Universidad de Puerto Rico

Recinto Universitario de Mayagez

Departamento de Biologa
BIOL4368: Fisiologa Microbiana
Dr. Carlos Ros Velzquez
Grupo 3:
Jalliam D. Galarza Daz
Louis Maldonado
Kelly M. Barreto Feliciano
Kasandra Gonzlez Ramrez
Edgar J. Carlo Frontera
Yileidys Cirino Lpez
Lyanne V. Ponce Hernndez
Carlos M. lvarez Balbosa
Efrain Rodriguez Ocasio
Examen de contestar en casa grupal (take home) del curso de fisiologa
microbiana. (127pts)
Conteste las siguientes preguntas, sea breve y especfico, no ms de tres pginas
por pregunta. Cite ejemplos, y utilice figuras y diagramas cuando lo requiera.

1. Hemos podido determinar en clase cmo distintas situaciones de estresor,

producen seales que terminan con respuestas fisiolgicas especficas. Determine
cmo los microorganismos perciben y responden a ese evento (Presente de forma
diagramtica (indicando diagramas de interaccin), la red regulatoria basada en
estmulo-respuesta): (35 pts)
a. Presencia de ppGpp

Figura 1. Guanosina tetrafosfato es un nucletido pequeo que acta como un

regulador global en la expresin de genes en organismos bacterianos. El mismo es
sintetizado como una respuesta a la inanicin (Srivatsan, 2008). El diagrama demuestra
una bacteria E. coli, que est recibiendo una seal externa que le causa estrs a la clula.
Esa seal puede ser la ausencia de nutrientes como glucosa. E. coli tiene dos enzimas
que son parte del proceso: RelA codifica para sintetizar ppGpp y SpoT inhibe la
produccin de guanosina tetrafosfato.
b. Presencia de valinomicina

Figura 2. Valinomicina es un pptido cclico que neutraliza potasio (K +), rodeando la

carga con 6 oxgenos de un grupo carbonilo. Este ionoforo ataca la clula microbiana,
en el diagrama demostrada como E. coli. El antibitico perturba procesos tales como la
fosforilacion oxidativa donde puede reducir la produccin del ATP, aumentar la tasa de
consumo de oxgeno, incrementar pH a travs del gradiente en la membrana y liberar
calor.
c.Choque trmico

Figura 3. Cuando un microorganismo recibe un choque trmico, tal como se muestra en el

diagrama, se activan unas protenas de estrs conocidas como Heat shock proteins (HSP).
El choque trmico comienza a desnaturalizar las protenas intracelulares, no obstante, los
HSP se unen a estas protenas, as protegindolas durante el periodo de estrs. Una vez el
estrs haya culminado (en este caso el choque trmico) los HSP ayudan a las protenas que
se haban desnaturalizado en el principio a volver a ensamblarse y continuar con sus
funciones.
d. Esporulacin

Figura 4. Una bacteria productora de esporas que enfrenta calor, desecacin, radiacin o
alguna influencia qumica, tiene como respuesta fisiolgica formar una endospora. La
membrana plasmtica se separa as formando la clula vegetativa (Color Rojo) y la
endospora (Color Verde). La endospora contiene el ncleo y toda una maquinaria
metablica esencial para sobrevivir.
e. delecin de de genes que codifican para ARC

Figura 5. El sistema de dos componentes Arc juega un papel importante en la regulacin de

metabolismo a nivel de transcripcin en las bacterias. El mismo est compuesto por el sensor
transmembranal ArcB, y la protena ArcA. Bajo condiciones anaerobias, ArcB se autofofsorila y
transfosforila a ArcA, quien a su vez activa o reprime la expresin de su opern. Bajo condiciones
aerbicas, ArcB acta como fosfatasa que cataliza la defosforilacion de ArcA-P, liberndola de su
regulacin transcripcional. [1]

La delecin de los genes que codifican para Arc, desmantelara el sistema de regulacin de su
opern. Sin la protena ArcB, no se podra recibir la seal que en este caso es el Oxgeno. Si ocurre
delecin del gen que codifica para ArcA, la seal se recibira, pero el opern no se regulara porque
no haba un regulador. La transcripcin ocurrir o no, dependiendo de la funcin de ArcA en el
opern especifico. En E. coli, este sistema controla la transcripcin de sobre 30 operones [2].
f. delecin de de genes que codifican para FNR

Figura 6. FNR es una de las protenas que regula la transcripcin, que adems controla la
expresin de genes reguladores de oxgeno en E.coli. FNR se caracteriza por ser un regulador que
es esencial para expresar respiracin anaerbica. Esta protena es regulada por la disponibilidad de
oxgeno. La presencia del grupo [Fe-S] est asociada a un incremento en la dimerizacin de la
protena. Por lo tanto, el grupo es necesario para que la protena pueda realizar su funcin.
e. delecin de genes que codifican para Fts y Mreb.

