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Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie INRA TOULOUSE La PCR en temps réel. Choix d’amorces et analyse des
Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie
INRA TOULOUSE
La PCR en temps réel.
Choix d’amorces et analyse des résultats
Pascal MARTIN : Pascal.Martin@toulouse.inra.fr
UR66, janvier 07
Plan La PCR en temps réel pour la mesure de l’expression des gènes Principes de
Plan
La PCR en temps réel pour la mesure de l’expression des gènes
Principes de base
Le choix des amorces de PCR
La mise au point d’un dosage en SYBR Green
Les choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
UR66, janvier 07
La PCR en temps réel pour la mesure de l’expression des gènes Mesurer l’«expression d’un
La PCR en temps réel pour la mesure de l’expression des gènes
Mesurer l’«expression d’un gène» = mesurer l’abondance des
transcrits produits par ce gène à un instant donné
Abondance relative (unités arbitraires) ou abondance absolue
(nombre de copies ou µg/µL)
En pratique, la quantification relative est la plus utilisée en raison
de la difficulté qu’il y a à construire une courbe de calibration
absolue (l’utilisation de plasmides ou de produits de PCR est
dangereuse…).
UR66, janvier 07
La PCR en temps réel pour la mesure de l’expression des gènes Etapes initiales :
La PCR en temps réel pour la mesure de l’expression des gènes
Etapes initiales :
ADNc
Extraction ARN
ARN total
Transcription inverse
Organe
Cellules
Traités vs non traités
Sauvage vs transgénique
Dosage
Dosage au spectrophotomètre (A 260nm ) : pas d’évaluation d’une potentielle
dégradation différentielle des ARNs
Transcription inverse : pas d’évaluation des différences potentielles
d’efficacité de transcription inverse
IL EST NECESSAIRE DE CALIBRER NOS DONNEES PAR RAPPORT A UNE
QUANTITE QUI EST CONSTANTE ENTRE LES DIFFERENTS
ECHANTILLONS D’ARN INTACT.
Contrôle endogène = gène de ménage = housekeeping gene
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La PCR en temps réel pour la mesure de l’expression des gènes 2 boîtes de
La PCR en temps réel pour la mesure de l’expression des gènes
2 boîtes de cellules identiques (A et B). ARN A non dégradé, ARN B
dégradé à 50%. RT A et RT B efficaces à 100%. (gène X) A =20, (gène
X) B =10. (β-actin) A =200, (β-actin) B =100
Je calibre
Je ne calibre pas
(gène X) A / (β-actin) A = 0.1
(gène X) A = 20
(gène X) B / (β-actin) B = 0.1
(gène X) B = 10
Idem mais cette fois-ci efficacité RT B =50% => (gène X) B =5 et (β-
actin) B =50
Je calibre
Je ne calibre pas
(gène X) A / (β-actin) A = 0.1
(gène X) A = 20
(gène X) B / (β-actin) B = 0.1
(gène X) B = 5
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Principes de base Fluo ~ DNA quantity Plateau phase Linear phase Exponential phase Not detected
Principes de base
Fluo ~ DNA quantity
Plateau phase
Linear
phase
Exponential
phase
Not detected
Cycle number
UR66, janvier 07
Principes de base Fluo ~ DNA quantity Linear phase Exponential phase Cycle number UR66, janvier
Principes de base
Fluo ~ DNA quantity
Linear
phase
Exponential
phase
Cycle number
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Principes de base ΔRn = ROX normalized signal – ROX normalized baseline signal Ct threshold
Principes de base
ΔRn = ROX normalized signal – ROX normalized baseline signal
Ct
threshold
Baseline
Nombre de cycles
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Principes de base ΔRn Distance = 1 cycle Nombre de cycles Dilutions au 1/10 ème
Principes de base
ΔRn
Distance = 1 cycle
Nombre de cycles
Dilutions au 1/10 ème => 3.32 cycles de distance
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Principes de base 1) l’accumulation de la fluorescence est proportionnelle à l’accumulation du produit de
Principes de base
1) l’accumulation de la fluorescence est proportionnelle à
l’accumulation du produit de PCR qui nous intéresse => notion de
spécificité, choix des primers
2) L’efficacité de PCR doit être la même dans les différents
échantillons
3) Le seuil utilisé dans les analyses doit être fixé de manière à
couper toutes les courbes de PCR au niveau de la phase
exponentielle afin d’être sûr que le CT est bien représentatif du
nombre initial de copies de l’ARN et pas de différences de
cinétique entre les PCRs
Peirson SN et al., NAR, 2003
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Principes de base 1) l’accumulation de la fluorescence est proportionnelle à l’accumulation du produit de
Principes de base
1) l’accumulation de la fluorescence est proportionnelle à
l’accumulation du produit de PCR qui nous intéresse => notion de
spécificité, choix des primers
En SYBR Green, si mes amorces font des dimères, si
j’amplifie un ou des produits de PCR non spécifiques ou bien
si j’amplifie de l’ADN génomique, je ne sais plus ce que
représente concrètement l’intensité de fluorescence en
ordonnée (mon produit de PCR? Des dimères de primers? Un
autre amplicon? Un peu de tout ça?)
