INGENERARE 27 - 2013 / 29

INGENIERA PARA PRODUCIR PLSTICOS DESDE BACTERIAS

TECHNOLOGICAL AND MARKET ASPECTS OF MICROBIAL BIOPLASTICS PRODUCTION

Rodrigo Andler y Alvaro Daz-Barrera*

(VFXHODGH,QJHQLHUtD%LRTXtPLFD3RQWLFLD8QLYHUVLGDG&DWyOLFDGH9DOSDUDtVR$YHQLGD%UDVLO9DOSDUDtVR&KLOH
DOYDURGLD]#XFYFO

RESUMEN: Este trabajo entrega un panorama acerca de los aspectos tecnolgicos y de mercado de la produccin de bioplsticos microbianos. Un tipo de bioplstico producido por bacterias es el polihidroxibutirato (PHB), el cual es un biopolister biodegradable con
diferentes propiedades de gran potencial biotecnolgico. En pases
desarrollados existen impuestos al uso de materiales no degradables
derivados del petrleo y sumado a que las reservas de petrleo son
QLWDVDFWXDOPHQWHH[LVWHODQHFHVLGDGGHJHQHUDUQXHYRVPDWHULDOHV
plsticos biodegradables como los bioplsticos. La demanda global
por este tipo de material ha crecido en los ltimos aos, sin embargo,
su produccin a mayor escala requiere desarrollar un proceso ms
HFLHQWH HV GHFLU XQD PD\RU FRQFHQWUDFLyQ \ SURGXFWLYLGDG DO PiV
bajo costo posible. Para esto, la ingeniera bioqumica tiene un rol importante. La implementacin de estrategias de produccin microbiana
PiV HFRQyPLFDV \ HO GHVDUUROOR GH QXHYDV FHSDV PRGLFDGDV PiV
HFLHQWHHQODSURGXFFLyQGH3+%VRQQHFHVDULRVSDUDSURGXFLUSOiVticos microbianos.
Palabras clave: PHB, bioproceso, bioplsticos.

ABSTRACT: This paper gives a current overview about technological and market aspects of microbial bioplastics production.
One type of bioplastic produced by bacteria is the polyhydroxybutyrate
(PHB), which is a biodegradable biopolyester with different properties
with high biotechnological potential. In developed countries taxes are
charged for the use of non-degradable petroleum derivatives, in addition to that the petroleum reserves are limited, and then there is current
need to generate new biodegradable plastics such as the bioplastics.
7KHJOREDOGHPDQGIRUWKLVW\SHRIPDWHULDOKDVVLJQLFDQWO\JURZQLQ
the past few years; however, its production at higher scale requires the
GHYHORSPHQWRIDPRUHHIFLHQWSURFHVVLHDKLJKHUFRQFHQWUDWLRQ
and productivity at the lowest possible cost. For this, the biochemical
engineering has an important role. The implementation of less
expensive microbial production and the development of new
PRGLHGVWUDLQVPRUHHIFLHQW3+%SURGXFHUVDUHQHFHVVDU\LQ
order to produce plastics from bacteria.
Key Words: PHB, bioprocess, bioplastics.

30 / INGENERARE 27 - 2013

1. INTRODUCCIN
Los bioplsticos son un tipo de material que en las ltimas dcadas se han utilizado como reemplazo de plsticos derivados
del petrleo. La asociacin Europea de Bioplsticos considera
que los bioplsticos pueden ser clasificados como: 1) plsticos
sintetizados a partir de fuentes renovables y 2) polmeros biodegradables que cumplen con todos los criterios de las normas
cientficas reconocidas de biodegradabilidad y compostaje de
plsticos segn el estndar Europeo EN 13432 [1].
La demanda total de bioplsticos estimada en el 2011 fue de
475.900 toneladas mtricas, llegando a un total de 574.100
toneladas mtricas en el 2012, observndose as un potencial
de mercado en este campo. Con un 34,1% de demanda por
bioplsticos en el 2011, Europa es la regin de mayor demanda
seguida de la regin Asia-Pacfico con un 24,7% en el mismo
ao. En trminos de crecimiento, las regiones de Asia-Pacfico
junto con Amrica del Sur emergen como regiones de mayor
perspectiva para el mercado de los bioplsticos [1].
En este contexto la capacidad instalada de produccin de
bioplsticos ha aumentado en los ltimos aos. Europa en el
ao 2011 posea un 28% de capacidad de produccin global
para bioplsticos, mientras que Norteamrica y Sudamrica
seguan con un 24% y 22% respectivamente. En la tabla 1 se
resume la capacidad de produccin de bioplsticos instalada
en el mundo. Se puede observar que el bio-polietileno es el
bioplstico de mayor produccin con ms de 250 mil toneladas
mtricas en el 2011.
Tabla 1. Capacidad de produccin global de bioplsticos por tipo
de producto en el ao 2011[1].
Tipo de bioplstico