Figura 7. Las protenas Fts son esenciales para la divisin celular ya que forman un anillo unido al
complejo de divisoma y crea la divisin que permite separar la clula madre de la clula hija. La
delacin de los genes que codifican para estas protenas interrumpe la divisin celular y resulta en
una clula larga y filamentosa con el doble de su material gentico. [1]
La protena MreB es un factor importante en la definicin morfolgica de las clulas. La
delecin de genes de codifican para ella en bacilos cambia su morfologa a cocoide y bacterias con
forma de coco, no se ha encontrado el gen para Mreb. Es por esto que se cree que la forma bsica
de todas las bacterias es esfrica. [2]

Citas
1. Madrigal-Matut, J., Lopez-Franco, O., Blanco-Colio, L., Muoz-Garca, B., Ramos-Mozo,
P., Van Oostrom, M., Egido, J., Martin-Ventura J., Baptiste Michel J. (2009, August).
Clnica e Investigacin en Arteriosclerosis. Retrieved April 17, 2015, from
http://www.elsevier.es/es-revista-clinica-e-investigacion-arteriosclerosis-15-articulo-lasproteinas-choque-termico-heat-13140579
2. Madrigal-Matut, J., Lopez-Franco, O., Blanco-Colio, L., Muoz-Garca, B., Ramos-Mozo,
P., Van Oostrom, M., . . . Egido, J. (2009, August 1). Clnica e Investigacin en
Arteriosclerosis. Retrieved April 17, 2015, from http://www.elsevier.es/es-revista-clinica-einvestigacion-arteriosclerosis-15-articulo-las-proteinas-choque-termico-heat-13140579
3. Ilustracin obtenida de: 10.1073/pnas.0708739104 PNAS November 6, 2007 vol. 104 no.
45 17795-17800
4. Ilustacin por Efran Rodrguez Ocasio
5. Magnusson, LU., Farewell, A., Nystrom, T. (2005, May). ppGpp: A global regulator in E.
coli. Retrieved April 17, 2015, from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15866041
6. Srivatsan, A., Wang, JD. (2008, April). Control of Bacterial Transcription, Translation and
Replication
by
ppGpp.
Retrieved
April
17,
2015,
from
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18359660
7. Madigan M.T.; J.M. Martinko; K.S. Bender; D.A. Stahl; D.P. Clarck. 2012. Brock Biology
of
Microorganisms (13th ed.). Pearson Education. p. 404, 714. ISBN 0-321-64963-X.
8. Spiro, Stephen., Guest, JR. (1990, August). FNR and its role in oxygen-regulated gene
expression
in
E.
coli.
Retrieved
April
17,
2015.
http://femsre.oxfordjournals.org/content/6/4/399
9. Raisman, J. (n.d.). Endsporas y formas de persistencia. Retrieved April 17, 2015, from
http://www.biologia.edu.ar/bacterias/micro7.htm

10. Madigan M.T.; J.M. Martinko; K.S. Bender; D.A. Stahl; D.P. Clarck. 2012. Brock Biology
of
Microorganisms (13th ed.). Pearson Education. p. 118-19. ISBN 0-321-64963-X.
11. Madigan M.T.; J.M. Martinko; K.S. Bender; D.A. Stahl; D.P. Clarck. 2012. Brock Biology
of
Microorganisms (13th ed.). Pearson Education. p. 120-21. ISBN 0-321-64963-X.

2. Compare y contraste entre los sistemas de secrecin. Indicando las protenas involucradas,
organismos que los poseen, funcin en la clula, Qu ventajas para la bacteria y desventajas
para el hospedero proveen estos sistemas de transporte (secrecin)? (20 pts)

Sistema de
Secrecin

Protenas
involucradas

-Transportador

Tipo I

Tipo II

ABC
(en
la
membrana interna)
-Protena
de
Fusin
(PF)
(anclada
a
la
membrana interna )
-Protena
Periplasmtica
(PME) (forma el
canal
de
la
membrana externa)

-SecB
(protena
chaperona de la
MI)
-SecYEG unida a
SecA
-GspD (pertenece a
la familia de las
secretinas)
-

Funcin

Organismos

Ventajas para
la bacteria y
desventajas
para el
hospedero

-Secrecin de
toxinas,
proteasas y
lipasas

-Bacterias Gram
negativo (-) como
por
ejemplo
Escherichia coli

-Le
da
la
ventaja a la
bacteria
de
transportar
diversas
molculas
y
tambin
permite
la
exportacin de
sustratos
no
proteicos como
por
ejemplo
polisacridos

-Secrecin de
toxinas y
enzimas
hidrolticas

-Bacterias Gram
negativo (-) como
por
ejemplo
Vibrio cholerae

-Este sistema
de secrecin le
permite a la
bacteria
transportar
protenas en un
solo paso.

