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Divisin Toxicologa
RESUMEN
FUNDAMENTOS:
LOS
COMPUESTOS ORGANOFOSFORADOS
(ver guin de prctica sobre hidrlisis qumica de organofosforados)
3
3.1
Segn la clasificacin actual de la IUB las enzimas que hidrolizan compuestos organofosforados
(OPs) se hayan encuadradas en el grupo 3.1.8 que se denomina hidrolasas de tristeres fosfricos o
fosfotriesterasas.
Normalmente las fosfotriesterasas se nombran de acuerdo con el substrato que hidrolizan. En la
siguiente figura se muestran las reacciones catalizadas por algunas fosfotriesterasas conocidas como
son la DFPasa, tabunasa, paraoxonasa y diclorovos (DDVP) hidrolasa. La figura muestra como la
hidrlisis del OP da lugar a la liberacin del grupo saliente (F -, CN-, p-nitrofenol y metanol
respectivamente) y a la generacin de un residuo fosfrico.
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O
(i
C3H7O)2 P F
DFPasa
O
(i
C3H7O)2 P OH
FH
DFP
C2H5O
C2H5O O
P CN
Tabunasa
O
P OH
CNH
(CH3)2N
(CH3)2N
TABUN
O
(C2H5O)2
P O
NO2
Paraoxonasa
(C2H5O)2
P OH
NO2
HO
PARAOXON
CH3O
O
P
CH3O
3.2
OCH
DDVP
CCl2
DDVPasa
CH3O
O
P
OCH
CCl2
HO
CH3OH
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Divisin Toxicologa
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Divisin Toxicologa
3.5
Se ha sugerido que el calcio puede desempear dos papeles en la hidrlisis de paraoxon por
paraoxonasa. El Ca2+ sera requerido principalmente para mantener la conformacin del centro
activo y, el calcio libre (o dbilmente asociado con la fosfotriesterasa) facilitara la retirada del
residuo dietilfosfato del centro activo de la enzima, probablemente a travs de la polarizacin del
enlace P=O del paraoxon.
La actividad paraoxonasa de plasma e hgado de rata dependi de la presencia de Ca 2+ en el medio.
Cuando el catin fue retirado del medio mediante incubacin con cido etilendiaminotetractico
(EDTA) la actividad result inhibida. La reactivacin de la enzima por adicin de Ca 2+ tras
inhibicin por EDTA fue un proceso dependiente de tiempo, los porcentajes de recuperacin de
actividad disminuyeron cuando aument el tiempo transcurrido entre la inhibicin y la adicin de
Ca2+, lo que sugiere la necesidad del Ca2+ para el mantenimiento de la conformacin de la protena.
Resultados similares han sido descritos para la paraoxonasa de hgado humano.
3.7
Otros cationes
La fosfotriesterasa de Pseudomonas diminuta posee dos tomos de Zn2+ unidos a su centro activo
que resultaron ser necesarios para la actividad cataltica. Estos tomos pudieron ser sustituidos por
Mn2+, Co2+, Ni2+, Cd2+ o Mn2+ sin una prdida significativa de actividad. La actividad
fosfotriesterasa de esta bacteria result inhibida tras la incubacin con agentes quelantes. La
actividad se recuper tras la adicin de hasta 10 equivalentes estequiomtricos metal/protena.
En algunas ocasiones los cationes resultan ser inhibidores de las actividades fosfotriesterasas. En
plasma humano, las actividades hidrolizantes de paraoxon y diclorovos (O,O-dimetil
2,2-diclorovinil fosfato) fueron inhibidas por CdSO4, HgCl2 y AgNO3 y EDTA, aunque dichas
actividades fueron restablecidas adicionando concentraciones de Ca 2+ equivalentes a las de EDTA.
El Cu(SO4) a la concentracin 1 mM fue un fuerte inhibidor (64%) de una parathion hidrolasa de
origen bacteriano. El ion Zn2+ a la concentracin de 0.4 mM inhibi hasta un 69% una
fosfotriesterasa de bacteria halfila.
