Consideraciones Prácticas Acerca de La Calidad Del Semen

REDVET. Revista electrnica de Veterinaria.
ISSN: 1695-7504
2009 Vol. 10, N 8
REDVET Rev. electrn. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet - http://revista.veterinaria.org
Vol. 10, N 8, Agosto/2009 http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080809.html
Consideraciones prcticas acerca de la calidad del semen

de conejos aplicado en estudios de toxicologa de la
fertilidad (Practice considerations about the semen quality of
rabbits for applied in fertility toxicology study).
Arencibia Arrebola Daniel Francisco: Centro Nacional de
Investigaciones Cientficas (CNIC), Avenida 25 y 158, Cubanacn,
Playa, Apartado Postal 6414, Ciudad de la Habana, Cuba. Email
darencibia@finlay.edu.cu | Rosario Fernndez Luis Alfredo:
Centro de Qumica Biomolecular (CQB), Calle 200 y Avenida 21,
Atabey, Playa, Apartado Postal 16042, Ciudad de la Habana, Cuba.
Resumen
El conejo domstico es un descendiente del conejo salvaje que habitaba en
el oeste de Europa y en el noroeste de frica. En los estudios de toxicologa
experimental se destaca su uso en la determinacin de toxicidad por
irritacin drmica, ocular, toxicologa de vacunas, adems de ser bsico
como modelo animal para determinar compuestos teratognicos, los cuales
influyen tanto en la fertilidad de la hembra como en la del macho. Los
mtodos para la valoracin de la calidad del semen, tanto para la
inseminacin artificial como en la investigacin, estn sufriendo un
constante desarrollo para intentar estimar con mayor precisin la fertilidad
de los machos. Desafortunadamente, las valoraciones de laboratorio no
predicen con exactitud la fertilidad y tampoco se obtiene una repetitividad
de unos anlisis a otros, debido a la subjetividad de muchas de dichas
valoraciones. El objetivo de este trabajo es la confeccin de una gua
terico-prctica que permita realizar estudios del semen en conejos de la
raza Nueva Zelanda Blanca, aplicado a la temtica de toxicologa de la
fertilidad. Trataremos los temas de induccin del celo en las hembras,
condiciones y mtodo para la extraccin del semen, pruebas macroscpicas
y microscpicas del semen, valoracin del peso de rganos y examen
anatomopatolgico. Todas las pruebas descritas aportan datos que nos
indicarn una disminucin de la calidad del semen, pero debemos realizar
valoraciones que nos aporten sencillez, rapidez y que sean econmicamente
viables; para ello cada investigador debe utilizar aquellas que mejor se
adapten a sus condiciones de trabajo.
Palabras clave: semen | fertilidad | conejo | pruebas microscpicas |
toxicidad.
Consideraciones prcticas acerca de la calidad del semen de conejos aplicado en estudios de

toxicologa de la fertilidad.
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080809/080910.pdf
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REDVET. Revista electrnica de Veterinaria. ISSN: 1695-7504

2009 Vol. 10, N 8
Abstract
The domestic rabbit is descendend from the wilds rabbits was to inhabited
of western Europe and Northwestern Africa. The rabbits is very usefull in the
experimental Toxicology study, in dermal irritation, ocular irritation and the
vaccines Toxicology, beside is a basic animal models in teratogenicity
evaluation of the pharmaceutics products, that its influence in the female
and male fertility. The methods of semen quality valuation in artificial
insemination and research were suffering a constant development to
estimate with more precision the males fertility. Unfortunately, the
laboratory valuations don't predict with accuracy the fertility and not
obtained the repetitive of some analyses to other, because of the
subjectivity of many valuations. The objective of this work is the making of
a theoretical-practice guide that allows to carry out studies of the semen in
rabbits, (New Zealand White breed), applied to the fertility toxicology
thematic. We will treat the topics of the zeal induction in the females,
conditions and method for the semen extraction, macroscopic and
microscopic semen tests, organs weight valuation and anatomopatologic
exam. All the described tests contribute data that will indicate a decrease of
the semen quality, but we should carry out valuations that contribute
simplicity, speed and they are economically viable; the researcher should be
use the best option for his work conditions.
Key words: semen| fertility | rabbit | microscopic test | toxicity.
Introduccin
El conejo domstico es un descendiente del conejo salvaje que habitaba en
el oeste de Europa y en el noroeste de frica. Est catalogado como uno de
los mamferos de mayor utilidad en el mundo en todos los campos del
saber, dado por su gran prolificidad y adaptabilidad a diferentes condiciones
de manejo, salud, alimentacin y condiciones ambientales en todos los
continentes.1 Se plantea que el conejo domstico se asemeja a los roedores
en muchos aspectos.
En los estudios de toxicologa experimental se destaca su uso en la
determinacin de toxicidad drmica, ocular adems de ser bsico como
modelo animal para determinar compuestos teratognicos, que influyen
sobre todo en la fertilidad tanto en la hembra como en la del macho,
participando en la formacin del nuevo individuo, 2 se conoce con gran
precisin el tiempo en que se realiza la maduracin del ovocito,
implantacin y bases sobre fertilizacin tanto en los parmetros fisiolgicos
de la hembra como en el macho.3
Los mtodos para la valoracin de la calidad del semen, tanto para la
inseminacin artificial como a nivel de investigacin, estn sufriendo un
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constante desarrollo para intentar estimar con mayor precisin la fertilidad