GspBCFGHIJKL
MNO (localizas en
la
membrana
interna)
-GspS
(lipoprotena de la
membrana externa)
-ATPasa GspE

Tipo III

-Ms de 20
protenas (se
ensamblan en
largas estructuras
macromoleculares
y factores de
virulencia)
-Protenas
Perifricas

-Relaciones
simbiticas
-Biognesis
flagelar
-Pasar factores
de virulencia a
la clula
husped

-Protena FliI (es

la ATPasa que
proporciona la
energa para la
exportacin de los
sustratos)

-Ha sido
identificado en un
gran variedad de
patgenos como
por ejemplo:
Bordetella,
Chlamydia,
Erwinia, E. coli,
Pseudomonas,
Ralstonia,
Rhizobia,
Salmonella,
Shigella,
Xanthomonas, y
Yersinia

-Protenas
Efectoras
-Chaperonas

Sistema de
Secrecin

Protenas
involucradas

Funcin

Organismos

-Le
da
la
ventaja a la
bacteria
de
crear
relaciones
simbiticas y
biognesis
flagelar pero
tambin pasar
factores
virulentos
a
clulas
hospederas.
Los
factores
virulentos
representan
desventajas
para
el
hospedero
porque pueden
afectar
sus
sistemas.

Ventajas para la
bacteria y desventajas
para el hospedero

-VirB (VirB 1 a
VirB11)

- Transporte de
protenas ,
ADN y toxinas

-VirD4

Tipo IV

Tipo V

-ATPasas

-Protenas
de
sistema Sec (MI)

- Transporte de
protenas

-Helper protein

-Factor de
virulencia

-Protenas de la
membrana externa

-Protena Efectoras

Tipo VI

-Chaperona
citoplasmtica
-Protenas
formadoras del
poro

-Transportar
protenas
efectoras
directamente al
citoplasma

-Se encuentran en
bacterias Gram
negativas y Gram
positivas
- Agrobacterium
tumefaciens,
Helicobacter
pylori, Bordetella
pertussis,
Legionella
pneumophila, y
Brucella suis

Este
sistema
de
secrecin le permite a la
bacteria
introducir
protenas, toxinas y ADN
a clulas eucariotas. Este
representa una ventaja
para la bacteria pero una
desventaja para la clula
hospedera por que la
introduccin de estas
sustancias podra alterar
su sistema.

-Bacterias Gram
negativo (-) como
por ejemplo:
N. gonorrhoeae,
E. coli.
Y. enteroliticola,
B. pertusis,
H. pylori,
S. marcescens.

-Este
sistema
de
secrecin le permete a la
bacteria
transportar
protenas y funcionar
como factor de virulencia
a travs de la formacin
de un poro en la
membrana.
Esto
representa una ventaja
para la bacteria porque
le da la capacidad de
establecerse, diseminarse
en el hospedero.

- Bacterias Gram
negativo (-) como
por ejemplo Vibrio
cholerae,
Samonella
entrica,
Pseudomonas
aeruginosa,
Legionella
pneumophila, y
Rhizobium
leguminosarum

-Este
sistema
de
secrecin le da la ventaja
a la bacteria introducir
protenas directamente
por
medio
de
inyectosoma y propagar
factores de virulencia a
las clulas hospederas.
Este material introducido
afectara a las clulas
hospederas.

Sistema de
Secrecin

Protenas
involucradas

Protena
integral Rv3877

Tipo VII

Funcin

Organismos

Ventajas para la
bacteria y
desventajas para el
hospedero

-Transportar protenas

-Bacterias Gram
positivas (+)
-Mycobacterium,
Basillus
clostridium,
Staphylococcus
aureus, y Listeria
monocytogenes

- Este sistema de
secrecin le da la
ventaja a la bacteria
transportar
protenas a travs de
una
membrana
hidrofbica
y
altamente
impermeable.

-Transportar proteinas
completamente dobladas
o con cofactores.

-Se encuentra en
bacterias Gram
+ , Gram , en
arqueas y
tilakoides de
cloroplasto

-Aumenta
la
degradacin
de
molculas
organofosfatadas en
las plantas.

-Protenas que
forman un canal
en la membrana
-ATPasas

Sistema Tat

-Proteinas
TatA,TatB,
TatC,Tat D y
TatE.

Referencias
Goosens, V. J., Monteferrante, C. G., & van Dijl, J. M. (2014). The Tat system of Grampositive bacteria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, 1843(8), 1698
1706. http://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2013.10.008
Song, Y., Nikoloff, J. M., & Zhang, D. (2015). Improving Protein Production on the Level
of Regulation both of Expression and Secretion Pathways in Bacillus subtilis. Journal of
Microbiology and Biotechnology.
3. Indique si las siguientes situaciones tienen sistemas de regulacin de dos componentes e
indique las protenas participantes (12 pts):
a. esporulacin
b. dao oxidativo
c. competencia (internalizar DNA)