Universidad Miguel Hernndez. Divisin de Toxicologa. Edificio Vinalop
Avenida de la Universidad s/n 03202. ELCHE (ALICANTE). SPAIN
Tel: (+34)965222157; Fax: (+34)966658511
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La actividad hidrolizante de paraoxon en plasma humano present dos poblaciones fenotpicas bien
diferenciadas, la de tipo A (baja actividad) y la de tipo B (alta actividad), cuya distribucin es de
aproximadamente un 50% de ambos tipos en raza caucasiana. La actividad tipo A result poco
estimulada por NaCl 1 M mientras que la actividad tipo B fue fuertemente estimulada por esta alta
concentracin de sal. La actividad paraoxonasa de ambas poblaciones resultaron estimuladas por
fosfatidilcolina. Este compuesto aument la Vmax sin alterar la Km de la reaccin.
3.8
Debido a que algunas fosfotriesterasas son inhibidas por reactivos bloqueantes de grupos tioles se
ha sugerido que estas protenas podran presentar residuos de cistena en su centro activo.
Tambin se ha descrito el efecto inhibidor de determinadas cetonas como la 2,5-hexanodiona o
metilvinilcetona y sus homlogos.
El OP mipafox result poseer un efecto inhibidor (70-90%) en algunas fosfotriesterasas bacterianas.
3.9
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de OPs es el hecho de que en estudios morfolgicos con ovejas tratadas con haloxon se observ que
aquellos animales con alta actividad fosfotriesterasa no mostraban ningn signo de polineuropata
retardada. Adems estas enzimas han sido utilizadas con xito en el laboratorio para la profilaxis de
intoxicaciones por OPs.
Se han realizado estudios sobre la posible aplicacin biotecnolgica de fosfotriesterasas purificadas
e inmovilizadas en trietil agarosa para la eliminacin de residuos de OPs en agua, para la deteccin
de la presencia de stos, e incluso para la destruccin de arsenales de armas qumicas. Aplicando
este sistema a la fosfotriesterasa de Pseudomonas diminuta se consigui que la enzima inmovilizada
presentara unos parmetros cinticos comparables a los de la enzima en estado soluble aunque la
efectividad de la hidrlisis fue menor en la enzima inmovilizada. A pesar de ello, el hecho de que se
pudo alcanzar altas concentraciones de enzima disponible aumentando la superficie de nailon
permiti que se pudieran hidrolizar altas cantidades de substratos.
4
OBJETIVOS
4.1
Objetivo general
Objetivos especficos
(C 2H5O)2 P O
NO2
Paraoxonasa
(C 2H5O)2 P OH
HO
NO2
PARAOXON
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6
PRECAUCIONES
Deben respetarse las normas generales de seguridad aplicables en cualquier laboratorio y puestos de
trabajo y las normas especficas indicadas en el laboratorio en donde se realiza la actividad.
En casos de duda debe siempre consultar al profesor o responsable del laboratorio. Debe informar
de cualquier anomala que observe, rotura de material o situaciones de peligro para los dems
usuarios.
7
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
7.1
10
20
30
40
50
60
70
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
Resultados experimentales
Absorbancia de los Patrones
0 M
10 M
(Blanco)
1
0
0,248
Pendiente del modelo lineal (y = ax)
Coeficiente regresin de lineal (R2)
Medida N
20 M
30 M
40 M
50 M
60 M
70 M
0,515
0,754
0,978
1,208
Y=0,0235X
R2 = 0,9941
1,406
1,569
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7.2
Reactivacin por Ca2+ de la actividad paraoxonasa de suero de conejo inhibida por
EDTA
Se inhibir la actividad paraoxonasa de suero de conejo incubando la enzima con EDTA a
diferentes tiempos (0, 5 y 30 min). Tras ello, se tratar de reactivar la enzima adicionando Ca 2+
suficiente para neutralizar el EDTA. Inicie el programa de tiempos que se muestra a continuacin
en tres tubos (tubo 1, 2 y 3) mantenindolos a 37C.