de los machos reproductores. Desafortunadamente, las valoraciones de
laboratorio no predicen con exactitud la fertilidad y tampoco se obtiene una
repetitividad de unos anlisis a otros, debido en gran parte a la subjetividad
de muchas de dichas valoraciones.4
La solucin pasara por superar esta subjetividad aumentando el nmero de
experimentos. Uno de los mtodos ideales para analizar la capacidad
fecundante y/o fertilidad de un macho consiste en el estudio del semen,
adems de lgicamente la capacidad de producir gestaciones.5
La obtencin y valoracin espermtica ha de ser rpida y eficaz para poder
conservar la calidad y capacidad fecundante del semen durante cada una de
estas determinaciones.6
Para lo cual nos trazamos como objetivo de nuestro trabajo la confeccin de
una gua terico-prctica que permita realizar estudios del semen en
conejos, aplicados a la temtica de fertilidad, para el uso en laboratorios de
toxicologa experimental siendo esta una herramienta til que ayude a la
valoracin preclnica de nuevos productos y/o ingrediente activo en este
campo del saber.
Desarrollo
Antecedentes y Justificacin del Estudio:
Para introducir un producto sea un frmaco, vacuna, fertilizante, en el
mercado es necesario cumplir con leyes y regulaciones, dentro de ellas se
destacan los estudios de Toxicologa Experimental o como todos conocen los
estudios de Toxicologa Preclnica. En el caso de productos naturales las
exigencias son an mayores. Cuando este producto va a ser administrado a
embarazadas, mujeres y hombres en edad frtil por un prolongado periodo
de tiempo es necesario realizar estudios de Toxicologa de la reproduccin.
Estos estudios estn divididos de una forma metodolgica y dinmica en
tres segmentos (Fertilidad, Teratognesis y Toxicidad peri-postnatal), as
como estudios multigeneracionales.7, 8 Por lo general al presentar nuestros
resultados a las instituciones reguladoras la mayora de los estudios de este
tipo van encaminados a determinar disfunciones en la hembra, solo
tomando al macho en el apareo, midiendo la libido sexual, nmero de
hembras preadas etc. En ningn caso se hace alusin a la concentracin
espermtica, volumen, motilidad, morfoanomalas espermticas, las cuales
de forma directa son determinantes de una gama de valoraciones a medir
en estos estudios, por mencionar algunas tenemos: el ndice de fertilidad,
nmero cras, viabilidad de las cras, malformaciones del esqueleto y de
rganos entre otras.9
Tal es el caso del Saw-Palmetto, producto natural que inhibe la Hiperplasia
Prosttica Benigna, en el cual se utilizaron algunas de las valoraciones que
este trabajo propone para corroborar los resultados negativos obtenidos en
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esta rama, siendo de gran utilidad, pues les permiti tener una mayor
valoracin y nivel de confiabilidad de su producto.10-12 Por su parte el
Finasteride (Dutasteride), tras corroborar los problemas existentes de
afeminamiento, retardo en la bajada de los testculos y de la hendidura
prepucial en cras machos, as como valores ligeramente bajos de los ndices
de fertilidad en ratas, se utiliz una variante de este estudio y se obtuvo
como resultado que el producto disminuye el volumen del eyaculado al ser
administrado a corto plazo, no se han realizado an estudios a largo
plazo.13-18
En materia de experiencia, le podremos comentar que este tipo de estudio
se est implementando en nuestro laboratorio a raz de obtener extensos
resultados en la toxicologa de la reproduccin de un producto nuestro en
desarrollo en el cual se obtuvieron resultados en funcin de la toxicidad
reproductiva de la hembra y en el macho de forma indirecta, por cuanto las
autoridades regulatorias nos exigan algn tipo de estudio que manifestara
la no toxicidad reproductiva directa en el macho,
destacar que los
resultados iban o no ms haya de la integridad de los rganos sexuales
(anlisis anatomopatolgico), salud, libido etc.
Por ende este trabajo no se basa en la implementacin de nuevas tcnicas,
sino que el investigador en el campo de la toxicologa experimental sepa
que estas herramientas existen y que pueden ser utilizadas para resolver de
forma inmediata un problema dado con metodologas que incluyen un bajo
costo, fcil reproduccin y obtencin rpida de los resultados, las cuales no
necesitan de equipos sofisticados ni de personal calificado en esta materia.
Para lo cual tomamos valoraciones que incluyen un anlisis bsico como son
las pruebas de rutinas que en este trabajo debatimos, pudiendo ser
desarrolladas por tcnicos o especialistas en laboratorios con bajos
recursos.
Diseo experimental:
Para determinar la influencia en la fertilidad tras la administracin en dosis
repetidas de un producto mediante la valoracin o contrastacin seminal de
conejos en toxicologa experimental por lo general se forman 4 grupos
experimentales de 8 a 10 conejos machos/grupo (32-40 total) ,19 de 7-8
meses de edad (adultos) de 1,8-2,5 kg, para formar un grupo control de
vehculo y tres niveles del producto a evaluar. Se puede incluir o no un
grupo control positivo administrado con sustancias de referencia, el cual
puede ser administrado por dosis y va diferente a la sustancia de ensayo.
Por lo general el mtodo de extraccin de semen mas usado es la falsa
monta con el uso de una coneja estrogenizada para lo cual se incluyen a
razn de 1 hembra para 6-8 machos.20
Se administra la sustancia de ensayo durante 8 semanas (60 das por va
oral, el cual abarca un ciclo espermtico y del siguiente, en el conejo este
ciclo dura 48 das), durante los cuales debe pesar los animales
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semanalmente para determinar las dosis de producto a administrar y se