Capacidad de produccin
global (%)

Bio-polietileno

25

Mezclas de almidn

15

Polilactato (PLA)

13

Otros (polmeros generados de

celulosa y bio-poliamida)

13

[2]. Destaca en esta comparacin, la posibilidad que ofrece la

produccin microbiana de PHA en trminos de generar materiales con mltiples propiedades y aplicaciones (a diferencia del
PLA) as como, la opcin de mayor explotacin de propiedad
intelectual que ofrece la produccin de PHA respecto de PLA [3].
Por estas razones, la produccin de PHA es un campo promisorio
que se puede seguir desarrollando e innovando.
En los ltimos aos el incentivo de producir plsticos no
convencionales, es decir, que no provengan de la industria
petroqumica, se ha incrementado notoriamente debido al alza
en el precio del petrleo, en especial a partir del ao 2003. Es
as como a mediados del 2008 el precio por barril de petrleo
super los USD 140 y a partir de entonces se han mantenido
precios por sobre los USD 100. Debido al desarrollo de nuevas
tcnicas de biologa molecular y que en pases desarrollados
las normativas legales han generado un impuesto al uso de
materiales no degradables derivados del petrleo, en los ltimos
aos ha tomado ms fuerza la necesidad de generar plsticos
biodegradables de origen microbiano. Hoy existen diferentes
compaas productoras de PHA con capacidades instaladas
que van desde 50 a 50.000 ton/ao (Tabla 2).
Tabla 2. Compaas productores de PHA [2]
Compaa

Tipo
de PHA

Escala de
produccin
(ton/ao)

Biomer, Alemania

PHB

---

BASF, Alemania

PHB, PHBV

Piloto

Metabolix, Estados Unidos

PHAs

---

Tepha, Estados Unidos

PHAs

50.000

Meredian, Estados Unidos

PHAs

10.000

Kaneka, Japn

PHAs

---

Biocycle, Brasil

PHB, PHBV

50

Bio-On, Italia

---

10.000

Zhejiang Tian An, China

PHBV

2.000

Yikeman, China

---

3.000

Jiang Su Nan Tian, China

PHB

Piloto

PHAs

---

Polihidroxialcanoatos (PHA)

11

Shenzhen OBioer, China

Cloruro de bio-polivinilo

Tianjin Green Bio-Science,

China

PHB4B

10.000

Shandong Lukang, China

PHAs

Piloto

Polisteres biodegradables

Bio-polietileno tereftalato

Entre los bioplsticos producidos por microorganismos, destacan

dos polmeros biodegradables: polilactato (PLA) y polihidroxialcanoato (PHA). Ambos bioplsticos pueden ser manufacturados
usando un 100% de recursos renovables. Los polmeros de PHA
son ms caros que los de PLA, ya que pueden ser usados en
un mayor espectro de aplicaciones, incluyendo en biomedicina

Copolmeros de PHB: PHBV, poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxivalerato); PHB4B, poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato)

; informacin no disponible.