Programa de Tiempos 1 (Temperatura = 37 C), = 400 nm
Tiempo (min)
Tubo
Accin
1, 2 y 3 Aadir 100 L suero conejo (1:10) Contiene la enzima
0
1
Aadir 100 L EDTA 5 mM
0+
1
Aadir 800 L Ca2+ 5 mM
2
2
Aadir 100 L EDTA 5 mM
4
3
Aadir 100 L EDTA 5 mM
7
2
Aadir 800 L Ca2+ 5 mM
10
1
Aadir 1000 L paraoxon 4 mM Sustrato
11
1
Medir Absorbancia 1
17
2
Aadir 1000 L paraoxon 4 mM
18
2
Medir Absorbancia 1
26
1
Medir Absorbancia 2
33
2
Medir Absorbancia 2
34
3
Aadir 800 L Ca2+ 5 mM
44
3
Aadir 1000 L paraoxon 4 mM
45
3
Medir Absorbancia 1
60
3
Medir Absorbancia 2
Resumen de Tiempos
Tiempo (min)
Tubo
1
2
3
EDTA
0
2
4
Adicin
Ca2+
0+
7
34
Datos Experimentales
Muestra (Tris 50 mM pH 8.0)
Pxn
10
17
44
Medida de Absorbancia
1
2
11
26
18
33
45
60
Absorbancia
400 nm, T = 37C
2+
1
0,721
0,743
0,728
2
0,936
0,932
0,876
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7.3
Absorbancia
400 nm, T = 37C
1
0,781
0,745
2+
2
1,113
0,914
7.4
Efecto de reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de
suero de conejo
Se determinar cmo afecta a la actividad paraoxonasa la incubacin a 37 C de suero de conejo
con p-hidroximercuriobenzoato 1 mM durante 60 minutos.
Datos Experimentales
Muestra (Tris 50 mM pH 8.0)
MB C (Ca2+ 0.5 mM en Tris 50 mM pH 8.0)
MB T (p-OHMB 1 mM en Ca2+ 0.5 mM Tris 50 mM pH 8.0)
7.5
Absorbancia
400 nm, T = 37C
1
2
0,764
1,110
0,767
0,939
Absorbancia
400 nm, T = 37C
1
0,821
0,780
2
1,061
0,767
10
__________________________________________________________________
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Programa de Tiempos 2 (Temperatura = 37 C), = 400 nm
Tiempo (min)
Tubo
Accin
Cu2+ C y T
Aadir 100 L suero conejo (1:10)
Cu2+ C y T
Aadir 2000 L Tris 50 mM pH 8.0
2+
0
Cu C
Aadir 600 L Tris 50 mM pH 8.0
0+
Cu2+ C
Aadir 300 L Ca2+ 5 mM
2+
2
Cu T
Aadir 300 L Ca2+ 5 mM
2+
2+
Cu T
Aadir 600 L Cu2+ 5 mM
20
20+
22
22+
MB C y T
MB C y T
MB C
MB C
MB T
MB T
30
30+
32
32 +
40
41
42
43
56
58
EDTA C y T
EDTA C y T
EDTA C
EDTA C
EDTA T
EDTA T
EDTA C
EDTA C
EDTA T
EDTA T
EDTA C
EDTA T
60
61
62
63
76
78
Cu2+ C
Cu2+ C
Cu2+ T
Cu2+ T
Cu2+ C
Cu2+ T
80
81
82
83
96
98
MB C
MB C
MB T
MB T
MB C
MB T
11
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7.6
Efecto de la especie sobre la actividad paraoxonasa
Se comparar la actividad paraoxonasa en suero de conejo y de pollo.
Programa de Tiempos 3 (Temperatura = 37 C), = 400 nm
Tiempo (min)
Tubo
Accin
Pollo
Aadir 100 L suero pollo (1:10)
Pollo
Aadir 300 L Ca 5 mM
Pollo
Aadir 2600 L Tris 50 mM pH 8.0
Conejo
Aadir 100 L suero conejo (1:10)
Conejo
Aadir 300 L Ca 5 mM
Conejo
Aadir 2600 L Tris 50 mM pH 8.0
0
Pollo
Aadir 1000 L de paraoxon 4 mM
1
Pollo
Medir Absorbancia
2
Conejo
Aadir 1000 L de paraoxon 4 mM
3
Conejo
Medir Absorbancia
6
Pollo
Medir Absorbancia
8
Conejo
Medir Absorbancia
11
Pollo
Medir Absorbancia
13
Conejo
Medir Absorbancia
16
Pollo
Medir Absorbancia
18
Conejo
Medir Absorbancia
21
Pollo
Medir Absorbancia
23
Conejo
Medir Absorbancia
26
Pollo
Medir Absorbancia
28
Conejo
Medir Absorbancia
31
Pollo
Medir Absorbancia
33
Conejo
Medir Absorbancia
36
Pollo
Medir Absorbancia
38
Conejo
Medir Absorbancia
41
Pollo
Medir Absorbancia
43
Conejo
Medir Absorbancia
46
Pollo
Medir Absorbancia
48
Conejo
Medir Absorbancia
Resultados
Tiempo
1
6
11
16
21
26
31
36
41
46
Pollo
[p-nitrofenol]
Absorbancia
C (M)
0,683
29,064
0,670
28,511
0,680
28,936
0,675
28,723
0,658
28
0,673
28,638
0,711
30,255
0,658
28
0,740
31,489
0,681
28,979
Tiempo
1
6
11
16
21
26
31
36
41
46
Conejo
[p-nitrofenol]
Absorbancia
C (M)
0,691
29,404
0, 814
34,638
0,976
41,532
1,055
44,894
1,165
49,574
1,288
54,809
1,419
60,383
1,515
64,468
1,590
67,659
1,645
70
12
__________________________________________________________________
Divisin Toxicologa
INFORME FINAL
Elabore un informe final sobre el trabajo realizado, incluyendo las respuestas a las cuestiones que se
plantean a continuacin. Aada cualquier otro comentario que considere pertinente.