d. cambios osmticos
e. fotosntesis
f. patognesis
En un ambiente donde el ms apto sobrevive, es necesario que un organismo tenga los
mecanismos y capacidades ms eficientes para responder una diversidad constante de estmulos
ambientales. Para muchos organismos estas adaptaciones han sido el resultado de miles de aos de
evolucin y/o competencia directa con otros organismos en un mismo ambiente en el cual se
compite por un limitado (muchas veces escaso) recurso. En los hongos, plantas y bacterias es el
sistema de transporte de dos componentes (SDC) el responsable de responder y regular los distintos
estmulos ambientales. El funcionamiento del SDC depende de la transferencia consecutiva de un
grupo fosfato entre un residuo de Histidina y un Aspartato que se encuentran en dos protenas; una
quinasa sensora de histidina (CS) y otra conocida como regulador de la respuesta (RR). Es el RR,
por lo general un residuo fosforilado de Aspartato, el que reconoce una secuencia especfica de
ADN (opern), causando la regulacin de unos genes determinados. Aunque existen distintos
sistemas de dos componentes en diferentes organismos, cabe mencionar que estos contienen cierta
homologa entre s, lo que significa que poseen un grado de similitud en la secuencia del opern
que codifica para los distintos SDC. Es pues, esta cierta homologa, til como herramienta en la
Taxonoma.
A continuacin se muestra una imagen de un sistema de transporte de dos componentes. Para
propsitos
de
la
clase
se
presentar
un
SDC
bacteriano.

Figura 1. Se muestra el sistema regulatorio de dos componentes, el cual tiene la funcin de permitir
que la bacteria por medio de sensores sienta y se adapte a diversos medio ambientes para permitir
que sus funciones sean llevadas a cabo de una manera mediante la cual la bacteria pueda realizar
sus funciones principales.
Tabla 1: Se muestran distintos sensores de estmulos y reguladores a estos.

Estimulo

SDC

Sensor/regulador

Esporulacion

Si

KinA/Spo0

Dano Oxidativo

No

OxyR

Competencia

Si

LexA/RecA

Cambios Osmoticos

Si

EnvZ/OmpR

Fotosintesis

Si

RegB/RegA

Patogenesis

Si

RavR/RavA

4. Disee un experimento para probar que una protena es translocada usando el

sistema Tat. (10 pts).
Sistema Tat:

Figura1: Se presenta el sistema Tat en una bacteria Gram negativa. (Melani, S.,2002)
El sistema Tat (Twin Arginine Translocation) media el transporte precursor Secindependiente de protenas dobladas a travs de membrana del plasma de la bacteria o la membrana

tilacoide del cloroplasto ( Gohlke et al, 2005). El sistema bacteriano de translocacin doble de
arginina (Tat) es capaz de exportar enzimas que contienen el cofactor dentro del periplasma
(Santini et al, 2001). El sistema de acercamiento del sistema Tat consiste de 2 tipos de protenas,
miembros de las familias TatA y TatC (Yeng et al, 2002). El TatA (tambin conocido como mttA1),
TatB (mttA2) y TatC (mttB) son los primeros tres cistrones del opern TatABCD (Weiner et al.,
1998). Anlisis filogenticos revelan que la mayora de los sistemas Tat procariontes consisten de
un TatC homlogo y dos secuencias divergentes TatA homlogas (TatA y TatB) ( Yeng et al, 2002).
Las protenas sustrato son dirigidas del aparato Tat por una seal de pptidos distintiva conocida
como terminal N (N-terminal) la cual contiene un consenso SRRxFLK twin arginie motif
(Sargent et al., 2002
Componentes del sistema Tat bacteriano:
o Protenas: Tat A, Tat B, Tat C, Tat E y Tat D
o a-hlice
o N-terminal
Diseo Experimental: Bacteriano
Un ejemplo simple sera mutar el gen de la protena TatA/TatE en una bacteria. Cabe
mencionar que en las bacterias Gram (+) carecen del complejo TatB, es por esto que el complejo
TatA es bifuncional y compensa por la falta del complejoTatB. As que si mutamos el opern que
contiene los genes del complejo TatA/TatE, el sistema de translocacin TatABC no podr
reconocer el pptido seal de una protena doblada en su terminal N, por consecuente la
translocacin proteica no ocurrira. He aqu el problema de las mutaciones al complejo TatA/TatE
el cual presentara un problema para las protenas dobladas esenciales dado que estas no
atravesaran la membrana en su conformacin biolgicamente activa.
Importante: Para la seleccin de la protena modelo se verific que la secuencia de la misma
codificara para la pptida seal del sistema TatABC.
En una clula con el sistema Tat funcional se hace un primer fraccionamiento, en el cual
previamente se ha seleccionado una protena doblada la cual ha sido marcada con fluorocromo.
Bajo microscopio se observar la ubicacin de la protena modelo para identificar que el sistema
Tat est funcionando apropiadamente y que ocurre el transporte de la protena modelo a dos
fracciones celulares. Este paso servir como el paso control positivo.
En la clula con el sistema Tat mutagenizado se lleva a cabo un fraccionamiento celular para
verificar que la actividad en la membrana no ha ocurrido, al no haber ocurrido quiere decir que
nuestro sistema Tat no funcion debido a la mutacin. Dado a que ocurri la mutacin podemos
observar la protena modelo radioactiva va a estar presente en un solo fraccionamiento celular.