INGENERARE 27 - 2013 / 31

2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LOS PHA

Los PHA son polisteres de hidroxialcanoatos que pueden ser
sintetizados por microorganismos y constituyen un grupo de
materiales biodegradables de gran potencial biotecnolgico. Se
conocen ms de 150 estructuras de PHA que tienen diferentes
caractersticas de termoflexibilidad y propiedades mecnicas.
En la Figura 1 se muestra la estructura qumica bsica de los
PHA microbianos.

aguas de mar), acelerndose la degradacin por exposicin a

luz UV [6].
3. APLICACIONES DEL PHB
Las aplicaciones que posee el PHB son muchas en diversos
mbitos. En artculos de uso cotidiano como bolsas, artculos de
empaque, contenedores, revestimientos, artculos desechables
de higiene personal, entre otros [7]. En el rea mdica como
vestimenta, artculos ortopdicos, prtesis, todo esto gracias a
la compatibilidad con nuestro organismo [8]. Adems se est
incursionando en utilizar el PHB como portadores de biofrmacos
y como un tipo de biocombustible [9].
4. BIOSNTESIS DE PHB

Figura 1. Estructura qumica del PHA.

El valor de n depende del grupo R y el microorganismo en el

cual se produce, variando entre 100 y 30000 [4]. En la Tabla 2
se indican las sustituciones ms comunes del grupo radical y
el nombre que recibe el polmero.

El PHB es un polmero de reserva energtica que se acumula al

interior de las clulas. La principal ruta bioqumica de produccin
es a partir de acetil-CoA, el cual es convertido a PHB mediante
la intervencin de tres enzimas biosintticas (Figura 2).
Fuente de carbono
(Glucosa, glicerol, etanol, otros)

Tabla 3. Sustituciones del grupo radical

Grupo R

Nombre del polmero

Abreviacin

CH3

poli(3-hidroxibutirato)

PHB

CH2CH3

poli(3-hidroxivalerato)

PHV

CH2CH2CH3

poli(3-hidroxihexanoato)

PHHx

Acetil-CoA
Acetil-CoA
3-cetotiolasa (phA)

Acetoacetil-CoA

El poli(3-hidroxibutirato) o PHB es uno de los PHA ms estudiados y es sintetizado por diferentes bacterias. Posee caractersticas muy similares al polipropileno (PP), uno de los plsticos
convencionales (de la industria petroqumica) de mayor uso. En
la tabla 3 se muestran una comparacin de ambos polmeros.

NADPH

Acetoacetil-CoA reductasa (phaB)

NADP+

(R)-3-hidroxibutiril-CoA
Polimerizacin

PHB sintasa (phaC)

PHB

Tabla 4. Comparacin propiedades fsicas entre PHB y

polipropileno (PP) [5]
Parmetro

PHB

PP

Temperatura de fusin (C)

177

176

Temperatura de transicin vtrea (C)

-10

Cristalinidad (%)

60

50-70

Fuerza de tensin (MPa)

43

38

Extensin hasta quiebre (%)

400

Con respecto a la biodegradabilidad de los PHA, muchos microorganismos en la naturaleza los degradan ya que contienen
PHB hidrolasas y PHA depolimerasas [5]. Tpicamente, una
estructura de PHB tiene una velocidad de degradacin de unos
pocos meses (en condiciones anaerobias) o pocos aos (en

Figura 2. Ruta metablica de produccin de PHB a partir de la

reduccin de Acetil-CoA [5].

En el primer paso, la enzima 3-cetotiolasa condensa dos molculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA. Luego, una
segunda enzima, acetoacetil-CoA reductasa permite la reduccin
de acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, utilizando NADPH.
Finalmente la enzima PHB sintasa polimeriza 3-hidroxibutiril-CoA
a PHB, liberando la coenzima-A.
La acumulacin de PHB es una manera natural para las bacterias
de almacenar carbono y energa. Este polister es insoluble
en agua y es por esto que los polmeros son acumulados en
grnulos intracelulares. Para la bacteria es ventajoso almacenar