C’est un choix judicieux des amorces de PCR qui va me
permettre d’assurer la spécificité nécessaire
Remarque : en TaqMan, c’est un choix judicieux de ma sonde TaqMan
qui va assurer la spécificité de quantification
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Principes de base 2) L’efficacité de PCR doit être la même dans les différents échantillons
Principes de base
2) L’efficacité de PCR doit être la même dans les différents
échantillons
1,2E+10
1,0E+10
E=2, X 0 =10
E=2, X 0 =20
E=1.95, X 0 =10
8,0E+09
6,0E+09
4,0E+09
25
30
2,0E+09
0,0E+00
0
5
10
15
20
25
30
35
UR66, janvier 07
Principes de base 2) L’efficacité de PCR doit être la même dans les différents échantillons
Principes de base
2) L’efficacité de PCR doit être la même dans les différents
échantillons
Avec 95% d’efficacité de PCR, au bout de 26-27 cycles, on
obtient deux fois moins de produit de PCR qu’avec une efficacité
de 100%
On doit donc vérifier que l’on a bien la même efficacité de
PCR entre les différents échantillons et essayer d’identifier
si certains échantillons ont une efficacité de PCR différente
des autres.
UR66, janvier 07
Principes de base 3) Le seuil utilisé dans les analyses doit être fixé de manière
Principes de base
3) Le seuil utilisé dans les analyses doit être fixé de manière à couper
toutes les courbes de PCR au niveau de la phase exponentielle afin
d’être sûr que le CT est bien représentatif du nombre initial de copies
de l’ARN et pas de différences de cinétique entre les PCRs
96 Replicates
Variable plateau phase
High precision during
exponential phase
Applied Biosystems – David Favy
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PCR Product
Le choix des amorces de PCR Primer Express 2.0 UR66, janvier 07
Le choix des amorces de PCR
Primer Express 2.0
UR66, janvier 07
Le choix des amorces de PCR Spécificité 1 On ne veut amplifier que notre ADNc
Le choix des amorces de PCR
Spécificité
1
On ne veut amplifier que notre ADNc d’intérêt et pas un autre
ADNc. Cet aspect est fondamental, en particulier si on
s’intéresse à une famille multigénique ou à un transcrit
alternatif précis
2
Même si notre échantillon d’ADNc est un peu contaminé par de
l’ADN génomique, on aimerait que l’amplification de ce dernier
ne soit pas possible
3
On ne veut pas que nos amorces puissent s’auto-amplifier en
formant des dimères d’amorces
Outils
1
Connaissance de la séquence et des séquences qui présentent
des homologies. Connaissance du ou des transcrits étudiés.