observaran dos veces al da.21 Al cabo de las 8 semanas debe extraer el
semen con el uso de una coneja en celo para su valoracin macroscpica y
microscpica. Para tener una mayor valoracin de la toxicidad del producto
a evaluar en el sistema reproductivo del macho se deben sacrificar los
animales para realizar un estudio anatomopatolgico de rganos y
cavidades, por ltimo se extraen los rganos sexuales (testculos,
epiddimos, prstata y vesculas seminales) para su estudio histolgico y la
determinacin de la relacin peso de rgano/peso corporal.22 Todas las
variables analizadas se deben comparar contra el grupo control negativo.
Induccin del celo en las hembras:
Las Prostaglandinas induce la regresin del cuerpo lteo, iniciando una
nueva ovulacin. Su uso es recomendable ya que las hembras se
encontrarn receptivas a los dos das de su aplicacin, para un nuevo
servicio.23
Coneja estrogenizada. Entre los tratamientos hormonales que se utilizan
pre-monta se encuentra la PMSG, la cual genera un Pico de estrgeno que
mejora la receptividad-fertilidad y prolificidad, las dosis deben ser pequeas
de 20 UI mximo por va (subcutnea). Adems para mejorar la aceptacin
se debe bioestimular con un tratamiento de 16 horas de luz durante 8 das
antes de la extraccin del semen.24 La PMSG constituye una Gonadotropina
Corinica extrada del suero de una yegua gestante.
Ejemplo de algunos esquemas de aplicacin efectiva, utilizadas por nosotros
durante evaluaciones previas a algunos de nuestros productos: 25
1.) Se aplica va intramuscular o subcutnea 12-35 UI, 48 horas antes del
momento del servicio natural, la dosis de 35 suele ser ms efectiva.
2.) Se aplica va intramuscular 20 UI, 72 horas antes del momento del
servicio natural.
Condiciones para la extraccin del semen:
Se utiliza una vagina artificial que consta de las siguientes partes:
-
Tubo rgido de PVC.