32 / INGENERARE 27 - 2013

nutrientes en exceso, especialmente para que su estado fisiolgico no se vea afectado [6].
Durante el crecimiento bacteriano, la enzima 3-cetotiolasa es
inhibida por la coenzima-A libre y el flujo de acetil-CoA se favorece hacia el ciclo de Krebs. Cuando hay limitacin de algn
nutriente, diferente al carbono, el acetil-CoA es canalizado hacia
la biosntesis de PHB [9].
5. BIOPROCESO DE PRODUCCIN DE PHB
El PHB debido a sus caractersticas ha sido de mucho inters
con miras de producirlo a escala industrial y lograr el reemplazo
del plstico convencional. Sin embargo su costo de produccin
sigue siendo mayor a los plsticos derivados del petrleo. Segn
lo reportado, su valor de produccin puede ser hasta 16 veces
mayor que la produccin de polipropileno [10].
El bioproceso de produccin microbiana de PHB consiste en
una primera etapa de fermentacin para el crecimiento de la
biomasa y acumulacin intracelular del biopolmero, seguido de
una etapa de cosecha de la biomasa y extraccin/recuperacin
del polmero.
Se estima que para producir PHB alrededor de un 40% del
costo total de produccin se debe a las materias primas [11].
Por esta razn, existen diferentes investigaciones orientadas
a usar fuentes de carbono baratas para reducir el costo de su
produccin [12; 13; 14].
Sin embargo, hasta ahora el desafo sigue siendo desarrollar
un bioproceso con alta eficiencia de conversin en PHB al ms
bajo costo posible. En este sentido, en nuestro pas existen diferentes procesos industriales de los cuales se pueden obtener
subproductos que podran ser usados como fuente de carbono
y nutrientes para la produccin microbiana de PHB. Un ejemplo
de esta opcin fue recientemente evaluada en nuestro grupo de
investigacin. En un estudio de evaluacin tcnica y econmica
para producir PHB microbiano se evalu la factibilidad de usar
suero de leche de la industria de leche y quesos como fuente
de carbono para producir PHB [15]. Demostrndose que si es
una opcin factible en nuestro pas.

mtodos para recuperar el PHB involucran el uso de solventes

orgnicos como acetona, cloroformo o dicloroetano [17; 18]. Sin
embrago, la extraccin con solventes puede requerir el uso de
grandes cantidades de solventes, lo cual hace menos econmico
el proceso y resulta contradictorio en el esquema de desarrollo
de un proceso sustentable y amigable con el medio ambiente.
Como una alternativa, han surgido mtodos de extraccin con
preparados enzimticos, tratamiento con amonio o digestin con
surfactantes [19]. Actualmente se han aplicado otros mtodos
para recuperar PHB, entre los que destacan disrupcin usando
fluidos supercrticos o bacterias modificadas en las cuales se
induce una liberacin espontnea de PHB [20]. Se sabe que
los procesos de extraccin y recuperacin del PHB pueden ser
costosos y es necesario entonces evaluar el procedimiento de
mayor rendimiento en concordancia con el costo involucrado,
sobre todo pensando en desarrollar un proceso a mayor escala.
6. MICROORGANISMOS MODIFICADOS
GENTICAMENTE PARA PRODUCIR PHB
Existen bacterias nativas que pueden acumular grandes cantidades de PHB [3].Sin embargo, pocas bacterias tienen un potencial
de produccin que pueda ser llevado a escala industrial [21].
Debido a esto existen diferentes investigaciones para modificar
genticamente algunas bacterias [4] con el fin de maximizar la
productividad, parmetros cinticos y la capacidad de utilizar
fuentes de carbono renovables.
Esto se ha logrado mediante la insercin de genes provenientes
desde cepas productoras en cepas no productoras de PHB
o mediante el bloqueo (interrupcin) de genes de las cepas
productoras enfocado en el incremento del rendimiento y de la
productividad. Sin embargo, no todas las cepas recombinantes
han presentado potencial de aplicacin industrial basado en
los resultados observados a escala de laboratorio y piloto [21].
6.1 Produccin de PHB por E. coli recombinante

Otra forma propuesta para abaratar costos de produccin es

reducir los costos de aireacin de la fermentacin. En esta lnea,
se sabe que la sntesis de PHB es afectada por la disponibilidad de oxgeno. Se ha demostrado que bajas velocidades de
agitacin y condiciones de limitacin de oxgeno favorecen la
produccin de PHB [11; 16]. Esta condicin abre la posibilidad
de desarrollar un proceso de cultivo con menos necesidades de
aireacin y as menos costos asociados.