Referencias:


Santini, C. L., Bernadac, A., Zhang, M., Chanal, A., Ize, B., Blanco, C., & Wu, L. F. (2001).
Translocation of jellyfish green fluorescent protein via the Tat system of Escherichia coli and
change of its periplasmic localization in response to osmotic up-shock. Journal of Biological
Chemistry, 276(11), 8159-8164.
Melani, S. (2002). Caracterizacion del Sistema Tat (Twin Arginine Translocase) de
transporte de protenas en Rhizobium leguminosarum bv viciar UPRM791.P.12.

Yen, M. R., Tseng, Y. H., Nguyen, E. H., Wu, L. F., & Saier, M. H. (2002). Sequence and
phylogenetic analyses of the twin-arginine targeting (Tat) protein export system. Archives of
Microbiology, 177(6), 441-450.

Sargent, F., Berks, B. C., & Palmer, T. (2002). Assembly of membrane-bound respiratory
complexes by the Tat protein-transport system. Archives of microbiology, 178(2), 77-84.

Gohlke, U., Pullan, L., McDevitt, C. A., Porcelli, I., de Leeuw, E., Palmer, T., ... & Berks,
B. C. (2005). The TatA component of the twin-arginine protein transport system forms channel
complexes of variable diameter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 102(30), 10482-10486.

Weiner, J.H., Bilous, P.T., Shaw, G.M., Lubitz, S.P., Frost, L., Thomas, G.H., et al. (1998) A
novel and ubiquitous system for membrane targeting and secretion of cofactor-containing proteins.
Cell 93: 93101.

5. Seleccione una chaperona distinta a GROEL/ES y muestre diagramticamente cmo ejerce

su funcin propuesta (10pts).
Seleccionamos las chaperonas DnaK/DnaJ, las cuales son involucradas en el doblez
correcto de protenas que han sido desnaturalizada por calor, pero tambin se ha visto su
cooperacin en procesos de replicacin de ADN y exportacin de Protenas. Son parte de las
familas de proteinas HSP40 y HSP70.
Figura 1: Ciclo de la chaperona DnaK

La figura 1 nos muestra el ciclo de la chaperona DnaK. Antes de escribir el proceso, es importante
sealar que este ciclo depende del mecanismo Hsp70-Hsp40-GreP. Este mecanismo se encarga de
velar por aquellas protenas que pueden experimentar un desenvolvimiento parcial y la Hsp70 se
enlaza a estas protenas y les da el doblez correcto. El ciclo comienza cuando DnaJ se enlaza al
pptido hidrofbico, que tambin se conoce como un segmento de protena con un doblez
incorrecto, y lo transporta hacia el surco de DnaK. Ambas chaperonas se enlazan a residuos
hidrofbicos de la cadena extendida de la protena, los cuales luego de que la protena sea doblada
correctamente estarn en el interior de la protena. Esta DnaJ es una chaperona que se enlaza a
DnaK por dos lugares y contribuye al ciclo de DnaK porque contiene la protena Hsp40, la cual
interacta con DnaK Hsp70 para capturar los sustratos de protenas. Luego DnaJ promueve la
hidrlisis de ATP en el terminal-N del dominio de Hsp70 de DnaK, la cual ayuda a mantener el
sustrato en el surco y luego la DnaJ se disocia, causando cambio conformacional en DnaK en el
surco de enlace del pptido (de abierto a cerrado). Se queda un ADP enlazado al terminal amino de
DnaK. El complejo entonces espera por la seal para liberar el sustrato. Esto se logra cuando la cochaperona del ciclo, GrpE, se enlaza a Hsp70, liberndose el ADP de la DnaK. Llega ATP y GreP
entonces estimula la hidrolisis de ATP, y baja la afinidad de la chaperona por la protena enlazada,
cambiando la conformacin del sitio de enlace con el pptido de cerrado a abierto. Una vez ocurre
la hidrlisis del ATP, GreE y el sustrato son liberados, dejando DnaK con ATP libre para poder
comenzar con otra protena.
Referencias:
Won-Chul Suh, William F. Burkholder, Chi Zen Lu, Xun Zhao, Max E. Gottesman, Carol
A. Gross. Interaction of the Hsp70 molecular chaperone, DnaK, with its cochaperone DnaJ.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95(26). P.
15223-15228.