Goma-espuma.
Globos comunes adaptados.
Tubo colector graduado.
El cuerpo de la vagina (tubo de pvc) est recubierto en su interior por una

capa de goma-espuma. Dentro del cuerpo de la vagina se coloca el ltex
formando una cmara aislada donde se coloca el agua caliente, de manera
tal que el agua nunca tome contacto con el semen. En el extremo posterior
del tubo rgido se coloca un tubo colector graduado para la recoleccin del
semen. Como lubricante se utiliza vaselina.26
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El volumen y la calidad del semen dependen de la camisa utilizada en la

vagina artificial, la cual debe estar seca y no se debe utilizar gel, adems
hay que realizar un cuarto de vuelta del ltex dentro de la vagina, pues los
pliegues que se forman permiten una estimulacin al macho.
Se puede agregar 10-15 gramos de glicerol en el agua para mantener la
temperatura de la misma en la vagina.27Adems se debe llenar con agua a
temperatura de 55-58 C y completar con una inyeccin de aire para
favorecer la presin. Se debe tener muy en cuenta la temperatura del agua
debido a que las vaginas artificiales con temperaturas de 50 C induce la
liberacin de orina y a menos de 40 C el animal no salta o se incrementa el
volumen de gel y grnulos dificultando la manipulacin del eyaculado y
alterando su calidad dando resultados falsos positivos.28 Una vez completa
con agua y aire la vagina se deja en una estufa a 50 C hasta su uso. Antes
de la extraccin se agrega a la vagina el tubo colector y se protege con un
tubo aislante de la luz y del fro.
Mtodo para la extraccin del semen:
En el momento de la extraccin se lleva la hembra a la jaula del macho. Se
ubica la hembra en posicin de servicio, cuando el macho intenta el salto se
coloca la vagina artificial por debajo del vientre de la coneja, de manera tal
que el pene del reproductor se introduzca en la vagina artificial.
La temperatura del agua de la vagina artificial debe ser tal, que llegue al
pene del macho a 40 / 42 C. Si se utiliza un ltex muy grueso, resulta ms
aislante y se debe aumentar la temperatura del agua.29 La temperatura del
agua es el desencadenante de la eyaculacin en el macho.30 Una vez
terminado el salto, se observa en el tubo colector si el eyaculado presenta
tapn mucoso o gel, procedente de la secrecin de las vesculas seminales
y de la prstata, debindose retirar.
El eyaculado se coloca en un tubo de centrfuga graduada dentro de un
termo a 30-36 C de temperatura, procedindose luego a la valoracin del
eyaculado de forma macroscpica y / microscpica. Otra forma es que al
extraerlo se debe ubicar en un recipiente en bao de mara a 37 C para
evitar choques trmicos.
1. Pruebas Macroscpicas:
- COLOR: Blanco nacarado normal, indica buena calidad seminal. Se deben
desechar los eyaculados que presenten una coloracin griscea, rojiza (con
sangre, por lesiones en el pene o uretra), marrn por contaminacin con
heces fecales, amarillo por presencia de pus u orina con mal olor o con
sedimentos anormales.31
- ASPECTO: Se clasifica en uniforme los ms deseados y no uniforme en
cuanto a la opacidad.
- OLOR: Suis generis, otra variante de olor se clasifica como mala.
- PH: 6,0 -7,3 es normal otros plantean de 6,8-7,5.32, 33 Por lo general a
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partir de valores de 7,2 comienza a disminuir la concentracin, motilidad y