Se ha demostrado que cepas recombinantes de E. coli que

contienen los genes para la biosntesis de PHB poseen varias
ventajas sobre las bacterias productoras naturales de PHB [14].
Dentro de estas ventajas se incluye la capacidad de utilizar un
amplio rango de fuentes de carbono, la ausencia de un sistema
de depolimerasas que degraden el polmero sintetizado y una
acumulacin de grandes cantidades de PHB con altos niveles
de productividad. El conocimiento de su gentica y de sus vas
metablicas, as como de la tecnologa para su cultivo, hacen
que E. coli tenga un papel importante en el desarrollo de un
proceso de produccin de PHB [14].

Despus del proceso de fermentacin, las clulas que contienen

el PHB deben ser separadas para luego extraer el producto. Los

E. coli es considerada como un husped ideal para la produccin

de PHB. Una evidencia de esto es que se han alcanzado por-

INGENERARE 27 - 2013 / 33

centajes cercanos al 90% (p/p) de PHB por masa de clula seca

[22]. En la Tabla 5 se muestran algunos valores de porcentaje
de acumulacin de PHB en diferentes cepas recombinantes de
E. coli utilizando diferentes fuentes de carbono.
Tabla 5: Acumulacin de PHB en cepas recombinantes de E. coli.
&HSDPRGLFDGD

Origen de los
genes

E. coli
XL1-Blue
E. coli
HMS174

PHB (%
p/p)

Referencia

Alcaligenes latus

73

[23]

Ralstonia eutropha

80

[24]

87

[25]

E. coli GCSC4401 Alcaligenes latus

E. coli
SY-1

Ralstonia eutropha

49.1

[26]

E. coli
SY-2

Ralstonia eutropha

59.5

[26]

E. coli
SY-3

Ralstonia eutropha

50.8

[26]

E. coli
4=

Ralstonia eutropha

41.3

[27]

E. coli W

Cupriavidus
necator

40.1

[28]

E. coli W

Cupriavidus
necator

36.2

[28]

E. coli
W6cscR

Cupriavidus
necator

45.8

[28]

Figura 3. Rutas metablicas en E. coli KO11 PPAL-

En cultivos de esta cepa (E. coli KO11 PPAL-) se evalu el crecimiento celular y la produccin de PHB usando como fuente
de carbono glucosa o lactosa.
Materiales y mtodos

7. PRODUCCIN DE PHB BACTERIANO: UNA

APROXIMACIN EXPERIMENTAL
En nuestra escuela estamos trabajando en el diseo de condiciones de proceso para producir PHB con una E. coli modificada. Se utiliz una cepa de E. coli recombinante (E. coli
KO11 PPAL-), la cual contiene los genes de PHB provenientes
de la bacteria $]RWREDFWHUYLQHODQGLL. Asimismo la cepa E. coli
KO11 PPAL- posee bloqueos en algunas rutas metablicas que
favoreceran la acumulacin intracelular de PHB. En la figura 3
se muestran las rutas metablicas involucradas en la sntesis
de PHB y los bloqueos en algunas vas metablicas de la cepa
E. coli KO11 PPAL-.

Las cepas de E. coli crecieron en un medio de la siguiente composicin (en g/L): glucosa 10; lactosa 10; NH4Cl 1;
Na2HPO46,8;KH2PO4 3;NaCl 0,5; MgSO47H2O 0,24; CaCl22H2O
0,011. Se adicion adems ampicilina 0,3 mM y como inductor
IPTG 0,01 mM.
Los cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 250 ml
con 50 ml de medio de cultivo. Se cultiv en una incubadora
rotatoria a 37C y 250 rpm.
La biomasa fue cuantificada mediante peso seco y la fuente de
carbono se midi utilizando la tcnica colorimtrica DNS, que
identifica azcares reductores.
El PHB fue recuperado mediante extraccin con cloroformo e
hipoclorito de sodio. Para su cuantificacin, el PHB extrado fue
hidrolizado con H2SO4y el producto de la hidrlisis (cido crotnico) fue cuantificado por HPLC con un sistema de deteccin UV.
Resultados
En las Figuras 4 y 5se muestran las cinticas de crecimiento y
acumulacin intracelular de PHB (%p/p) en cultivos de E. coli
KO11 PPAL- con glucosa (Fig. 4) y lactosa (Fig. 5).

