, a excepcin de los ms graves, y ha reducido la
mortalidad del clera en forma sustancial. La terapia antimicrobiana representa un papel
secundario al del reemplazo de lquidos. La doxiciclina reduce la duracin de la diarrea y la
magnitud de la prdida de lquidos. El trimetoprim-sulfametoxazol, eritromicina y
ciprofloxacino son alternativas para uso en nios y mujeres embarazadas. Los
antimicrobianos tienen un rol secundario en el tratamiento del clera, ayudan a reducir el
volumen de las deposiciones, acortan el perodo de sntomas y excrecin bacteriana. La
cepa causante del actual brote en Hait ha demostrado ser susceptible a doxiciclina y
tambin a ciprofloxacino y macrlidos.
Cuadro 8. Tratamientos Farmacolgicos para el clera
Tratamiento de eleccin:
Adultos:

Doxiciclina 300 mg. oral por una vez.

Nios menores de 8 aos:

Azitromicina 10 mg/Kg. por va oral por 3 das

Nios mayores de 8 aos:

Doxiciclina 4 mg/ kg (mx 300 mg) por va oral por 1 vez

Embarazadas:

Azitromicina 500 mg. por va oral por 3 das

Tratamiento alternativo:
Adultos:

Ciprofloxacino 1 gr. por va oral por una vez


Azitromicina 500 mg. por va oral por 3 das

Nios:

Ciprofloxacino en dosis nica de 20mg/Kg de peso

30

GNERO VIBRIO

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Epidemiologa, prevencin y control


Ocurrieron seis pandemias (epidemias en todo el mundo) de clera entre 1817 y 1923,
causadas muy posiblemente por V. cholerae O1 del biotipo clsico y en gran parte se
originaron en Asia, por lo general en el subcontinente indio. La sptima pandemia comenz
en 1961 en las Islas Clebes de Indonesia, con diseminacin a Asia, Medio Oriente, y frica.
Esta pandemia fue causada por V. cholerae biotipo El Tor. La sptima pandemia, que
comenz en 1991, se propag a Per y luego a otros pases de Sudamrica y
Centroamrica. Tambin se presentaron casos en frica. En esta pandemia millones de
personas han padecido clera. Hay quienes consideran que el clera causado por la cepa
de serotipo O139 es la octava pandemia que comenz en el subcontinente Indio en 1992 a
1993 con propagacin a Asia. La enfermedad ha sido infrecuente en Norteamrica desde
mediados de 1800, pero existe un foco endmico en la costa del Golfo de Louisiana y
Texas.
El clera es endmico en India y en el sureste de Asia. Desde estos centros, es
transportado por las vas de embarque, rutas de comercio y rutas de migracin de
peregrinos. La enfermedad se disemina por el contacto de individuos con la enfermedad
leve o inicial y por el agua, los alimentos y las moscas. En muchos casos, slo 1 a 5% de las
personas susceptibles expuestas presentan la enfermedad. El estado de portador pocas
veces dura ms de tres a cuatro semanas y no est clara la importancia de los portadores
en la transmisin de la enfermedad. Los vibrios sobreviven en agua hasta por tres semanas.
V. cholerae vive en medios acuticos y tales ambientes son el reservorio natural de los
vibrios. V. cholerae vive adherido a algas, coppodos y conchas de crustceos. Puede
sobrevivir por aos y multiplicarse, pero cuando las condiciones no son adecuadas para su
multiplicacin puede volverse latente. El control se basa en la educacin y en la mejora de
las condiciones sanitarias, sobre todo del alimento y del agua. Se debe aislar a los
pacientes, desinfectar sus excretas y realizar seguimiento a los contactos. La
quimioprofilaxis con frmacos antimicrobianos puede ser til. La inyeccin repetida de una
vacuna que contenga lipopolisacridos extrados de vibrios o suspensiones densas de Vibrio
puede conferir una proteccin limitada a las personas con una exposicin intensa (p. ej.,
contactos familiares) pero no es una medida eficaz de control epidmico.