viabilidad del semen. Valores diferentes a estos, nos indican mala calidad
seminal. Se realiza con el uso de un pHmetro o papel de tornasol.
- VOLUMEN: Se determina mediante la graduacin de los tubos colectores,
debe ser de 0,25-0,3 a 1-1,5 mL. Depende de la poca del ao los valores
mas bajos de rango se obtienen en otoo y los ms altos en primavera.34
- CONSISTENCIA: La ms deseada es lquida, que no sea acuoso. Para
realizar esta prueba homogenice en primera instancia la muestra de semen
lentamente, luego se toman 20 L y se deja caer sobre una lmina
portaobjeto gota a gota, para lo cual se dan las siguientes clasificaciones: 35
1. Gota a gota.
2. Forma de filamento.
3. Fluye como el agua.
2. Pruebas Microscpicas Fundamentales:
Las pruebas microscpicas siempre se deben realizar por dos observadores
independientes para luego establecer un promedio entre ambos resultados.
- CONCENTRACIN:
Esta valoracin es muy importante, ya que existe una variabilidad grande de
unos eyaculados a otros. La concentracin se puede calcular por varios
mtodos, destacando la espectrofotometra y el uso de cmaras de recuento
celular (Brker, Neubauer, Thoma).36 La espectrofotometra (m=540nm)
mide la densidad ptica de la muestra (turbidez), lo que permite saber la
concentracin llevando la lectura que obtengamos a una tabla de
conversin, donde estn relacionados diferentes niveles de tramitancia con
diferentes concentraciones de espermatozoides, aunque en conejos este
mtodo induce a error debido a la gran cantidad de impurezas que presenta
el semen, por lo tanto no se recomienda su uso.37
El mtodo mas usado en las investigaciones y por nosotros es la valoracin
de la concentracin mediante Cmara de Neubauer o en forma subjetiva se
observa una gota de semen entre porta y cubreobjeto a 40-60 aumentos.
La
concentracin en el semen oscila entre 50-250 x 106
espermatozoides/mL.
A continuacin encontrara el procedimiento general de dos tcnicas las
cuales de forma rpida le ayudaran a establecer la concentracin de
espermatozoides que contiene el semen a evaluar:
Tcnica 1: El conteo se realiza con ayuda de la cmara de Neubauer a una
dilucin 1:100 utilizando como diluente la solucin salina formolada, luego
se homogeniza con movimientos lentos de inversin del tubo, y se toma con
una pipeta Pasteur aproximadamente (10 L), posterior a esto se deja
deslizar en la cmara. Despus de reposar dos a cinco minutos se procede
al conteo espermtico.38
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Solucin salina formolada:

Para preparar 1 L de volumen final de esta solucin debe mezclar, 9 g
de cloruro de sodio, con 3 mL de formol al 40 % y por ultimo aadir 1
000 mL de agua destilada.
Se cuenta los espermatozoides presentes en los cuatro cuadrantes,
con un total de 16 cuadros. El volumen ocupado por los 4 o 5 cuadros
a contar segn el tipo de cmara multiplicado por la dilucin origina
un factor de multiplicacin.
Ejemplo: 16 + 18 + 12 + 20 = 66.
Factor
de
multiplicacin:
4
x
100
x
10.
Concentracin = 66 x 4 000 = 264 000 espermatozoides/mm3 o
0,264106 espermatozoides/mm3.
Esta tcnica tambin permite calcular los espermatozoides totales por
eyaculado los cuales se obtienen con una simple multiplicacin del
volumen por la concentracin. En este caso es necesario unificar la
medida por lo que se debe multiplicar nuevamente por 1 000 para
llevar desde milmetros cbicos de la concentracin hasta mililitros de
volumen.39
Ej:
Volumen
de
eyaculado:
1
mL.
Concentracin:
264
000
/mm3.
1 x 264 000 x 1 000 = 264 000 000 = 0,264 x 109
espermatozoides totales.
Tcnica 2: En primera instancia se homogeniza la muestra con
movimientos lentos de inversin del tubo, luego se toma un tubo de 12x75
mm y se agrega 100 L de semen + 900 L de solucin diluente, o
simplemente a una dilucin 1:100. Posterior a esto mezcle con movimientos
lentos de inversin del tubo y monte en cmara de Neubauer, dejar
sedimentar por 5 minutos. Debe contar en el mm central de la cmara de
Neubauer.40
Los espermatozoides contados se multiplican por 4 o 5 cuadros contados y
se dividen entre 10, se informa el nmero por 106 espermatozoides por mL.
Ej: 15+10+20+24= 69 x 4/10= 27,6 x 106 espermatozoides/mL.
Preparacin de la solucin diluente: Tome 50 g de Bicarbonato de Sodio
y luego debe diluir con agua destilada hasta completar a 100 mL.
- ANOMALIAS:
Para determinar el nmero y tipo de formas anormales puede colorear o no
con eosina la muestra. Estos valores se cuentan en base a 100 y se
expresan lo resultados como (%).
Cabeza. Es ovalada, contiene cromatina altamente condensada (DNA). La
dotacin cromosmica de sta es haploide, es decir, slo contiene la mitad
de los cromosomas que poseen las clulas somticas del animal que son
44.41
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Acrosoma. Se encuentra en el extremo anterior de la cabeza del