GenBank, BLAST, Ensembl, PubMed, Multalin, Entrez…
2
Choix des primers sur deux exons différents séparés par un
intron d’au moins 1-2 Kb. Ensembl, Entrez, BLAST
3
Etude
des
primers
sous Primer Express (Primer Test
Document)
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Le choix des amorces de PCR Un choix judicieux d’amorces ne peut se faire sans
Le choix des amorces de PCR
Un choix judicieux d’amorces ne peut se faire sans une solide connaissance
de votre séquence de départ, …
1
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide
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Le choix des amorces de PCR …des homologies que présente cette séquence avec d’autres transcrits,
Le choix des amorces de PCR
…des homologies que présente cette séquence avec d’autres transcrits, …
1
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/
+ ClustalW +ClustalX +etc…
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Le choix des amorces de PCR …de l’existence de transcrits alternatifs ou de gènes codés
Le choix des amorces de PCR
…de l’existence de transcrits alternatifs ou de gènes codés sur le brin
complémentaire
1
www.ensembl.org/index.html
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Le choix des amorces de PCR 2 ADN génomique et ADN complémentaire ADN génomique ADNc
Le choix des amorces de PCR
2
ADN génomique et ADN complémentaire
ADN génomique
ADNc
Cas où l’on a que des introns de petite taille :
ADN génomique
ADNc
3-4 bases maxi, sinon …
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Le choix des amorces de PCR Absence de dimères de primers 3 5’ Loop-back 3’
Le choix des amorces de PCR
Absence de dimères de primers
3
5’
Loop-back
3’
3’
3’-3’ dimer
3’
5’
5’-5’ dimer
Pas d’extension possible donc pas un problème
5’
Toujours penser à réaliser toutes les combinaisons possibles :
sens/sens, antisens/antisens et sens/antisens
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Le choix des amorces de PCR Absence de dimères de primers 3 OK, OK mais
Le choix des amorces de PCR
Absence de dimères de primers
3
OK,
OK
mais
OK
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Le choix des amorces de PCR Absence de dimères de primers 3 NON NON OK
Le choix des amorces de PCR
Absence de dimères de primers
3
NON
NON
OK
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Le choix des amorces de PCR Les critères pris en compte par Primer Express Amorces
Le choix des amorces de PCR
Les critères pris en compte par Primer Express
Amorces
Sonde TaqMan
Amplicon
Tm 10°C de plus que le Tm des
*********
Tm 58-60°C
amorces (7°C pour discrimination
allélique)
*********
50-150 bp de
longueur (efficacité
de PCR)
*********
20-80% GC
20-80% GC
Longueur 9-40 bases
Longueur 9-40 bases
<2°C différence de Tm
entre les 2 amorces *********
Pas de G à l’extrémité 5’
(quenching)
*********
<4 G contigus
Maximum de 2/5 G ou
C en 3’ (specificité)
Pas plus de G que de C (essayer
le réverse complément…)
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Le choix des amorces de PCR Autres critères Classement des amorces selon le critère de
Le choix des amorces de PCR
Autres critères
Classement des amorces selon le critère de pénalité. Ce critère n’est pas
comparable d’une recherche d’amorces à l’autre.
Présence de polymorphismes? Critique surtout pour les polymorphismes
situés en 3’. Voir les bases de données
Parfois, il faut fixer « à la main » l’une des deux amorces. Dans ce cas, il
est critique de s’assurer que son Tm est bien compris entre 58 et 60° et
qu’elle ne risque pas de former de dimères d’amorces.
… j’en oublie certainement… mais dans la plupart des cas, rien ne vaut
les tests en tubes…
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Mise au point d’un dosage en SYBR Green 1) Etude de la séquence du gène
Mise au point d’un dosage en SYBR Green
1) Etude de la séquence du gène à étudier
2) Choix des amorces de PCR
3) Optimisation
des
concentrations
d’amorces
et
vérification de la spécificité
4) Réalisation d’une courbe standard
5) Dosage des échantillons d’intérêt
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Mise au point d’un dosage en SYBR Green 3) Optimisation des concentrations d’amorces et vérification
Mise au point d’un dosage en SYBR Green
3)
Optimisation des concentrations d’amorces et vérification de la spécificité
Le Tm d’une amorce dépend de sa concentration
[50;900nM] ~ Tm + [0;4°C]
Reverse Primer (nM)
50
300
900
50
50/50
50/300
50/900
300
300/50
300/300
300/900
900
900/50
900/300
900/900
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Forward Primer (nM)
Mise au point d’un dosage en SYBR Green 3) Optimisation des concentrations d’amorces et vérification
Mise au point d’un dosage en SYBR Green
3)
Optimisation des concentrations d’amorces et vérification de la spécificité
ΔRn
Plateau le plus élevé (voir en échelle
linéaire + besoin de réplicats)
300/300 and 300/900 : OK
valeurs de CT robustes
Faible reproductibilité,
CT tardifs
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Le choix est guidé par 1) le CT le plus précoce possible, 2) la meilleure
reproductibilité possible et 3) le plateau le plus élevé possible
Mise au point d’un dosage en SYBR Green 3) Optimisation des concentrations d’amorces et vérification
Mise au point d’un dosage en SYBR Green
3)
Optimisation des concentrations d’amorces et vérification de la spécificité
Sur la même plaque de PCR, on mettra des contrôles négatifs (idéalement des échantillons
RT-, i.e. des ARN réverse transcrits en l’absence de réverse transcriptase)
On réalisera des courbes de dissociation pour vérifier 1) que l’on a bien amplification d’un
unique amplicon, 2) que l’on a pas de formation de dimères de primers et 3) que l’on amplifie
pas l’ADN génomique dans les échantillons RT-. Idéalement on fera aussi un contrôle sur gel.
