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MORFOLOGIA
Los morfotipos bacterianos se determinan en cuanto a la forma, ya sea esta de tipo microscpico o
unicelular y la macroscpica que se desarrolla en los medios de cultivo. Para tales fines ya estn
establecidos una serie de criterios que pueden ser consultados en las prcticas de laboratorio de
Microbiologa general (Morfologa Macroscpica y Microscpica de bacterias)
FISIOLOGIA.
La fisiologa est determinada por todos los comportamientos celulares, las funciones a partir de rganos
o estructuras presentes y finalmente el conjunto de reacciones metablicas de un ser vivo. Para los
organismos bacterianos, el estudio fisiolgico est limitado pues ya conocemos que estos seres carecen
de organelos en la mayora de sus especies.
ENSAYOS BIOQUIMICOS
La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de
caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos
tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la
actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se
incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.
Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en
forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada
actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada
temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio
profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de
trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si
se trata de diferentes microorganismos.
A la determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de identificacin,
comerciales, etc.). Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de
identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan ms frecuentemente, agrupadas
segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente.
1) Enzimas vinculadas con la respiracin
a) oxidasa
b) catalasa
2) Descomposicin de azcares simples, cidos orgnicos y otros
2.1) Requerimientos de oxgeno
OF (xido-fermentacin)
Crecimiento en caldo tioglicolato
2.2) Produccin de cido, o cido y gas
Fermentacin de carbohidratos
2.3) Deteccin de enzimas y vas metablicas
a) RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer)
b) Gluconato
c) O.N.P.G. (orto nitro -D-galactopiransico)
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DOCUMENTO EN REVISION.
DANNY PISCIOTTI ORTEGA.
AGOSTO 2013.
d) Esculina
e) Hipurato
3) Fuente nica de carbono
a) citrato
b) malonato
c) hipurato para coliformes
4) Utilizacin de compuestos nitrogenados
4.1) Reduccin de nitrato
a) asimilacin
b) denitrificacin
4.2) Descomposicin de carbohidratos aminocidos y otros
a) indol
b) H2S
c) Fenilalanina
d) Lisina, arginina, ornitina
e) Urea
5) Ensayos combinados
a) TSI (Triple Azcar Hierro)
b) LIA (Agar Hierro Lisina)
c) Bilis esculina
6) Deteccin de exoenzimas
a) lecitinasa
b) proteasas, coagulasa
c) amilasas
d) celulasas
e) desoxirribonucleasas
f) accin de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas)
7) Miscelneos
a) KCN
b) Bilis
c) produccin de pigmentos
8) Test de crecimiento o inhibicin
a) Temperatura
b) NaCl
c) Antibiticos
METODOLOGIA.
1. A partir de un pool de microorganismos contenidos en un caldo realice siembras por agotamiento en
medios nutritivos (CASOY, TRIPTICAS O AGAR NUTRITIVO), llvelos a incubacin a 37C/24 Horas.
2. De acuerdo a los crecimientos establecidos realice separacin de gneros por morfotipos, (a partir de
su morfologa macroscpica)
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3. Purifique cada morfotipo por agotamiento realizando aislamientos en medios nutritivos por separado
(un medio por cada morfotipo) lleve a incubacin a 37C/24 hrs
4. Realice respaldos o copias de los organismos obtenidos a partir del segundo o tercer aislamiento de la
siguiente manera:
-
Transfiera una o dos asadas de las colonias puras en caldo BHI o peptona agregue 1 a 2 ml de
crioconservante y lleve a congelacin (0C/30 60 das)
Transfiera mediante siembra mixta una colonia a un tubo con agar nutritivo inclinado, incube por
12 horas a 37C, retire y lleve a refrigeracin, realice este mismo procedimiento cada 7 das.
Realice agotamientos en agar nutritivo e incube a 37C/24 Hrs.
5. Tenga en cuenta que por cada respaldo las caractersticas morfolgicas se deben conservar, este
criterio permite mantener la pureza del aislamiento.
6. A partir de los aislamientos puros para cada morfotipo, realice la descripcin morfolgica de tipo
microscpico y la respectiva deteccin de estructuras (Capsula, espora)
7. En funcin de la caracterstica de pared, cultive al organismo en un medio que contenga un
determinado sustrato o inhibidor con el fin de visualizar el crecimiento y la degradacin de un sustrato, ya
sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de
algn producto de su degradacin.
Emplee uno de los siguientes medios:
Bacilo Gram Negativo: EMB VRB ENDO XLD HEKTOEN BISMUTO SULFITO
Bacilo Gram Positivo: MYP PALCAM - OXFORD SPS
Coco Gram Positivo: BAIRD PARKER SALADO MANITOL - KF
8. Una vez establecido el criterio principal de crecimiento, recupere el organismo a partir de uno de los
respaldos, realice una nueva siembra en medio nutritivo y proceda a hacer la marcha analtica de acuerdo
al anexo 1 (Identification flow charts). Empezando por la determinacin de los sistemas respiratorios
continuando sucesivamente con las pruebas.
9. Entregue el reporte de los organismos identificados a partir de la muestra.
NOTA: Recuerde trabajar de la manera ms asptica posible, evitando la contaminacin de la muestra.
CONSULTE SOBRE:
BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson)
OXI/FERM TUBE II
API 20 E.
Quintet 3H de Diagnostics Pasteur para Enterobacterias.
API 10S
API Listeria
API NH (Neisseria - Haemophilus)
BBL CRYSTAL BD
REFERENCIAS.
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DANNY PISCIOTTI ORTEGA.
AGOSTO 2013.
Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J., Biologa de los microorganismos, Madrid, Brock, Pearson, 2009
Anonimo. IDENTIFICACIN DE UNA CEPA BACTERIANA. Disponible en:
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioPruebasBioquimicas.htm. Consultado en: Agosto 2013.
5 Elaborado por :
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DANNY PISCIOTTI ORTEGA.
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