Teter, S. & Hartl, F. U. Protein folding in vivo. Encyclopedia of Life Sciences.Nature

Publishing Group, London, 2001.
Angewandte Chemie Int. Ed. 41, 1098 (2002)
MolscularChaperones.
http://faculty.uml.edu/vbarsegov/teaching/bioinformatics/lectures/ChaperonesModified.pdf

6. Describa 5 ejemplos de metabolitos secundarios y en qu etapa de la curva de crecimiento

son producidos?, Qu molculas podra usar como reporteros para saber en qu etapa de
crecimiento se encuentra una bacteria? (15pts).
Un metabolito secundario es un compuesto mayormente producido en la etapa logartmica
tarda o la etapa estacionaria del microorganismo. Estos no son esenciales para el crecimiento
normal del microorganismo y usualmente son producidos como respuesta a estrs. La produccin
de los metabolitos secundarios es de suma importancia para las industrias, la medicina y la rama de
la biotecnologa ya que incluyen antibiticos, inmuno moduladores y compuestos anti-tumor
(Ichikawa et al; 2014). Un ejemplo de un metabolito secundario es el perxido de hidrgeno (H 2O2)
producido por el gnero bacteriano, Mycoplasma (Burki et al; 2015). El H2O2 es un factor de
virulencia que causa la muerte celular, la inhibicin se actividad ciliar y la peroxidacin de lpidos
de bacterias que no contenga la enzima catalasa. El glicerol es catalizado y usado por los
Mycoplasmas para generar H2O2 en la fase estacionaria donde la concentracin de bacterias es alta
y hay competencia por los recursos (Pritchar et al; 2014).
La bacteria Streptomyces hygroscopicus produce un metabolito secundario utilizado como
un frmaco aprobado por la Food and Drugs Administration (FDA) con nombre comercial
Sirolimus. Este compuesto es una molcula llamada rapamicina, la cual se us al principio como un
anti fngico pero se descubri que afecta el metabolismo de las clulas de mamferos y acta como
un potente inmunosupresor y neuroprotector de clulas (Li et al; 2014). Rapamicina tiene
propiedades anti cncer y se usa para tratar pacientes con cncer renal, neuroendocrino o del seno.
(Barlow et al; 2013) Se ha demostrado, por medio de modelos con ratas, que este metabolito
secundario tiene propiedades anti vejez ya que retrasa enfermedades asociadas a la edad avanzada
(Van Meter et al; 2012). La rapamicina es producida por Streptomyces hygroscopicus en mayor
concentracin en su etapa estacionaria de crecimiento.

Molcula de rapamicina
La prodigiosina es un pigmento de color rojo producido como metabolito secundario en la
etapa estacionaria de las bacterias pertenecientes al gnero de Serratia. El pigmento est asociado a
la membrana y no se ha determinado su rol fisiolgico aunque se asocia a la motilidad de la
bacteria por swarming motility (Fender et al; 2012). Es interesante notar que prodigiosina
contiene el mismo anillo de pirrol que se encuentran en molculas de transferencia de energa como
las porfirinas, la clorofila y la bacterioclorofila pero an no est claro si tiene un rol en reacciones
de transferencia de energa. (Kelly S. Bender, n.d.). Este pigmento se ha demostrado que tiene
actividad antimicrobial y ha sido relacionado con la adhesin de Serratia Marcenses a superficies
no polares. (Shanks et al; 2013)

Molcula de prodigiosina
prodigiosina

Colonia de S. marcenses expresando

La spinosina A y spinocina D son liberados como metabolito secundario de la bacteria de

suelo Saccharopolyspora spinosa (Jha et al., 2014). El insecticida se considera de amplio espectro
y su uso se populariz desde el 1999 (Jha et al., 2014). Estos dos compuestos, producidos por
fermentacin arobica en la fase estacionaria de crecimiento, forman un bioinsectisida potente

llamado Spinosad. Utilizando ingeniera gentica se logr obtener una sobre expresin de
spinosina, triplicando la produccin de la cepa salvaje de S. spinosa (Zhang et al., 2014).
La bacitracina es un pptido antibitico no ribosomal producido por las bacterias Bacillus
subtilis y Bacillus licheniformis (Qi et al; 2008). Su actividad primaria es en contra de los cocos y
bacilos Gram positivos al igual que algunas arqueas como Methanobacterium (Qi et al; 2008). Es
un compuesto importante para las industrias farmacuticas ya que lo procesan como medicamento
en forma de ungento para tratar infecciones humanas. Bacitracina acta formando un complejo
con el lpido isoprenyl pyrofosfato, el cual es mediador de iones divalentes, lo cual tiene por
consecuencia la interrupcin e inhibicin de la pared celular del microorganismo (Qi et al; 2008).
Este antibitico se comienza a producir en la etapa logartmica tarda y en mayor concentracin en
la etapa estacionaria de crecimiento (Ouled Haddar, Munim Aziz, & Hussein Al-Gelawi, 2007).
Un reportero es una protena con una localizacin o funcin especfica, se puede fusionar
con un gen para que se exprese y se cree una seal. El gen luxAB de la bacteria Vibrio
harveyi produce una luciferasa bacteriana cuya luminiscencia cambia en la fase logartmica y
estacionaria de crecimiento (Wiles et al; 2005). El microorganismo de inters se transforma con el
fin de que obtenga un plsmido con el gen de luxAB para que se pueda expresar. La luciferasa se
comienza a expresar en la etapa logartmica de crecimiento donde alcanza un mximo de
bioluminiscencia en la etapa logartmica media. En la etapa estacionaria la bioluminiscencia decae
hasta por un factor de 10 debido a los cambios metablicos de la clula (Wiles et al; 2005). En la
fase lag al igual que la fase de muerte no ocurre bioluminiscencia porque la luciferasa no se est
expresando.
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7. Utilizando el programa Tmpred y el de generacin de curvas de hidrofobicidad