-Derivée
Tm of PCR product
Primer dimers
Temperature (°C)
Temperature (°C)
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Fluorescence
Fluorescence
Mise au point d’un dosage en SYBR Green 4) Réalisation d’une courbe standard Slope is
Mise au point d’un dosage en SYBR Green
4)
Réalisation d’une courbe standard
Slope is between -3.3 and -3.4 => Efficiency=100%
R
2 >0.99
Ct
Slope is above -3.3 => maybe PCR inhibitors
Slope is below -3.4 => Efficiency<100%
Log (Co)
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Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats Lors de la phase exponentielle de la PCR, on
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
Lors de la phase exponentielle de la PCR, on a :
X n = X 0 . E n
X n = nombre d’amplicons au cycle n
X 0 = nombre initial de transcrits = ce que l’on souhaite connaître
E = efficacité de PCR comprise entre 1 et 2 (E=1 0% d’efficacité; E=2
100% d’efficacité)
E=2 => X n = X o x 2 n
X n+1 = X o x 2 n+1
= (X o x 2 n ) x 2
Efficacité de 100% = on
double le nombre de produit
de PCR à chaque cycle
X n+1 = X n x 2
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats Lors de la phase exponentielle de la PCR, on
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
Lors de la phase exponentielle de la PCR, on a :
X n = X 0 . E n
X n = nombre d’amplicons au cycle n
X 0 = nombre initial de transcrits = ce que l’on souhaite connaître
E = efficacité de PCR comprise entre 1 et 2
Le seuil est fixé de manière à couper les courbes de PCR au niveau de la
phase exponentielle ET la fluorescence est proportionnelle au nombre
d’amplicon
R CT = R 0 . E CT
R CT = fluorescence sélectionnée comme seuil
R 0 = fluorescence initiale
E = efficacité de PCR comprise entre 1 et 2
CT = fraction de cycle à laquelle la courbe de PCR croise le seuil
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Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats R CT = R 0 . E CT R
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
R CT = R 0 . E CT
R 0 = R CT . E -CT
R CT = fluorescence sélectionnée comme seuil
X 0 = fluorescence initiale
E = efficacité de PCR comprise entre 1 et 2
CT = fraction de cycle à laquelle la courbe de PCR croise le seuil
R 0 = R CT . E -CT
log(R 0 ) = log(R CT )+log(E -CT )
log(R 0 ) = log(R CT )-CT.log(E)
log(R CT ) est une constante (seuil fixé). Si l’efficacité de PCR est constante
aussi, on peut poser log(RCT)=a et log(E)=b.
log(R 0 ) = a – b.CT
Donc il existe un lien linéaire entre le log de la concentration initiale et le
CT. C’est ce que l’on observe en faisant une courbe standard.
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats log(R 0 ) = log(R CT )-CT.log(E) log(R 0
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
log(R 0 ) = log(R CT )-CT.log(E)
log(R 0 ) = a – b.CT
Avec l’équation dans
ce
sens
là,
b
=
log(E)
=
pente de
la
droite de
régression, d’où E = 10 pente de la droite de régression
Avec le logiciel ABI PRISM, on dispose de l’équation dans l’autre sens :
CT = a/b – 1/b . log(R 0 )
Si on observe une pente de -3.32 avec cette équation, alors :
b = log(E) = 1/3.32
E = 10 1/3.32 = 2
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Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats R t arg et 0 La quantité qui nous
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
R
t
arg
et
0
La quantité qui nous intéresse :
R
Où target représente notre gène
d’intérêt et endo représente notre
gène contrôle endogène
endo
0
On peut également s’intéresser directement au ratio de cette quantité
entre un groupe traité et un groupe contrôle
1 Courbes standard
2 ΔΔCT
3 Estimations individuelles des efficacités
4 Test de l’homogénéité des efficacités et estimation par la
moyenne des estimations individuelles
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Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats Ct 1 Courbes standard Target gene Méthode qui permet
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
Ct
1
Courbes standard
Target gene
Méthode qui permet de gérer le
cas où les PCR des gènes target
et endo n’ont pas les mêmes
efficacités
s=-3.1052
Endogenous
control
s=-4.0368
ΔCt is not
constant
01234567
Log(Co)
Méthode qui suppose que l’efficacité de PCR pour un gène donné est
toujours la même dans les différents tubes (standards et échantillons en
particulier).
