PRACTICA No.

12: Antibiograma

I. Antecedentes
El antibiograma es un mtodo de estudio in vitro del comportamiento de los antimicrobianos frente a
los agentes infecciosos. Tiene como finalidad proporcionar informacin til para la iniciacin y
marcha de la teraputica anti infecciosa (2).
La informacin que proporciona el antibiograma es valiossima, aunque no basta para el
establecimiento de una terapia adecuada si se considera aisladamente y se aplica sin tener en cuenta
las peculiaridades del antimicrobiano, las caractersticas clnicas del proceso infeccioso y las del
propio paciente. El estudio estadstico del antibiograma permite conocer la tendencia de sensibilidad
de cada especie bacteriana, su coeficiencia de benignidad frente a los antimicrobianos utilizados y su
ndice de especificidad, que traduce la eficacia de cada antimicrobiano desde el punto de vista
teraputico y epidemiolgico (2).
A. Mtodo de difusin en agar
Aunque est sujeto a numerosos errores, es el de eleccin en el de eleccin en el laboratorio por su
sencillez de ejecucin, su exacta reproduccin, la facilidad de lectura y la fiabilidad de sus resultados.
Esta reconocido internacionalmente (FDA, ICS, NCCLS, CDC).
Consiste en inocular una placa de agar con el microorganismo problema y colocar sobre la superficie
del medio, discos que contienen determinadas concentraciones de los antimicrobianos a ensayar. El
antibitico difunde por el medio y despus de un tiempo de incubacin determinado, el
microorganismo se desarrolla en toda la placa excepto alrededor de los dicscos cuya concentracin
de antimicrobiano es inhibitoria. El dimetro del halo de inhibicin del crecimiento expresa la
sensibilidad, moderadamente sensibles o resistencia del microorganismo; su tamao est influenciado
por el grosos del medio de cultivo, la concentracin del inculo, la carga del disco y otros factores,
por lo que habr que tener ciertas precauciones en la realizacin de la tcnica (1).
1. Medio de cultivo
Se recomienda el medio de Mueller-Hinton, con determinados ndices de calcio y magnesio (mnimo
de 60mcg/ml de calcio y 20 mg/ml de magnesio), pues toda variacin de importancia implica errores
de lectura significativos; el pH debe mantenerse entre 7.2 y 7.4. Para bacterias exigentes se adiciona
un 5% de sangre: Mueller-Hinton sangre y Mueller-Hinton chocolate. El medio no debe contener
sustancias antagonistas (3).
Estos medios se reparten en placas de Petri, a razn de 25ml para placas de 90mm y 60ml para placas
de 140mm. En todo caso, el espesor de la capa de agar debe ser de 4mm (1).
2. Inculo
La preparacin del inculo puede hacerse a partir de un cultivo puro en medio lquido o bien de
colonias aisladas en medio slido. Conviene asegurarse de la pureza del cultivo y por ese se utilizan
colonias aisladas.
La densidad del inculo es uno de los factores que ms influye en el tamao de los halos de inhibicin.
Cuando se prepara, debe estandarizarse para que ofrezca un crecimiento denso pero no totalmente

confluente. Un inculo muy denso permitira que las colonias crecieran ocupando toda la superficie
del medio; un inculo pobre tampoco sera adecuado pues las colonias dejaran claros entre s. Lo
ideal es un crecimiento semiconfluente (2).
En general la densidad microbiana del inculo es de aproximadamente 107-108 UFC/ml o de turbidez
equivalente al punto 0.5 de la escala de McFarland (0.5ml de cloruro de bario 0.048M aadidos a
99.5ml de cido sulfrico 0.36M). Este inculo se consigue efectuando diluciones a partir de un
cultivo en caldo en fase estacionaria de crecimiento y ajustando la turbidez (2).
3. Mtodo de Kirby-Bauer
Consiste en introducir un hisopo en el inculo ajustado, eliminando el exceso presionando
suavemente sobre las paredes del tubo e inocular las placas por estriacin masiva. Antes de colocar
los discos se deja secar la superficie, introduciendo la placa en a incubadora hasta 15 minutos como
mximo (3).
4. Discos
Se utilizan discos de papel absorbente grueso de 6mm de dimetro, que contienen los distintos
antibiticos desecados y a la concentracin conveniente. Estos discos ya listos para su empleo, son
preparados por distintas casas comerciales con la concentracin expresada en mcg/ml o en unidades
internacionales (UI), atenindose a las normas establecidas.
Es conveniente efectuar con cierta periodicidad un control de calidad de los discos para verificar la
actividad de los antibiticos. Este control se realiza con cepas patrn: Escherichia coli ATCC 25922,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 (2)
5. Lectura
Como cada antimicrobiano difunde a una velocidad distinta y la difusin est influenciada por muchos
factores y eventualidades, no es de capital importancia dar una precisin matemtica de las zonas de
inici sino que es correcto valorar stas sencillamente por el dimetro del halo, que suele ser distinto
para cada antibitico y cada microorganismo. Si se quiere expresar el valor de la CMI (concentracin
mnima inhibitoria) es preciso medir exactamente la longitud del halo de inhibicin con un comps o
regla. Para ello, los resultados de un mnimo de 100 cepas susceptibles al antibitico se colocan sobre
un sistema de coordenadas, se valoran matemticamente y se obtiene as la lnea de regresin, con la
que se puede deducir la CMI aproximada, sabiendo la amplitud del halo de inhibicin (2).