(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html;http://www.vivo.colostate.edu/mol
kit/hydropathy/index.html), indique si las siguientes protenas son o no transmembrnicas,
demuestre su respuesta (20pts):
a. MQAQITGRPEWIWLALGTALMGLGTLYFLVKGMGVSDPDAKKFY
AITTLVPAIAFTMYLSMLLGYGLTMVPFGGEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLV
DADQGTILALVGADGIMIGTGLVGALTKVYSYRFVWWAISTAAMLYILYVLFFGFTSK
AESMRPEVASTFKVLRNVTVVLWSAYPVVWLIGSEGAGIVPLNIETLLFMVLDVSAKV
GFGLILLRSRAIFGEAEAPEPSAGDGAAATS
De acuerdo al diagrama de Kyte-Doolittle, las regiones transmembranicas estn determinadas por
los picos en la grfica que son mayores de 1.6 y con un "window size" de 19 y las regiones
superficiales estn determinadas por los picos debajo de la lnea del medio, o cero y un "window
size" de 9.
Grafica 1: Grafica de Hidrofobicidad con "window size" de 9

Segn la grfica 1, esta protena si tiene regiones superficiales porque tiene picos debajo de la lnea
del medio o cero.

Grafica 2: Grafica de Hidrofobicidad con "windows size" 19

La grfica 2 nos muestra que la protena si tiene regiones transmembrnicas porque tiene picos que
estn o exceden de 1.6 y se puede ver ms claro que hay muchas ms regiones transmembrnicas
que superficiales, o sea, hay ms picos mayor o igual a 1.6 que picos por debajo de cero.
Utilizando el programa TMpred, el cual utiliza un algoritmo de matrices para comparar la
secuencia con protenas transmembranicas conocidas, se determinaron la cantidad de hlices
hidrofbicas con un largo entre 19 y 35 amino cidos, dado que se requiere un mnimo de
aproximadamente 20 amino cidos para poder atravesar la membrana. El programa predijo un total
de 6 hlices transmembranicas con direccin de adentro hacia afuera, sin embargo, segn las
puntuaciones dadas a cada hlice, solo 5 son significativas. De igual manera, predijo 7 hlices
transmembranicas con orientacin de afuera hacia adentro, de las cuales todas recibieron
puntuaciones altas (mayor de 500) por lo que todas son consideradas significativas y probables.
Todas las hlices contenan residuos de 19 o ms amino cido. Luego determin las
correspondencias entre los hlices, diciendo cuales hlices de direccin adentro-afuera corresponde
con las de afuera-adentro y cul de las dos orientaciones es la ms preferida.

Grafica 3:

La grafica 3 nos muestra la hidrofobicidad de las correspondencias de hlices, donde i-o

demuestra as hlices de orientacin interna-externa y o-i externa-interna, el eje de x es la cantidad
de amino cidos en la protena y el eje de y las puntuaciones de hidrofobicidad. Los picos mayores
de 500 demuestran la hlice hidrofbica, siendo la lnea con el pico ms alto la orientacin
preferida de dicha hlice. Los picos debajo de cero corresponden a las reas hidrofilicas de la
protena. Vemos que hay una gran cantidad de reas hidrofbicas e hidrofilicas, sin embargo,
aparentan haber ms picos hacia el rea hidrofbico.
De acuerdo con estos resultados, el programa sugiere dos modelos topolgicos. El primer
modelo demuestra que la protena tiene un total de 7 hlices, alternando en orientacin de adentroafuera, con el terminal amino afuera de la membrana y una puntuacin de 11636, siendo este
modelo el ms preferido. El segundo modelo demuestra 6 hlices transmembranicas, con la primera
y a ultima ambas orientadas hacia el interior de la membrana y una puntuacin de 9637.
Dado que los diagramas y el programa TMpred ambos concordaron con el resultado de una
protena transmembranica, concluimos que la protena codificada en la secuencia A si es
transmembranica.
Verificando el dominio de esta protena usando bases de datos de CDD (conserved domain
database), encontramos que esta secuencia corresponde a un dominio asociado a una protena
llamada rodopsina, la cual es responsable del transporte dependiente de luz de iones del exterior al
interior de la clula bacteriana. Esta funcin requiere que la protena sea transmembranica, por lo
que se entiende que su funcin concuerda con su localizacin transmembranal en la clula.