espermatozoide, es un saco membranoso que contiene ciertas enzimas,
como la acrosina y la hialuronidasa, que se encargan de disolver la zona
pelcida
del
ovocito
para
permitir
la
fecundacin.42
Tracto intermedio. Est delimitado en su parte anterior por el cuello y en la
posterior por el anillo. Podra definirse su funcin como el motor del
espermatozoide,
el
que
produce
el movimiento.43
Cola.
Es
aquella
parte
que
lleva
a
cabo
el
movimiento.
Las anomalas morfolgicas pueden afectar a cualquiera de las tres partes
del espermatozoide: cabeza, tracto intermedio y cola, generando
alteraciones que van a dificultar la fecundacin.44
Se coloca una gota en un portaobjeto y se observa sobre todo:
1. En la cabeza, estn los normales y anormales que incluye
(macrocabeza, microcabeza, cabeza doble y cabeza suelta).
2. En el Cuello, anillo o porcin intermedia, estn los normales y
anormales los cuales incluye (enroscado, doble, engrosado y excntrico).
3. En la Cola, estn los normales y anormales los cuales incluye (en
ovillo, ltigo, dobles y flexionadas).
De colorearse la muestra se tomaran 0,1 mL de semen y se mezclara con 3
mL de cloruro de sodio al 0,9%, luego se homogenizara con movimientos
lentos de inversin del tubo mecnicamente y se adicionara de 3 a 7 gotas
de eosina Y al 1%, dejndose actuar por 5 minutos, luego se extiende o se
coloca una gota en un portaobjeto siendo tapada con un cubreobjeto,
secndose los bordes de la lmina. Se aceptan valores de 10 a 15 %, los
cuales no son importantes, otros autores plantean que de un 20-30% de
anomalas
totales
es
aceptado.45
- MOTILIDAD:
La motilidad es una caracterstica de la clula espermtica y se trata de uno
de los parmetros ms importantes en las contrastaciones seminales,
debido a que es imprescindible para que se produzca la fecundacin. Existen
varias tcnicas de estudio de la motilidad, pero la ms utilizada y a la vez,
la ms simple, es la valoracin visual del porcentaje de espermatozoides
mviles y la calidad de su movimiento.46
Los espermatozoides pueden presentar dos tipos de movimiento,
movimientos de rotacin (alrededor de su eje) y/o movimientos progresivos
(desplazamiento de la clula), por lo general lo realizan de forma lineal,
pero en ocasiones es circular.
Para la realizacin de esta valoracin todo el material usado debe estar en
condiciones de normocinesis (temperatura de 37C).47

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Motilidad Masal: Se depositan de 7 a 10 L en un portaobjeto atemperado