(1)
(2)
Represente en una grfica de barras las actividades enzimticas de las muestras control y
ensayadas en presencia de Cu2+ 1 mM. Cul es el efecto del Cu2+? Cmo podra justificar
estos resultados?
Muestra
Cu2+ C
Cu2+ T
Muestra
Cu2+ C
Cu2+ T
Absorbancia
1
2
0,781
1,113
0,745
0,914
Act enzimtica
C2-C1
C*4/15
14,128
3,767
7,192
1,917
C. (C = Abs/0,0235)
1
2
33,234
47,362
31,702
38,894
Act. Relativa
Act.enz/ 10-2
376,7
191,787
Represente en una grfica de barras las actividades enzimticas de las muestras control y
ensayadas en presencia de p-hidroximercuriobenzoato 1 mM. Cul es el efecto del phidroximercuriobenzoato? Cmo podra justificar estos resultados?
Muestra
MB C
MB T
Muestra
MB C
MB T
Absorbancia
1
2
0,764
1,110
0,767
0,939
Act enzimtica
C2-C1
C*4/15
14,723
3,926
7,319
1,952
C. (C = Abs/0,0235)
1
2
32,511
47,234
32,638
39,957
Act. Relativa
Act.enz/ 10-2
392,613
195,173
El Mg +2 se une al grupo tiol de la enzima e impide la actividad , deduciendo que hay una
cisteina SH. No debera producirse actividad.
Universidad Miguel Hernndez. Divisin de Toxicologa. Edificio Vinalop
Avenida de la Universidad s/n 03202. ELCHE (ALICANTE). SPAIN
Tel: (+34)965222157; Fax: (+34)966658511
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Divisin Toxicologa
(4)
Represente en una grfica de barras las actividades enzimticas de las muestras control y
ensayadas en presencia de EDTA 1 mM. Cul es el efecto del EDTA sobre la actividad
paraoxonasa de suero de conejo? Cmo se justifican estos resultados?
Muestra
EDTA C
EDTA T
Muestra
EDTA C
EDTA T
(5)
Absorbancia
1
0,821
0,780
2
1,061
0,767
Act enzimtica
C2-C1
C*4/15
10,213
2,723
-0,553
-0,147
C. (C = Abs/0,0235)
1
2
34,936
45,149
33,191
32,638
Act. Relativa
Act.enz/ 10-2
272,346
-14,746
El EDTA inhibe la enzima, debido a que se une al Ca+2, necesario para unir el sustrato a la
enzima.
Hay dos tipos de calcio uno de alta afinidad y que facilita la cantividad en el centro activo y
que es secuestrado por el EDTA y otro que mantiene la estructura tridimensional de la
enzima, si es secuestrado por el EDTA , la enzima se desnaturaliza.
Representa en una misma grfica la concentracin de p-nitrofenol producido como
consecuencia de la actividad paraoxonasa cuando se utiliza suero de pollo y conejo. Cmo
podra justificar estos resultados? Qu especie ser ms susceptible a la exposicin al
organofosforado paraoxon? Explica por qu.
En el pollo no se produce tanta hidrolisis del paroxon porque no tiene enzima , por lo que ser
ms sensible
14
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Divisin Toxicologa
ANEXO I
CLCULO DE ACTIVIDAD ENZIMTICA
La actividad enzimtica se expresar utilizando la unidad internacional.
