PRODUCCIN DE CELULASAS A PARTIR DEL HONGO Trichoderma sp Y

APROVECHAMIENTO DE LA FIBRA PRENSADA DE PALMA COMO MEDIO DE CULTIVO

Ramrez, O.L. (olgalramirezf@hotmail.com).* Urrego, F.A. (freddyurrego@tutopia.com) *

RESUMEN
A lo largo de la historia, se han venido empleando las enzimas para usos industriales, lo que ha
desarrollado la biotecnologa como herramienta para que a travs de microorganismos se
obtengan metabolitos de inters tanto industrial como ambiental. Una de las enzimas comnmente
utilizadas es la celulasa, obtenida mediante diferentes microorganismos, los cuales han sido
estudiados en diferentes tipos de sustratos. Trichoderma, es un gnero de los ms estudiados,
encontrando que la temperatura ptima de crecimiento se encuentra alrededor de 25 a 30C, que
debido a que son aerobios requieren de una fuente de oxgeno y toleran un amplio rango de pH (28.5). Con el fin de determinar el potencial de aprovechamiento de la fibra extrada de palma
africana como medio de cultivo para el hongo Trichoderma sp, para la produccin de celulasas se
prepararon medios de cultivos (fibra prensada de palma africana molida y agua) en diferentes
proporciones (9.09%, 12.5%, 25% y 44.4%), los cuales fueron inoculados con el hongo
Trichoderma sp e incubados por quince (15) das bajo distintas condiciones1, transcurrido el tiempo
de los medios de cultivo que no tuvieron agitacin, las que presentaron mayor crecimiento fueron
aquellas que se sometieron a una temperatura de 23C, y a una concentracin de sustrato de 25%.

INTRODUCCIN
Los microorganismos producen una amplia gama de enzimas tiles a nivel industrial, muchas de
las cuales son segregadas al exterior celular.
Estos microorganismos son capaces de
desarrollarse fcil y rpidamente en su medio de cultivo cuya tecnologa se encuentra hoy bien
establecida. La optimizacin de la produccin de enzimas a partir de microorganismos depende de
una serie de factores interrelacionados, lo que significa que una enzima solo puede sintetizarse
durante parte del ciclo de crecimiento (3). Algunos hongos de importancia industrial empleados
para la obtencin de metabolitos son los correspondientes al gnero Deuteromicetos
(Deuteromicotina), entre los cuales estn Aspergillus niger, Penicillium notatum-chrysogenum y
Trichoderma viride. Otros estn cobrando importancia debido a su utilizacin en la biotecnologa
ambiental ya que son capaces de metabolizar una variedad de compuestos qumicos orgnicos,
muchos de los cuales son contaminantes (5). Debido a estas caractersticas, se pretende
contemplar el estado del arte de la produccin industrial de celulasas a partir de Trichoderma
viride, con el fin de aprovechar su metabolismo para degradar la celulosa presente en la fibra
residual del proceso de extraccin de aceite a partir de la palma africana.
La celulosa es un polisacrido cuya frmula qumica corresponde a: C6H10O5, es el principal
componente de la membrana celular de la mayor porte de las plantas. La celulosa est constituida
por molculas de D-glucosa unidas por enlaces (1-4) glucosdicos y es el polmero ms
abundante en la biosfera, generalmente resistente a la fermentacin, no significa que no se pueda
hidrolizar, pues existen microorganismos celulticos que poseen enzimas como: las
celobiohidrolasas y las endoglucanasas que se encargan de su degradacin. (6).
*

Fundacin Universidad de Bogot Jorge Tadeo Lozano, Ingeniera de Alimentos, X Semestre.

Cultivos a 23 C (Proporciones de fibra: 9.09%; 12.5%; 25%); Cultivos a 30 C (Proporciones
de fibra: 9.09%; 12.5 %; 12.5% con agitacin; 25%, 44.44%)