On va estimer cette efficacité sur la courbe standard et appliquer cette
efficacité à toutes les données
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5
10
15
20
25
30
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 1 Courbes standard Pour chaque gène (target ou endo),
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
1
Courbes standard
Pour chaque gène (target ou endo), la courbe standard va nous fournir les
valeurs de a et b (ou a’ et b’) telles que :
log(R 0 ) = a – b . CT
CT = a’ – b’ . log(R 0 )
Pour chaque échantillon de concentration inconnue, on connaît la valeur de
CT. A l’aide des valeurs a et b (ou a’ et b’) fournies par la courbe standard,
on en déduit aisément les valeurs de log(R 0 ) pour chaque échantillon
Il ne reste plus qu’à calculer pour chaque échantillon :
R
target
0
log(
R
)
log(
R
)
=
log(
)
targe t
endo
0
0
R
endo
0
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 1 Courbes standard Standard curve target gene Sample Sample
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
1
Courbes standard
Standard curve target gene
Sample
Sample
Q
Q
Sample
Ct target
Ct endo
target
endo
Q target / Q endo
C1
Ct
Ct
C1
Q
Q
C1
Q
/Q
t,C1
e,C1
t,C1
e,C1
t,C1
e,C1
C2
Ct
Ct
C2
Q
Q
C2
Q
/Q
t,C2
e,C2
t,C2
e,C2
t,C2
e,C2
C3
Ct
Ct
C3
Q
Q
C3
Q
/Q
t,C3
e,C3
t,C3
e,C3
t,C3
e,C3
T1
Ct
Ct
T1
Q
Q
T1
Q
/Q
t,T1
e,T1
t,T1
e,T1
t,T1
e,T1
T2
Ct
Ct
T2
Q
Q
T2
Q
/Q
t,T2
e,T2
t,T2
e,T2
t,T2
e,T2
T3
Ct
Ct
T3
Q
Q
T3
Q
/Q
t,T3
e,T3
t,T3
e,T3
t,T3
e,T3
Standard curve
endogenous control
Stats
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 1 Courbes standard Avantages : Principe simple et
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
1
Courbes standard
Avantages : Principe simple et compréhensible
Réalisation des courbes standard assez facile
Réalisation des calculs simple
Inconvénients :
Réalisation de PCRs (env. 15-20) qui n’ont pas d’intérêt
direct pour le chercheur (coût, temps, échantillons rares)
Problèmes d’estimations si la gamme de concentration
n’est pas assez large, si on a peu de points ou si
l’échantillon de départ présente des inhibiteurs de PCR
(gènes faiblement exprimés, inhibition de PCR aux fortes
concentrations,…)
Hypothèse forte : « l’efficacité de PCR est la même dans
tous les tubes »
Impossibilité d’identifier des échantillons présentant une
efficacité de PCR anormale
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 2 ΔΔCT R CT = R 0 . E
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
2
ΔΔCT
R CT = R 0 . E CT
R CT = fluorescence sélectionnée comme seuil = constante
X 0 = fluorescence initiale
E = efficacité de PCR comprise entre 1 et 2
CT = fraction de cycle à laquelle la courbe de PCR croise le seuil
CT
T
= T E
.
target
Pour le gène d’intérêt (target) :
CT
0
target
target
CT
R
= R E
.
ref
Pour le contrôle endogène (ref) :
CT
0
ref
ref
CT
T
target
T
E
CT
target
target
0
En divisant ces 2 équations :
=
.