34 / INGENERARE 27 - 2013

Si bien se alcanz una mayor concentracin de biomasa con glucosa (3,0 g/L) respecto de usar lactosa (2,0 g/L), el rendimiento
de PHB en biomasa (YPHB/X) fue 2,6 veces mayor con lactosa,
por lo que lactosa resulta ser una mejor fuente de carbono para
la acumulacin de PHB en clulas de E. coli recombinante.

50

3,5
3,0

30

2,0
1,5

20

PHB (%p/p)

Biomasa (g/L)

40
2,5

1,0
10
0,5
0,0

0
0

10

20

30

40

50

Tiempo (h)

Figura 4: Cintica de crecimiento y produccin de PHB en E. coli

KO11 PPAL- utilizando glucosa
(ELRPDVD3+%

8. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
Aunque durante la ltima dcada se han instalado nuevas compaas productoras de bioplsticos microbianos, an quedan
desafos para poder desarrollar un bioproceso ms eficiente.
Para esto, el aporte de la ingeniera bioqumica ser disminuir
los costos de produccin, generar nuevas cepas productoras y
encontrar aplicaciones con un mayor valor agregado. En diferentes pases (incluyendo el nuestro) existen normativas tendientes
a reemplazar el uso de materiales plsticos no biodegradables
y ya que a nivel global hay una mayor demanda por plsticos
biodegradables ms amigables con el medio ambiente, se vislumbra que la produccin de PHB microbiano es una importante
oportunidad para la generacin bioplsticos biodegradables.

50

3,5

AGRADECIMIENTOS

3,0
40

30

2,0
1,5

20

PHB (%p/p)

Biomasa (g/L)

2,5

Los autores agradecen a proyecto Fondecyt de Iniciacin

11110311 y Proyecto de investigacin asociativa DI-PUCV
037.323/2013.
REFERENCIAS

1,0
10
0,5
0,0

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0
0

10

20

30

40

50

60

Tiempo (h)

Figura 5: Cintica de crecimiento y produccin de PHB en E. coli

KO11 PPAL- utilizando lactosa (ELRPDVD3+%

Como se observa en la Figuras 4 y 5 usando lactosa se alcanza

un 45% (p/p) de acumulacin de PHB mientras que con glucosa
slo un 30% (p/p).
En la Tabla 6 se presentan los principales parmetros de fermentacin que fueron obtenidos en los cultivos de E. coli KO11 PPAL-.
Tabla 6: Parmetros de fermentacin en cultivos de E. coli KO11
PPAL-productores de PHB.
+ (h-1)

YX/S
(g/g)

YPHB/X
(g/g)

QPHB (g/
Lh)

Glucosa

0,10

0,37

0,30

0,027

Lactosa

0,07

0,36

0,79

0,027

Fuente de
carbono

INGENERARE 27 - 2013 / 35

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36 / INGENERARE 27 - 2013

RESEA DE LOS AUTORES

Rodrigo Javier Andler Osorio
-Ingeniero Civil Bioqumico y Estudiante de Magster en Ciencias
de la Ingeniera c/m en Ingeniera Bioqumica de la Pontificia
Universidad Catlica de Valparaso, Chile.

Alvaro Daz Barrera

-Doctor en Ciencias Bioqumicas, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Mxico.
-Bioqumico y Magster en Ciencias de la Ingeniera c/m en
Ingeniera Bioqumica de la Pontificia Universidad Catlica de
Valparaso, Chile.
-Profesor Asociado de la Escuela de Ingeniera Bioqumica de
la Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, Chile. Su rea
de investigacin es la produccin de polmeros microbianos.