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OTROS VIBRIOS
1. Vibrio parahaemolyticus
Vibrio parahaemolyticus es una bacteria halfila produce gastroenteritis aguda tras la
ingestin de mariscos contaminados como pescado crudo o crustceos como las ostras. Es
la causa principal de diarrea en Japn, donde el pescado crudo se come en grandes
cantidades, pero es un patgeno poco frecuente en Estados Unidos, aunque ha habido
varios brotes en cruceros por el Caribe. No se conoce demasiado su patogenia, excepto que
secreta una enterotoxina similar al colergeno y, a veces, se da una invasin limitada.
Tras un periodo de incubacin de 12 a 24 horas, se presentan nusea y vmito, clicos
abdominales, fiebre y diarrea lquida a sanguinolenta. A menudo se detectan leucocitos
fecales. La enteritis tiende a desaparecer en forma espontnea en un lapso de uno a cuatro
das sin otro tratamiento que no sea el restablecimiento del equilibrio hidroelectroltico. La
enfermedad es autolimitada y dura unos 3 das. Vibrio parahaemolyticus se distingue del V.
cholerae principalmente por el crecimiento en NaCl: Vibrio parahaemolyticus crece en una
solucin de NaCl al 8 % (la que corresponde a un microorganismo marino), mientras que el
V. cholerae no puede crecer. No existe un tratamiento especfico indicado, porque la
enfermedad es relativamente leve y autolimitada. La enfermedad puede evitarse con una
buena refrigeracin y con la coccin de los mariscos.

FIGURA 17. Vibrio parahaemolyticus

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2. Vibrio Vulnificus
Vibrio vulnificus puede causar infecciones graves
de

heridas,

bacteriemia

probablemente

gastroenteritis. Es una bacteria de estuarios, de


vida libre que existe en Estados Unidos en el
Atlntico y las costas del Pacfico y sobre todo en
la

costa

del

Golfo.

Se

han

comunicado

infecciones en Corea y el microorganismo puede


tener una distribucin mundial. Es muy posible
que V. vulnificus se encuentre en ostiones, sobre
FIGURA 6. Vibrio Vulnificus

todo en los meses clidos. La bacteriemia sin un


foco infeccioso ocurre en personas que han consumido ostiones infectados o en alcohlicos
o hepatpatas. Las heridas pueden infectarse en personas normales o en inmunodeprimido
s que entran en contacto con agua donde est presente la bacteria. La infeccin suele
evolucionar con rapidez, con la aparicin de una enfermedad grave. Casi 50% de los
pacientes con bacteriemia fallece. Las infecciones de las heridas pueden ser leves pero a
menudo evolucionan con rapidez (en el curso de algunas horas) presentndose lesiones
cutneas ampollosas, celulitis y miositis con necrosis. Varios de los primeros decesos en
Louisiana y Texas despus del huracn Catrina fueron ocasionados por Vibrio vulnificus.
Dado el avance rpido de la infeccin, a menudo es necesario tratarla con antibiticos
apropiados antes que se confirme la causa mediante cultivo. El diagnstico se establece con
el cultivo del microorganismo en medios estndares de laboratorio; TCBS es el medio
preferido para los coprocultivos, donde la mayor parte de las cepas produce colonias color
verde-azuloso (sacarosas negativas).
La tetraciclina al parecer es el antimicrobiano de eleccin para la infeccin por V. vulnificus.
Ciprofloxacina tambin puede ser eficaz basndose en la actividad in vitro.

3. Otros vibrios
Otros vibrios diversos tambin producen enfermedad en el ser humano: Vibrio mimicus
produce diarrea tras la ingestin de mariscos mal cocidos, sobre todo ostiones crudos. Vibrio
hollisae y Vibrio fluvialis tambin producen diarrea. Vibrio alginolyticus es causa de
infecciones oculares, ticas o de heridas tras la exposicin al agua de mar. Vibrio damsela
tambin produce infecciones de heridas. Otros vibrios son causas muy infrecuentes de
enfermedad en el ser humano.

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