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EVALUATION QUALITATIVE ET QUANTITATIVE DES

ACIDES AMINES

METHODES CHROMATOGRAPHIQUES.

METHODES ELECTROPHORETIQUES.

DOSAGES SPECIFIQUES.

CHROMATOGRAPHIE
CHROMATOGRAPHIE
CHROMATOGRAPHIE
CHROMATOGRAPHIE
DIONS.

SUR PAPIER.
SUR COUCHE MINCE.
EN PHASE GAZEUSE.
SUR ECHANGEUR

Les protines: purification

La chromatographie est une technique de sparation qui utilise un support


qui possde des proprits physico-chimiques particulires.

Ce support va retenir les protines en fonction de critres variables.


- en fonction de la charge des protines.
- en fonction de leur affinit pour des molcules (ligands).
- en fonction de leur taille.

Chromatographie sur colonne:

rservoir
Solvant
(phase mobile)

colonne

phase stationnaire

collecteur

Les protines: purification

Chromatographie dchange dions:

La phase stationnaire est compose dune rsine qui peut tre


C2H4
+

- charge positivement (changeuse danions)

C2H4 N H
C2H4
CH2

SO3-

- charge ngativement (changeuse de cations)

O
CH2

C
O

Les interactions molcules-colonne vont dpendre de la charge des


molcules. Ces interactions pourront tre modules par le pH et la force
ionique (concentration en sels) du milieu.

Exemple dune purification par change de cations: sparation de


3 acides amins Ser, Asp et Lys
- tape 1: la colonne (charge ngativement) est quilibre avec
une solution faiblement concentre en sels.
Bille de rsine

SO3Na+
Les cations de la solution (ici Na+) vont se fixer sur les charges
ngatives de la phase stationnaire.

- tape 2: la solution contenant le mlange des molcules sparer est


dpose sur la colonne.
NH + CH COO3

Asp

CH2
COONH3+

NH3+

CH

COO-

CH2OH

CH2

Lys
Ser

CH COOCH2
CH2
CH2
NH3+

Ce sont les molcules prsentes en plus grande concentration qui se


fixent la colonne.
Ici, les groupement chargs positivement vont se fixer la colonne la
place des ions Na+

- tape 3: On lue (on rince) la colonne avec une solution de NaCl un peu
plus concentre.
NH3+

CH

NH3+

COO-

CH2OH

Lys

Ser

CH COOCH2
CH2
CH2
CH2
NH3+

NH3+

CH COOCH2
COO-

Asp

Les ions Na+ tant plus nombreux que prcdemment ils vont entrer en
comptition avec les acides amins pour se fixer sur la colonne.
Ils vont remplacer tout dabord les acides amins les moins positifs.

Les Protines: Purification

- tape 4: On augmente la concentration en NaCl de lluant.


NH3+

Lys

CH COOCH2
CH2
CH2

NH3+

CH

COO-

CH2OH

CH2
NH3+

Ser

La concentration en Na+ tant plus forte, seuls les acides amins les plus
chargs vont rester fixs la colonne.

- tape 5: On augmente encore la concentration en NaCl de lluant.

NH3+

CH COOCH2
CH2
CH2
CH2

Lys

NH3+

Les ions Na+ sont en large excs, ils vont remplacer toutes les molcules
qui taient encore sur la colonne.

Les Protines: Purification

On a rinc la colonne avec un gradient de concentration en NaCl


3
2
1
4

1-2: On dpose le mlange, les molcules les plus charges se fixent tout
de suite alors que les moins charges se fixent plus bas.
3-4: On rince la colonne avec une solution de NaCl de concentration
croissante. On dcroche successivement les diffrentes molcules.

Les protines: purification

Dans lexemple prcdent on a modifi la force ionique de lluant pour


dcrocher les diffrents acides amins.
On aurait galement pu modifier le pH de lluant et garder une
concentration en NaCl constante. En fonction de leur pKa respectifs les
acides amins auraient chang de charge et se seraient dcrochs de la
colonne.

Le principe est strictement le mme pour une protine.

Les protines: purification

Chromatographie daffinit: On greffe sur la colonne une molcule qui


interagit de faon spcifique avec la protine que lon veut purifier.
1

1-2: Quand on met le mlange sur la colonne, seule la protine qui peut
interagir avec le ligand se fixe.
3-4: Pour dcrocher la protine de la colonne, on lue avec une solution
contenant le ligand.

