Integrantes:

Andrea Ardila
David Cceres
Jenny Bohrquez
Daniela Bernal
Determinacin de la concentracin de protenas
Introduccin:
Los aminocidos son monmeros a partir de los cuales se forman las protenas,
son molculas orgnicas que en su estructura contiene un grupo amino (NH2) y un
grupo carboxilo (COOH).
Todos los 20 aminocidos encontrados en las protenas son -aminocidos, es
decir poseen un grupo amino y un grupo carboxilo unidos a un mismo carbono,
que por convencin se denomina carbono . El carbono alfa se une otros dos
sustituyentes, uno de ellos es un tomo de hidrgeno y el otro es el denominado
grupo R, el cual es diferente en cada uno de los aminocidos y es el responsable
de otorgarle las propiedades caractersticas a cada uno de ellos. En resumen
cualquier aminocido se encuentra formado por un carbono al cual se unen 4
sustituyentes: un grupo amino, un grupo carboxilo, un hidrgeno y un grupo R.
Las protenas poseen una estructura qumica central que consiste en una cadena
lineal de aminocidos plegada de forma que muestra una estructura
tridimensional. Estas macromolculas orgnicas, estn constituidas bsicamente
por carbono (C), hidrgeno (H), oxgeno (O) y nitrgeno (N); aunque pueden
contener tambin azufre (S) y fsforo (P) y en menor proporcin, hierro (Fe), cobre
(Cu), magnesio (Mg), yodo (I), esto le da a las protenas sus respectivas
funciones. Tales como formar parte de las estructuras de tejidos como msculos,
tendones, piel, uas entre otras, adems desempean funciones metablicas y
reguladoras como asimilacin de nutrientes, transporte de oxigeno y dems.
Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica
de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena
concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin
enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos
propsitos.
La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la
reaccin del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solucin acuosa
alcalina (de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la formacin de un compuesto

de color violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los

iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma
parte de los enlaces peptdicos presentando un mximo de absorcin a 540 nm.
El mtodo de Biuret da positivo en todos los compuestos que tengan dos o ms
enlaces peptdicos consecutivos en sus molculas. La intensidad de coloracin es
directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos), en esta
reaccin pocas sustancias interfieren y se recomiendo para la cuantificacin de
protenas en preparados muy concentrados.
Para la medicin de protenas se utiliza los espectrofotmetros que miden la
cantidad proporcional de luz reflejada por una superficie como una funcin de las
longitudes de onda para producir un espectro de reflectancia. El espectro de
reflectancia de una muestra se puede usar, junto con la funcin del observador
estndar CIE y la distribucin relativa de energa espectral de un iluminante para
calcular los valores triestmulos para esa muestra bajo ese iluminante.
El funcionamiento de un espectrofotmetro consiste bsicamente en iluminar la
muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en
una serie de intervalos de longitudes de onda. Lo ms usual es que los datos se
recojan en 31 intervalos de longitudes de onda. Esto se consigue haciendo pasar
la luz a travs de un dispositivo monocromtico que fracciona la luz en distintos
intervalos de longitudes de onda. El instrumento se calibra con una muestra o
loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento de longitudes de onda se
conoce en comparacin con una superficie de reflexin difusa perfecta.
La reflectancia de una muestra se expresa como una fraccin entre 0 y 1, o como
un porcentaje entre 0 y 100. Es importante darse cuenta de que los valores de
reflectancia obtenidos son valores relativos y, para muestras no fluorescentes, son
independientes de la calidad y cantidad de la luz usada para iluminar la muestra.
As, aunque los factores de reflectancia se midan usando una fuente de luz
concreta, es perfectamente correcto calcular los valores colorimtricos para
cualquier iluminante conocido.
Objetivos:

Utilizar tcnicas espectrofotomtricas para la cuantificacin de protenas.

Aprender a utilizar curvas de calibracin para determinar la concentracin
de muestras problema.

Metodologa:
Primero se marcan cada uno de los 8 tubos de ensayo con los cuales se
determinara la curva de calibracin (blanco, 1, 2, 3, 4, 5, MP1, MP2). En el tubo

correspondiente a blanco se agrega solucin salina y reactivo de biuret, en los

tubos 1, 2, 3, 4 y 5, se mezcla solucin salina, solucin patrn de protenas junto
con reactivo biuret y por ultimo en los tubos MP1 y MP2 se mezcla solucin salina,
muestras problemas y reactivo de biuret. Mezclar hasta que la mezcla quede
homognea e incube en agua a 37C por 20 minutos. Utilice el espectrofotmetro
a una longitud de onda de 540 nm, para medir la absorbancia de cada uno de los
tubos, primero calibre dicho instrumento con la muestra en blanco y
posteriormente con cada uno de los diferentes tubos determinando as la
absorbancia.
Resultados:

concentraci Absorban
n
cia
2,08
1,068
1,6
1,146
1,28
0,936
0,8
0,9
0,4
0,742
2,6261
0,147
1,81
75
0,315

c 1v 1
=c 2
v2
1,3 ml8 mg/ ml
=c 2
5 ml

TUBO #1

2,08mg/ml=c2

1,0 ml8 mg /ml

=c 2
5 ml
1,6mg/ml=c2

TUBO #2

0,8 ml8 mg/ml

=c 2
5 ml

TUBO #3

1,28mg/ml=c2

0,5 ml8 mg/ml

=c 2
5 ml

TUBO #4

0,8 mg/ml=c2
0,25m l8 mg/ml
=c 2
5 ml

TUBO #5

0,4 mg/ml=c2

Curva de calibracion
1.4
1.2
1

f(x) = 0.21x + 0.7

0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

1.4

1.6

1.8

Y =0,211 X +O ,6985

(0,1470,6985)
=y
0,211

TUBO MP1

2.2

-2,6261= y

(0,55150,6985)
=y
0,211

TUBO MP1

-1, 8175= y
Anlisis:
Mtodo de Biuret
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH
de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La
intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas
(enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas
sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se
recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados
(por ejemplo en suero).
El mtodo del espectrofotmetro se utiliz en la prctica de forma eficiente ya que
al determinar la absorbancia fue posible hallar las concentraciones ya que esto
consiste en el uso de la interaccin entre la materia y la energa radiante la cual se
refiere a como la ondas electromagnticas se propagan y transportan sin
transferencia de materia.
El comportamiento entre la absorbancia y las concentraciones encontradas es
directamente proporcional, debido a esto ambas variables aumentan o disminuyen
sin necesidad de hacerlo en la misma cantidad es por esta razn que el
coeficiente de correlacin es bajo.
Conclusiones:

El uso de la espectrofotometra facilita la bsqueda de concentraciones en

este caso de protenas ya que el reflejo de la luz permite hallar n valor
acercado o casi exacto de la cantidad de luz que pasa a travs de la
sustancia y por ende la cantidad de protena encontrada en la misma, esto
explica que factores como la limpieza del tubo de ensayo utilizado o la
pureza de los reactivos influyen en el uso de esta tcnica es por estas
razones que pueden haber porcentajes de errores altos.

Las curvas de calibracin permiten una visin general de los resultados

obtenidos a partir de la tcnica de la espectrofotometra es por esta razn
que el anlisis de los mismos se hacer a partir de estas grficas y no de
tablas con el resto de los datos.
La curva de calibracin permiti encontrar la ecuacin de la recta para
hallar los valores tericos de las concentraciones y as mismo el coeficiente
de correlacin que fue de 0,7887 por lo que se determin que aunque los
valores de las concentraciones encontradas no tuvieron un comportamiento
muy similar al esperado es decir a los hallados con la ecuacin dela grfica,
es notorio que las concentraciones disminuyen desde la encontrada en el
tubo 1 hasta la del tubo 5.
Las concentraciones de protena fueron mayores en las sustancias de los
primeros tubos ya que el comportamiento de la cantidad de concentracin
de protena fue decreciente y en el caso de mp1 y mp2 las concentraciones
fueron mayores debido a que el fin era precisamente hallar la concentracin
ya que eran sustancias con muestras desconocidas.
El uso del reactivo de Biuret es fundamental para obtener los resultados de
las concentraciones esperadas, es por esta razn que en cada uno de las
sustancias realizadas en la prctica se utiliz el reactivo y fue posible hallar
las concentraciones ya expuestas.

Bibliografa:

Protenas. Org, 2008. Las protenas: informacin sobre protenas y

alimentos con protenas. Recuperado de http://proteinas.org.es/que-sonlas-proteinas
Muoz Francisco, septiembre 2002. Proteinas, Recuperado de
http://www.aula21.net/nutricion/proteinas.htm
Rodrguez Fabin, julio 2011. Estructura y propiedades de aminocidos y
pptidos.
Recuperado
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http://sevuprimero.weebly.com/uploads/9/8/6/3/9863937/estructura_y_prop
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Imagen digital, 2013. Como funciona un espectrofotmetro de reflectancia.
Recuperado
de
http://www.gusgsm.com/funciona_espectrofotometro_reflectancia
Practica de laboratorio de qumica, anlisis por espectrofotometra de
absorcin, recuperado de file:///C:/Users/daniela/Downloads/ANALISISESPECTROFOTOMETRICO%20(3).pdf, 2011.