ELECTROFORESIS

La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente

elctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas segn su tamao y
carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa.
La gran mayora de macromolculas estn cargadas elctricamente y, al igual que
los electrolitos, se pueden clasificar en fuertes y dbiles dependiendo de la
constante de ionizacin de grupos cidos y |bsicos. Por ejemplo los cidos
nucleicos son policidos fuertes.
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La separacin puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte

slido ejemplo:

Electroforesis a travs de una matriz porosa (electroforesis en gel),

Electroforesis en acetato de celulosa, (en papel)
Electroforesis en disolucin (electroforesis libre).

Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en distinta medida

a la carga elctrica de las molculas y a su masa.

1.- ELECTROFORESIS DE GEL.

La electroforesis en gel es un grupo de tcnicas empleadas por los cientficos
para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el
punto isoelctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propsitos
analticos, pero puede ser una tcnica preparativa para purificar molculas
parcialmente antes de aplicar espectrometra de masas, PCR, clonacin o
secuenciacin de ADN.
La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz
que es empleada para desplazar las molculas a travs del gel. Al situar las

molculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial elctrico, las molculas

se mueven a diferentes velocidades, hacia el ctodo, si estn cargadas
positivamente, y hacia el nodo, si estn cargadas negativamente (en una
electroforesis, los electrodos se comportan igual que en una cubeta electroltica).
La segunda parte del nombre, gel se refiere a la matriz usada para separar las
molculas. En muchos casos un gel es un polmero entrelazado de porosidad
controlable.

PROCESO DE ELECTROFORESIS EN GEL EN ESTE CASO GEL AGAROSA EN

EL ANALISIS DEL ADN
La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de
composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la
propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido
al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras
polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las
molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000
nucletidos

1) Fabricacin del gel:

-Agregar la agarosa solida a un frasco.
-Agregar el buffer para disolver la agarosa.
-Colocar el fresco en el microondas por un tiempo.
-Agregar la solucin a la cuba.
-Colocar el peine para hacer las calles.
-Dejar solidificar y luego quitar el peine con cuidado.
2) Configuracin de la caja de electroforesis:
-Poner solucin buffer en la caja de electroforesis.
-Colocamos la cuba en la solucin anterior.
3) Visualizacin de la muestra de ADN en el gel:
-Tomar buffer descarga con una micro pipeta.
-Mezclar con la muestra de ADN en un eppendorf.

-Tomar esta mezcla con la micropipeta y volcar en una calle de la cuba.

-Tomar con la micropipeta(con otro tip) los Standard de tamao.
-Colocar esta solucin en la 2da calle.
4) Conexin de la corriente elctrica y corrida del gel:
-Enchufar los cables de la caja de electroforesis.
-Encender el aparato (se aplica una diferencia de potencial).
5) Tincin del gel y anlisis de los resultados:
-Se quita el gel de la cuba.
-Se introduce el gel en un recipiente lleno de bromuro de etidio.
- Luego de un tiempo se retira el gel y expone a radiacin UV.
-Se analizan los resultados.

Revelado y visualizacin
Cuando se ha completado la electroforesis, las molculas ms pequeas han
llegado al nodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adicin de un
colorante especfico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el
bromuro de etidio, para los cidos nucleicos, o tincin
fluorescente, para las protenas. Asimismo se emplean
otros mtodos para visualizar la separacin de la mezcla
en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se
puede simplemente hacer una fotografa de la placa bajo
dicha luz. Tambin, si las molculas contienen tomos
radiactivos se puede efectuar una autorradiografa.
Las bandas en diferentes calles que se encuentran a la misma altura contienen
molculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores
especiales que contienen una mezcla de molculas de tamao conocido. Si se
hace una electroforesis de una mezcla desconocida y se agrega una calle con un
determinado marcador, las bandas observadas en el marcador pueden ser
comparadas con las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su
tamao o punto isoelctrico. Sabiendo que el desplazamiento de las molculas es

proporcional al logartmo de la masa, se puede estimar el peso molecular de una

molcula de inters comparandola con el patrn de migracin de los marcadores.

PROBABILIDADES DE ERROR
La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por muchos
errores experimentales, como la temperatura durante la polimerizacin y la
corrida del gel, velocidad de la polimerizacin, niveles de catalizador, pureza del
reactivo, tiempo de corrida y preparacin de las muestras.

2.- ELECTROFORESIS EN PAPEL

Es la tcnica en la que se emplea el papel como medio de difusin. Esta tcnica
est limitada casi totalmente a separaciones de pequeas molculas como los
aminocidos,

pptidos

nucletidos,

casi

siempre

se

usan

voltajes

relativamente altos.
Es muy til en los laboratorios clnicos por su fcil manipulacin y su fcil
desarrollo. Pueden hacerse en tiras de acetato o celulosa, que son qumicamente
ms homogneas y ms transparentes.
El Acetato de Celulosa se utiliza tambin para separar lipoprotenas.

PROCESO CON ELECTROLISIS DE PAPEL.

La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro. Humedecido con unas dos
soluciones tampn, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel,
dependiendo de las sustancias a separar y del
PH del tampn. Los extremos de las tiras se
sumergen en dos recipientes separados que
contienen la disolucin tampn y en los cuales
se conectan los electrodos. Los iones migran al
electrodo de carga opuesta.

Esta tecnica puede ser combinada con la cromatografa en papel, separndolos de

acuerdo a su carga y a su polaridad. Tambin se puede realizar una electroforesis
en dos dimensiones en la cual se usan buffer con diferente pH para cada
dimensin.
NOTA:
Un tampn,

buffer, solucin

amortiguadora

o solucin

reguladora

es

la mezcla en

concentraciones relativamente elevadas de un cido dbil y su base conjugada, es decir, sales

hidrolticamente activas. Tienen la propiedad de mantener estable el pH de una disolucin frente a
la adicin de cantidades relativamente pequeas de cidos o bases fuertes. Cada sistema buffer
tiene su propio rango efectivo de pH, el cual depender de la constante de equilibrio del cido o base
empleado. Son importantes en el laboratorio y en la industria, y tambin en la qumica de la vida

Se conecta los electrodos a una fuente de tensin continua y se aplica una

diferencia potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa,
las molculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad
opuestas formando bandas de papel. La velocidad de emigracin de una
molcula, depende preferentemente de su carga.
Desventajas:

Si el papel es fino se puede desgarrar con facilidad.

Si el papel es grueso las bandas se distrorsionan.

Se producen interaccion entre las proteinasy los grupos hidroxilos de la

celulosa de papel, por lo tanto la migraccion se frena.

ELECTROFORESIS LIBRE
Sin lugar a dudas, la forma ms sencilla de realizar una electroforesis consiste en
un tubo en forma de U donde se introduce un electrolito y la muestra adems
por supuesto, de los dos electrodos. Al conectar el sistema las macromolculas
comenzarn a migrar por el tubo hacia el polo opuesto y as irn diferencindose
segn su carga. Uno de los inconvenientes que presenta esta tcnica es la fluidez
del medio, o sea, la facilidad con la que las partculas difunden, de modo que al

cortar la corriente nos encontraramos con la tendencia natural al equilibrio, con

lo que no habramos logrado nada