Unidad Internacional (UI o U): cantidad de enzima que transforma 1 micromol (mol) de sustrato por minuto de
reaccin en las condiciones de ensayo. En la presente prctica el producto coloreado que se forma es p-nitrofenol que se
cuantifica midiendo la absorbancia a 400 nm.
1 UNIDAD = 1 U = 1 mol / min
La actividad enzimtica se define mediante la siguiente expresin:
Act
n
n
t ti t0
(Exp. 1)
Donde n es el incremento en el nmero de moles p-nitrofenol entre el tiempo inicial (t0) y el tiempo i (ti).
Teniendo en cuenta que los datos obtenidos en la prctica son medidas de absorbancia de p-nitrofenoly tiempo,
emplearemos la definicin de concentracin y la ley de Lambert-Beer con el fin de obtener una expresin que permita
calcular la actividad enzimtica.
En primer lugar, la concentracin se define con la expresin que se muestra a continuacin:
n
V
(Exp. 2)
n
V
(Exp. 3)
Act
V c V c
t
ti t0
(Exp. 4)
Con el fin de conocer C para cada muestra, se representar la absorbancia de los patrones de p-nitrofenol frente a la
concentracin conocida de dichos patrones, obteniendo un modelo lineal (Exp. 5ab).
Abs aC b
( Abs b)
C
a
(Exp. 5a)
(Exp. 5b)
Donde Abs es la absorbancia, C la concentracin, y tanto a como b dos constantes obtenidas mediante el ajuste lineal.
La absorbancia medida para cada muestra se introducir en el modelo lineal (Exp. 5b) para calcular la concentracin, y
a continuacin se calcular el incremento de concentracin (C = C2 C1) para cada muestra.
15
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Divisin Toxicologa
Introduciendo el valor calculado c en la Exp. 4 y sustituyendo el valor del volumen total de reaccin obtenemos la
actividad enzimtica a partir de los datos de absorbancia y tiempo obtenidos en el laboratorio.
Con el objeto de calcular la actividad enzimtica relativa al volumen de suero utilizado (medido en mL) emplearemos la
expresin:
Act rel
Act
Vs
(Exp. 6)
Donde Vs es el volumen de suero utilizado inicialmente. Sustituyendo la actividad enzimtica (Act) de la Exp. 4 en la
Exp. 6 obtenemos:
Actrel
V C
V C
Vs t Vs (ti t0 )
(Exp. 7)
16
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Divisin Toxicologa
RESUMEN:
Determinacin de la actividad enzimtica relativa al volumen de suero utilizado
V
Volumen de reaccin enzimtica, (4 mL = 410-3 L)
C
Concentracin (M) calculada a partir de la absorbancia de la muestra (Abs) y
del modelo lineal obtenido con los patrones (Exp. 5ab):
Abs aC b C
C
( Abs b)
a
Vs
ti
T0
Actividad enzimtica
relativa (Exp. 7)
Act rel
V C
V C
Vs t Vs (ti t0 )
0 M
(Blanco)
0
0 M
0
10 M
20 M
50 M
60 M
70 M
0,248
0,515
0,754
0,978
1,208
Pendiente del modelo lineal (y = ax)
20 M
30 M
40 M
50 M
21,914
32,085
41,617
51,404
1,406
1,569
60 M
59,829
70 M
66,766
10 M
10,553
MUESTRAS PROBLEMA
Tubo
Absorbancia
1
2
30 M
40 M
[p-nitrofenol]
C1 (M)
C2 (M)
C (M)
Reactivacin por Ca2+ de la actividad paraoxonasa de suero de conejo inhibida por EDTA
0 min
0,721 0,936
30,681
39,829
9,148
5 min
0,743 0,932 31,61702128 39,65957447 8,042553191
30 min
0,728 0,876 30,9787234 37,27659574 6,29787234
Efecto del Cu2+ sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo
Cu2+ C
0,781 1,113
33,234
Cu2+ T
0,745 0,914
31,702
47,362
38,894
14,128
7,192
243,968
214,4680851
167,9432624
376,7
191,787
Efecto de reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo
MB C
0,764 1,110
32,511
47,234
14,723
MB T
0,767 0,939
32,638
39,957
7,319
392,613
195,173
272,346
-14,746
10,213
-0,553
17