CT
R
R
E
ref
CT
0
ref
ref
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 2 ΔΔCT CT T E target T CT target
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
2 ΔΔCT
CT
T
E
target
T
CT
target
target
0
=
.
CT
R
R
E
ref
CT
0
ref
ref
T
R
et
CT
CT
target
ref
Sont les seuils de fluorescence fixés pour le gène
d’intérêt et pour le gène de référence respectivement.
Ces deux valeurs sont des constantes. Si on a fixé le
même seuil pour les deux gènes, alors le rapport vaut 1.
CT
T
T
E
target
CT
target
target
0
=
.
=
K
(
=
1)
Où K est une constante
CT
R
R
E
ref
CT
0
ref
ref
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 2 ΔΔCT CT CT target T E T E
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
2 ΔΔCT
CT
CT
target
T
E
T
E
ref
target
0
ref
0
.
= K
=
K .
(1)
CT
CT
target
R
E
R
ref
E
0
0
ref
target
Si E target = E ref = E alors,
T
CT
CT
0
−Δ CT
=
K E
.
ref
target
=
K E
.
(1)
Avec ΔCT = CT target -CT ref
R
0
Si E = 2 (efficacité 100%) alors,
T
0
−Δ CT
=
K
.2
R
0
On sait calculer T 0 /R 0 à une constante
près (et cette constante vaut 1 si le
seuil de fluorescence est le même pour
target et ref)
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats Ct 2 ΔΔCT Target gene s=-3.3352 Pente ≤0.1 pour
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
Ct
2 ΔΔCT
Target gene
s=-3.3352
Pente ≤0.1 pour le graphe
d’efficacité relative
Endogenous
ΔCt reste
constant
Relative efficiency plot
control
s=-3.2965
Log(Co)
Corrélation minimum entre les
courbes standard = 0.99
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
Log(Co)
UR66, janvier 07
ΔCt
-2.8
-2.6
-2.4
-2.2
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 2 ΔΔCT Mise en œuvre : 1) On calcule
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
2 ΔΔCT
Mise en œuvre :
1) On calcule 2 -ΔCT pour chaque échantillon (avec ΔCT=CT target -CT ref )
2) On
calcule
les
moyennes
et
écarts-types
pour
chaque
lot
d’individus
3) Eventuellement on divise ces moyennes (et les écarts-types!!)
par la moyenne du groupe contrôle pour ramener ce groupe à
une moyenne de 1
4) On fait ses stats habituelles (il faut parfois transformer toutes les
données en log pour homogénéiser les variances)
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 2 ΔΔCT T 0 −Δ CT = K .2
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
2 ΔΔCT
T
0
−Δ CT
=
K
.2
Avec ΔCT = CT target -CT ref
R
0
⎛ T ⎞
−Δ CT
0
Pour le groupe « traités » :
=
K .2
traité
R
0
traité
⎛ T ⎞
0
−Δ CT
Pour le groupe « contrôle » :
= K .2
ctrol
R
0
ctrol
⎛ T ⎞
0
R
−Δ CT
2
traité
0
traité
− ( Δ
CT
−Δ
CT
)
−ΔΔ CT
=
=
2
traité
ctrol
Donc :
=
2
−Δ CT
⎛ T ⎞
2
ctrol
0
R
0
control
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 2 ΔΔCT ⎛ T ⎞ ⎜ 0 ⎟ ⎜
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
2 ΔΔCT
⎛ T ⎞
0
R
0
traités
−ΔΔ CT
= 2
⎛ T ⎞
En pratique, ce calcul est bien adapté
aux données appariées ou à la
comparaison de deux échantillons.
0
R
0
control
Cette méthode donne des résultats surprenants quand on compare
2 groupes d’échantillons…
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 2 ΔΔCT Sample Groupe Gène CT CT moyen 2
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
2 ΔΔCT
Sample
Groupe
Gène
CT
CT moyen
2
-ΔΔCT
Ratio
ctrol
moyen
1 Ctrol
Target
22.3
21.9
1.000
2 Ctrol
Target
22.0
21.9
0.812
!!