b. MAPPSYSDLGKQARDIFSKGYNFGLWKLDLKTKTSSGIEFNTAG
HSNQESGKVFGSLETKYKVKDYGLTLTEKWNTDNTLFTEVAVQDQLLEGLKLSLEGNF
APQSGNKNGKFKVAYGHENVKADSDVNIDLKGPLINASAVLGYQGWLAGYQTAFDTQQ
SKLTTNNFALGYTTKDFVLHTAVNDGQEFSGSIFQRTSDKLDVGVQLSWASGTSNTKF
AIGAKYQLDDDASVRAKVNNASQVGLGYQQKLRDGVTLTLSTLVDGKNFNAGGHKIGV
GLELEA
Grafica 4: Grafica de Hidrofobicidad con "window size" de 9

La grafica 4 nos muestra que esta protena tiene muchas ms regiones superficiales que
trasmembranicas porque hay solamente dos picos que son mayor o igual a 1.6 mientras que el resto
de los picos estn por debajo de 1.6 y muchos de esos por debajo de cero, lo cual indica regiones
superficiales.

Grafica 5: Grafica de Hidrofobicidad con "windows size" 19

Como fue mencionado anteriormente el "windows size" 19 se utiliza para identificar mejor
las regiones transmembrnicas o picos de 1.6 o ms y esta grafica nos muestra que son muy pocos,
quizs 3 o 4, mientras que el resto de los picos no se consideran regiones transmembrnicas.
De acuerdo con TMpred y usando parmetros para 19-35 residuos, solo se pudieron
predecir dos hlices transmembrnicas de orientacin interior-exterior, con 20 o ms residuos. La
primera con puntuacin de 592 y la segunda con puntuacin de 394, por lo que solo la primera se
considera significativa. No se encontraron hlices transmembranicas con la orientacin exteriorinterior, por la cual no hay anlisis de correspondencias.

Grafica 6:

En la grfica 6 observamos la hidrofobicidad correspondiente a las hlices predichas.

Observamos que la mayora de los picos estn por debajo de 0 y que solamente un pico llega a la
puntuacin de 500 de aqu vemos que no hay correspondencias para hlices trasmembranicas, ya
que todas las hlices que se pueden generar por el programa estn en la regin debajo de 0, siendo
hidrofilicas. Tambien se puede determinar que, en trminos absolutos, las puntuaciones debajos de
cero son muchos mayores que las que estn por encima de ello. Se puede determinar que la
protena probablemente se encuentre en el interior de la clula.
El programa logr hacer dos modelos posibles, el primero siendo de una hlice
transmembrnica interna-externa, o sea con su terminal amino hacia el interior de la clula. El
segundo modelo de muestra que no hay hlices transmembrnicas. El primer modelo tiene una
puntuacin total de 592, por lo cual es poco confiable, ya que se puede deber a residuos que estn
en el interior de la estructura de la protena.
Debido a que se lee que solo se encuentra una helice transmembranica de 20 residuos, y la
protena tiene 282 residuos, se entiende que hay una alta probabilidad, segn lo predicho e
interpretado por TMpred, que esta protena no sea transmembranica. Por lo argumentado
anteriormente utilizando TMpred y las grficas de hidrofobicidad Kyte-Doolitle, hemos
determinado que esta protena no es transmembrnica.
Si se hace una bsqueda en CDD (conserved domain database) de esta secuencia, se
encuentra que su dominio corresponde a una porina encontrada en la membrana externa del
mitocondria de la clula eucariota, por lo cual se confirman los resultados obtenidos por las
predicciones anteriores.
Referencias:

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8. Hay relacin o conexin entre PTS y quimiotaxis?, demuestre (5pts)
S, hay relacin entre PTS y quimiotaxis. El sistema PTS mediado por quimiotaxis est
relacionado al transporte. La enzima I, HPr y el complejo de protenas IIABC junto al PEP estn
envueltos en el proceso de quimiotaxis durante el proceso de PTS. El complejo de protenas II ABC
del sistema de PTS catalizan tanto el transporte como la quimiorecepcin. Es importante sealar
que en el sistema de PTS tanto e proceso de excitacin como el de adaptacin son desencadenados
por medio de la fosforilacin. Las protenas II ABC son importantes para establecer una correlacin
entre PTS y quimiotaxis porque estas pueden interactuar con diferentes componentes de
quimiotaxis para poder procesar la seal de quimiotaxis y as, en el caso de PTS, poder translocar
una azcar hacia el interior de la clula. Se entiende que PTS es responsable de transportar azcar,
el alimento de la bacteria, al interior de la clula. Por medio de quimiotaxis, la bacteria responde
al estmulo de le presencia de estos azucares y se dirige hacia ellas, haciendo posible el mecanismo
de transporte. Se ha encontrado que durante el sistema de quimiotaxis de E.coli, enzimas del PTS
se enlaza a quinasa Che A para controlar la fosforilacin de Chey en respuesta a cambios en el
transporte de azucares (entrada de hexosas) y metabolismo. Esta interaccin demuestra la
importancia de la relacin entre PT y el sistema de quimiotaxis en las bacterias.
Referencias:
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