II. Materiales
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

Cultivo bacteriano de Staphylococcus aureus y Escherichia coli

Agar tripticasa soya (TS) o infusin cerebro corazn (BHI)
Placas de agar Meller Hinton (MH)
Solucin salina estril (SS)
Estndar 0.5 de McFarland*
Discos comerciales de antibiticos
Hisopos estriles
Pinzas de laboratorio
Asa de platino
Incubadora a 37C

11. Regla o calibrador (3)

*Preparacin del Estndar de McFarland: aadir 0.05 mL de BaCl, 0.048 M (1.75% p/v de BaCl
2H2O2) a 9.95 mL de H2SO4 0.36N (1% v/v)
III. Procedimiento
1. Suspender una colonia del agar TS en solucin salina hasta lograr la turbidez equivalente al
estndar 0.5 de McFarland
2. Utilizando un hisopo de algodn estril, sumergirlo en el inculo y eliminar el exceso
presionndolo sobre la pared interna del tubo que lo contiene y por encima del nivel del caldo
de cultivo.
3. Inocular la superficie de una placa de agar de Meller-Hinton con el hispo pasndolo
uniformemente por toda la superficie en tres direcciones. Por ltimo, pasar el hisopo por el
reborde de la placa de agar.
4. Dejar secar por 5 minutos
5. Colocar los discos de antibiticos sobre la superficie del agar utilizando unas pinzas estriles
y apretndolos suavemente sobre la superficie del agar. Los discos no deben estar a menos
de 15mm de los bordes de la placa y lo bastante separados entre ellos para que no se
superpongan las zonas de inhibicin (aproximadamente 20mm).
6. Dejar las placas 15min. A temperatura ambiente para que comiencen a difundir los
antibiticos
7. Incubar la placa en posicin invertida a 37C durante 18.24horas
8. Medir los dimetros de las zonas de inhibicin con una regla o un calibrador utilizando luz
refleja sobre fondo negro
Interpretacin: Los dimetros de los halos de inhibicin se traducen a las categoras de resitente
intermedio (I), moderadamente sensible (MS) o sensible (S), de acuerdo a los criterios interpretativos
de la CLSI (3).

IV. Cuestionario
1. Cul es el medio de cultivo recomendado por la FDA y el NCCLS para la realizacin del
antibiograma por el mtodo de difusin en agar? Si este medio de cultivo no permitiera el desarrollo
de un determinado microorganismo, Qu medio podra utilizar?
2. Mencione otros mtodos para determinar la resistencia o susceptibilidad antimicrobiana cualitativa
y cuantitativamente.
3. Qu es la CLSI? y por qu se relaciona con los antibiogramas?

V. Bibliografa
1. Gamazo, C., Snchez, S., Camacho, A.I (2013).
Microbiologa basada en la
experimentacin. Elsevier Health Sciences. Barcelona, Espaa.
2. Garca, P., Paredes, F., & Fernndez, M. (1994). Microbiologa Clnica Prctica.
Publicaciones UCA. Espaa.

3. Leiva, J. (1999). Determinacin de la sensibilidad de una bacteria a agentes antimicrobianos:

antibiograma. Manual prctico de Microbiologa (2a. Ed.) Barcelona, Espaa.

Anotaciones