Chromatographie de permation sur gel (ou dexclusion):


On parle aussi de tamisage molculaire car cette technique spare les
protines en fonction de leur taille.

La colonne est remplie de billes poreuses. Les petites molcules pourront


passer par ces pores et entrer dans les billes alors que les grosses
molcules en seront exclues.

Les petites molcules vont donc perdre du temps dans les billes alors
que les grosses molcules vont trs vite traverser la colonne.

Les protines: purification

Chromatographie de permation sur gel


grosses
molcules
exclues
petites molcules
incluses

retard

billes poreuses

lution avec le
volume mort
(Vm)

Avec ce type de chromatographie, il ny a pas dinteractions directes


entre la phase stationnaire et les molcules.
ce sont les molcules les plus grosses qui migrent le plus vite.

Les protines: purification

Dtection des protines:


On utilise les proprits dabsorption de la lumires des acides amins
aromatiques.
Ces acides amins absorbent la lumire 280 nm
On pourra ainsi dtecter la sortie de toutes les protines de la colonne.
absorption

280nm

dtecteur

Volume dlution

Pour savoir o se trouve la protines recherche il faudra doser son activit

REACTION A LA NINHYDRINE.
Detecteur uv .
Enregistreur + Trace.
DO 215 nm

temps de rtention (min)

L'lectrophorse est une technique biochimique


de sparation fonde sur le fait que des
molcules portant des charges lectriques
diffrentes migrent des vitesses diffrentes
lorsqu'elles sont places dans un champ
lectrique.
llectrophorse est devenue une technique de
routine dans les laboratoires o on lutilise pour
sparer notamment les protines et les acides
nucliques.
Llectrophorse des protines peut tre ralise
sur des supports varis, notamment sur gel de
polyacrylamide ou sur gel dagarose

Deux facteurs vont influencer la migration des protines: leur


charge et leur taille. Plus la protine est charge plus sa migration
sera importante. Au contraire plus la protine sera grosse moins
sa migration sera importante.

Le sens de migration de la protine va dpendre de son pI (point


isolectrique). En fonction du pH la protine sera charge
positivement ou ngativement, elle migrera donc vers lanode
(charge +) ou la cathode (charge -).

anode +

migration protines charges -

migration protines charges +

dpt

cathode -

Cuve pour lectrophorse clinique

Prparation du gel et dpt des


chantillons
Les gels supports
prts l'emploi sont
constitus d'une mince
couche d'agarose
coule sur un support
plastique de 100 mm
x 75 mm permettant
leur manipulation
aise.

Essorage de la zone de dpt

Une fois le gel sorti de son


emballage, la zone de dpt est
essore avec une bande de papier
filtre pour faciliter la diffusion des
chantillons lors du dpt.

Mise en place du masque de dpt

La bande est ensuite retire et jete et on


dispose la mme place un masque de
dpt form d'une bande de plastique
comportant 10 fentes.

Dpt des chantillons

Un volume de 5 L des chantillons


analyser est dpos sur les fentes et
abandonn pendant 5 minutes pour
assurer leur diffusion au niveau de la
zone de dpt.

Essorage du liquide en excs

Le liquide non absorb par le gel est


ensuite essor avec une autre bande
de papier filtre et le masque de dpt
est jet.

Gel en place dans la cuve

Phase de migration
Le gel est alors mis en place dans la cuve
et puis aprs fermeture du couvercle et
mise en marche de lalimentation, la
migration des protines dmarre
La tension applique au gel et le temps de
migration dpendent de la nature des
chantillons analyser.

Ensemble du dispositif d'lectrophorse

Fixation et coloration
Une fois la migration lectrophortique termine,
le gel est plong pendant deux minutes dans le
fixateur (acide alcool), sch puis plong
pendant trois minutes dans le colorant.
Une succession de bains dans la solution de
dcoloration permet ensuite d'liminer la
coloration du fond de faon faire apparatre les
bandes correspondant aux diverses protines
spares.

Dcoloration du fond

Le gel est ensuite sch ce qui


permet de le conserver dans de
bonnes conditions.

lecture
peut se faire l'oeil nu (analyse qualitative)
ou par densitomtrie (enregistrement de
l'absorbance en fonction de la distance de
migration) ; dans ce cas, l'intgration des
pics permet une analyse quantitative des
fractions.

Trac densitomtrique du
protinogramme d'un srum humain
normal