1.014
3 Ctrol
Target
21.5
21.9
1.231
4 Traité
Target
19.8
21.9
1.741
5 Traité
Target
20.2
21.9
1.866
1.917
6 Traité
Target
20.0
21.9
2.144
1 Ctrol
Ref
22.9
22.5
2 Ctrol
Ref
22.3
22.5
2^-[(20.0-21.7)-(21.9-22.5)]
3 Ctrol
Ref
22.4
22.5
4 Traité
Ref
21.2
22.5
5 Traité
Ref
21.7
22.5
6 Traité
Ref
21.7
22.5
D’après Livak KJ &
Schmittgen TD, 2001
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 2 ΔΔCT C’est pourquoi je vous conseille d’utiliser plutôt
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
2 ΔΔCT
C’est pourquoi je vous conseille d’utiliser plutôt la méthode du ΔCT
plutôt que celle du ΔΔCT…
Pour en savoir un peu plus sur cette méthode (cas particulier de la
comparaison de 2 échantillons, calculs des écarts-types) :
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 2 ΔΔCT Avantages : Calculs rapides et facilement automatisables
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
2 ΔΔCT
Avantages : Calculs rapides et facilement automatisables
Les hypothèses font que les courbes standard ne sont
faites qu’une seule fois
Inconvénients :
Hypothèses très (trop?) fortes : E target = E ref = 1
Approximations
pouvant
avoir
des
conséquences
importantes
Calculs assez compliqués. Plusieurs étapes des calculs
nécessitent des hypothèses qui ne sont pas toujours bien
explicitées et que l’on a tendance à oublier quand cette
méthode est utilisée en routine
Applicabilité limitée
Impossibilité d’identifier des échantillons présentant une
efficacité de PCR anormale
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 3 Estimations individuelles des efficacités Phase exponentielle
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
3
Estimations individuelles des efficacités
Phase exponentielle :
X n = X 0 . E n
X n = nombre d’amplicons au cycle n
X 0 = nombre initial de transcrits = ce que l’on souhaite connaître
E
= efficacité de PCR comprise entre 1 et 2
La fluorescence est proportionnelle au nombre d’amplicon
Phase exponentielle :
R n = R 0 . E n
R n = fluorescence au cycle n
R 0 = fluorescence initiale
E
= efficacité de PCR comprise entre 1 et 2
Passage au logarithme
log(R n ) = log(R 0 ) + n . log(E)
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 3 Estimations individuelles des efficacités log(R n ) =
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
3 Estimations individuelles des efficacités
log(R n ) = log(R 0 ) + n . log(E)
Au cours de la PCR, l’appareil enregistre la fluorescence R n en fonction des cycles n
12
100 log(R n )
droite de pente
10
10 log(E) et d’ordonnée
à l’origine log(R 0 )
8
1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
n
6
log
0,1
4
2
0,01
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0,001
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 3 Estimations individuelles des efficacités Le principal
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
3
Estimations individuelles des efficacités
Le principal problème consiste à choisir les points de mesure qui vont être utilisés
pour effectuer la régression linéaire.
Plusieurs solutions ont été proposées dans la littérature.
Le logiciel LinRegPCR (Ramakers C et al., 2003) permet une sélection automatique
des points ainsi que des ajustements manuels.
A partir des droites de régression, on a accès à R 0 et à E ce qui permet de calculer
aisément :
CT
T
E
ref
0
ref
=
K .
CT
soit en utilisant les estimations R 0 et T 0, soit en utilisant les
estimations des efficacités (un peu plus stables a priori)
R
E
target
0
target
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 3 Estimations individuelles des efficacités Avantages : Pas de
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
3
Estimations individuelles des efficacités
Avantages : Pas de courbe standard nécessaire
Les estimations individuelles des efficacités permettent de
repérer aisément des points aberrants présentant des
efficacités de PCR extrêmes
Applicable dans tous les cas (en théorie au moins…)
Inconvénients :
Calculs compliqués. Nécessite un logiciel d’analyse dédié.
En moyenne 4 à 6 points sont utilisés pour réaliser les
régressions. Les estimations des pentes et des ordonnées
à l’origine sont donc peu précises. Au moins avec
LinRegPCR, cela génère une variabilité considérable dans
les données ce qui rend la méthode complètement
inutilisable en pratique (sauf pour identifier des points
aberrants).