(tanto los portaobjetos como las puntas deben estar a 37 C), y se
observa a 40 aumentos, se valora la velocidad con la que se mueven los
remolinos de la superficie de la gota valorndose en una escala de
puntuacin de 0-5.48
- Nada (0), Temblor en el lugar (1), Inicio de ondas van y vienen, es malo
an (2), Regular con ondas lentas (3), Buena con ondas rpidas (4) y por
ultimo Muy buena con remolinos o tornados (5).
Para que su valoracin sea buena el 60-70% de los animales examinados
deben estar entre 4 y 5. Se debe estimar los resultados como porcentaje, es
fundamental establecer un promedio entre el nmero de animales a utilizar
por
dosis.
Motilidad Individual: Diluir el semen con algn diluente seminal sobre
todo suero fisiolgico a 37 C (cloruro de sodio al 0.9%), para lo cual tome
100 L de semen para 900 L de esta solucin, luego se homogeniza con
movimientos lentos de inversin del tubo y con una pipeta procedemos a
colocar una gota en un portaobjeto, luego se coloca un cubreobjeto y se
observa al microscopio ptico (todos los tiles deben estar atemperados a
37 C).
En primer lugar se evala el % de espermatozoides con motilidad sin tener
en cuenta su movimiento.49
Luego debe evaluar el tipo de movimiento (progresivo, rectilneo y
uniforme) en una escala del 1 al 5.
(5) Muy Buena (>95%), (4) Buena (80-95%), (3) Regular (70-80%), (2)
Mala (60-70%), Nula o Muy Mala (< 60%).50 Todo el material debe estar en
condiciones de normocinesis, a temperatura de 37 C.
- VIABILIDAD:
La relacin de vivos / muertos es otro parmetro importante. Un
espermatozoide muerto libera enzimas entre las que se encuentran las del
acrosoma, que van a producir daos en las membranas de los vivos, lo que
provocar un mayor numero de espermatozoides daados y la consiguiente
prdida de calidad de las dosis seminales.51 Para determinar este cociente
se utiliza generalmente una serie de tinciones, entre ellas la de EosinaNigrosina, Yoduro de propidio o la de Tripn azul.52 Todas estas tcnicas se
basan en la capacidad del espermatozoide para evitar la incorporacin de
determinados colorantes a su interior, debido al efecto barrera que realiza
su membrana citoplasmtica.
La viabilidad en los casos de fertilidad se plantea que debe ser medida
dentro de 30 minutos posterior a la extraccin, destacndose grandes
prdidas posteriores al mismo.53 Para lo cual se adicionan 5 gotas de eosina
Y al 1% o simplemente utilice el homogenato que quedo en la prueba de
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determinacin de anomalas mezclndola con 5 gotas de nigrosina al 1%, se

plantea que todas las mediciones microscpicas del semen se deben realizar
a la misma vez para que el tiempo no sea un parmetro determinante de su
calidad,54 se colorea durante 5 minutos (la eosina colorea los
espermatozoides muertos y la nigrosina permite que los vivos al ser
incoloros o transparentes se visualicen), luego se homogeniza con
movimientos lentos de inversin del tubo y se realiza el frotis de una gota,
se esperan 10 minutos a secar. Posterior a esto se debe observar los
muertos de color rosa y los vivos transparentes siendo visualizados por el
fondo negro que forma la nigrosina.55 Ms del 70-80% es muy buena, 70%
es buena, de 60- 69 es regular, valores por debajo de 60% son malos.56,57
3. Peso de rganos y examen anatomopatolgico:
Para el sacrificio, a los animales debe administrarle una sobre dosis de
pentobarbital sdico58-61 y luego de perder los reflejos, se sacrificarn,
dejndose desangrar por la vena cava abdominal.62 Posteriormente se
practica la necropsia completa examinndose el contenido de las cavidades
abdominal, torcica y craneana, pesando los (testculos derecho e izquierdo,
epiddimos derecho e izquierdo, prstata y vesculas seminales) y tomando
muestras de estos segn el protocolo de trabajo para el estudio
histopatolgico.63 Con posterioridad se debe calcular la relacin: (peso del
rgano/peso corporal) x 100 para su procesamiento estadstico como ndice
de toxicidad. El peso corporal referido es el que presentan el da del
sacrificio. 64 Para el estudio histopatolgico, las muestras obtenidas se
deben fijar en formaldehdo al 10% tamponado y los cortes se deben
colorear con hematoxilina y eosina.65 Deber someterse a este estudio con
prioridad todos los animales del grupo control y de la dosis mxima
utilizada.
Conclusiones
Todas las pruebas descritas aportan datos que nos indicarn una
disminucin de la calidad del semen, pero debemos realizar valoraciones
que nos aporten sencillez, rapidez y que sean econmicamente viables;
para ello, cada investigador debe utilizar aquellas que mejor se adapten a
su forma de trabajo, sin olvidar que a mayor nmero de pruebas, ms
fiables son los resultados de las mismas. El uso de estas pruebas en los
laboratorios de toxicologa experimental constituye una herramienta til, la
cual ayuda a una valoracin preclnica ms amplia de nuevos productos y/o
ingrediente activo.
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