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 4 Test de l’homogénéité des efficacités et estimation par
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
4
Test de l’homogénéité des efficacités et estimation par la moyenne des
estimations individuelles
Idée : les différentes estimations individuelles des efficacités de PCR sont peu
précises mais constituent des estimations non biaisées de l’efficacité de PCR réelle
qui est en fait la même pour tous les échantillons
Mise en œuvre :
1)
Estimer les efficacités de PCR dans chaque tube (pour un gène donné)
2)
Réaliser un test pour vérifier qu’il n’y a pas de différence significative entre
les efficacités de PCR des différents groupes d’échantillons
3)
Utiliser la moyenne des efficacités de PCR estimées sur chaque courbe
comme efficacité de PCR globale pour ce gène
4)
En déduire T 0 pour chaque échantillon
5)
Suivre le même processus pour le contrôle endogène et en déduire les R 0
pour chaque échantillon
6)
Calculer les T 0 /R 0 et faire les stats appropriées pour conclure
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 4 Test de l’homogénéité des efficacités et estimation par
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
4
Test de l’homogénéité des efficacités et estimation par la moyenne des
estimations individuelles
Problème : toujours le même i.e. choisir les points de mesure qui appartiennent
à la phase exponentielle (pour fixer le seuil + estimer l’efficacité de PCR)
Idée (Peirson et al., NAR, 2003) : Prendre le max de fluorescence (R max ) et
estimer le min de fluorescence à partir des valeurs sur les 10 premiers cycles de
PCR (R noise ). En déduire le point moyen (midpoint) situé entre ces deux extrêmes.
100
log(R n )
Ce point correspond à peu
près au milieu de la phase
R
10
exponentielle. En
un facteur
prenant
max
10
de
fluorescence
d’autre de
de
part
et
1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
ce
point,
on
n
sélectionne les points situés
Midpoint
0,1
dans la phase exponentielle
(au minimum 3 points)
0,01
R
noise
0,001
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 4 Test de l’homogénéité des efficacités et estimation par
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
4
Test de l’homogénéité des efficacités et estimation par la moyenne des
estimations individuelles
Définition du Point moyen, un peu de calcul…
M = R
+
R
− R
)
noise
1 (
2
max
noise
R
max
Mais on est en échelle
logarithmique…
M
log(
M =
)
log(
R
)
+
1 (log(
2
R
)
log(
R
))
noise
max
noise
R
log(
M
)
=
max
log
R
×
noise
R
noise
R
noise
R
max
M = R
×
noise
R
noise
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 4 Test de l’homogénéité des efficacités et estimation par
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
4
Test de l’homogénéité des efficacités et estimation par la moyenne des
estimations individuelles
Logiciel DART-PCR (Peirson et al., NAR, 2003)
Une fois que l’on a estimé les efficacités de PCR pour chaque courbe, on écrit un
modèle d’analyse de variance du type :
efficacité ~ groupe + ε
et si on a réalisé chaque PCR en triplicat (technique), on peu écrire un modèle plus
complet :
efficacité ~ groupe + échantillon/groupe + ε
On teste ainsi s’il existe un effet groupe sur l’efficacité de PCR et si (au moins) un
échantillon au sein des groupes est différent des autres.
Si vous faites beaucoup de PCR en temps réel, attention à la multiplicité des tests…
UR66, janvier 07
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats 4 Test de l’homogénéité des efficacités et estimation par
Choix méthodologiques pour l’analyse des résultats
4
Test de l’homogénéité des efficacités et estimation par la moyenne des
estimations individuelles
Avantages : Pas de courbe standard nécessaire
Les estimations individuelles des efficacités permettent de
repérer aisément des points aberrants présentant des
efficacités de PCR extrêmes
L’utilisation de la moyenne de ces estimations rend la
méthode robuste
Applicable dans tous les cas (en théorie au moins…)
Inconvénients :
Calculs assez compliqués. Nécessite un logiciel d’analyse
dédié.
Le logiciel DART-PCR actuellement disponible oblige à
faire chaque PCR en triplicats et gère un maximum de 6
groupes et 32 échantillons au total.
Peut-être bientôt (ou pas…) un package R…
UR66, janvier 07
Remerciements Tous les utilisateurs de la PCR en temps réel qui sont venus discuter leurs
Remerciements
Tous les utilisateurs de la PCR en temps réel qui sont venus discuter
leurs manips et résultats avec moi et m’ont permis de mieux comprendre
comment marche cette technique.
Un bon site où trouver des logiciels pour analyser ses PCR : www.gene-quantification.de
UR66, janvier 07