Las especies de Trichoderma son hongos que aparecen en cualquier ripo de suelo, produciendo
colonias blancas, amarillas o ms tpicamente verdes cuando se cultivan. Las especies verdes de
Trichoderma fueron inicialmente clasificadas como una especie nica, T. Viride hasta que fueron
subdivididas por Rifai. Las especies de Trichoderma se utilizan para producir celulasas. Sin
embargo, son particularmente efectivas como antagonistas del crecimiento de otros hongos,
muchos de ellos patgenos de plantas, con el resultado de que las especies de Trichoderma son
importantes agentes en biocontrol (5). El hongo Trichoderma reesei es un microorganismo
celultico que contiene cuatro grandes celulasas (1,4-beta-D-glucancelobiohidrolasas CBHI y CBH
II, endo-1,4-beta-D-glucanasa EG I y EGII). (7).
Desde el punto de vista gentico, se han estudiado genes que codifican para las celulasas (cbh1,
cbh2, egl1 y egl2), mediante sustitucin por el marcador gentico amds de Aspergillus nidulans..
Estas investigaciones han sugerido que la CBHII y la EGII son las ms importantes en la actividad
enzimtica de la celulasa porque intervinenen en la formacin eficiente del inductor de stas en T.
Ressei y que la eliminacin de ambas cadenas celobiohidrolasas (CBHII y EGII) imposibilita a la
enzima para desdoblar la celulosa cristalina. (4).
La mayor parte de los procedimientos estudiados a escala preindustrial utilizan enzimas producidas
por Trichoderma reesei.. Este microorganismo tiene la ventaja de excretar, en grandes cantidades,
la mezcla adecuada de enzimas, que permite la hidrlisis de celulosas amorfas y cristalinas. Se ha
observado que la celulosa microcristalina (10g/L) es hidrolizada principalmente por dos de estas
celulasas (celobiohidrolasa CBH I y endoglucanasa EG II) del hongo Trichoderma reesei. Se han
realizado dos tipos de experimentos, donde ambas enzimas se agregaron especficamente y de
forma equimolecular, analizando la adsorcin de las enzimas y la produccin de los azcares
solubles por tcnicas de FPLC y HPLC, respectivamente. Los resultados obtenidos por este grupo
de investigacin sugieren que la CBH I produce azcares ms solubles que la EG II, excepto a
concentraciones menores del 1%. Adems, mediante simulaciones computacionales se encontr
un modelo comn de hidrlisis para las enzimas de CBH I y otro modelo claramente discernible
para las enzimas del CBH II de muestras de Trichoderma reesei. (4)

MATERIALES Y MTODOS
Se prepararon medios de cultivo (fibra molida y agua) a concentraciones de 9.09%,
12.5%, 25% y 44.44% en erlenmeyer de 250 ml , luego se esterilizaron a 121C por
15 min, se procedi a inocular con Trichoderma sp, se incubaron por 15 das bajo
diferentes condiciones2 en una estufa Memmert, una vez retirados los medios se les
adicionaron 100 ml de agua destilada, y del sobrenadante se tom 1 ml en tubos de
centrfuga para centrifugarlos por 10 min a 3600 4000 rpm, se tomaron 0.3 ml del
sobrenadante y se complet a 1 ml con agua destilada en tubos de ensayo, para
realizar la prueba de DNS, la cualificacin se llev a cabo en un espectrofotmetro helios.

Cultivos a 23 C (Proporciones de fibra: 9.09%; 12.5%; 25%); Cultivos a 30 C (Proporciones

de fibra: 9.09%; 12.5 %; 12.5% con agitacin; 25%, 44.44%)

RESULTADOS
Tabla 1.
Cultivos a 23 C
Porcentaje de fibra Absorbancia
9,09
0,098
12,5
0,123
25
0,16
44,44
0,097
Cultivos a 30 C
9,09
0,064
12,5
0,109
25
0,146
44,44
0,078
Cultivo a 30 C con agitacin
12,5
0,242

Grfico de Absorbancia vs porcentaje de fibra

0,26
0,24
0,22
0,2
Absorbancia

0,18

Cultivos a 23 C

0,16
0,14

Cultivos a 30 C

0,12
0,1

Cultivo a 30 C con
agitacin

0,08
0,06
0,04
0,02
0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Porcentaje

DISCUSIN DE RESULTADOS
Para la interpretacin de los datos se hace un anlisis cualitativo donde por medio de la prueba de
DNS se determinan la relacin de azucares reductores presentes en las muestras como resultado
de la degradacin de la celulosa contenida en la fibra de palma africana. Aunque la absorbancia
es un parmetro que permite determinar la cantidad de enzima producida de una manera
cualitativa, para efectos de determinacin de costos, de rendimientos y dimensionamiento de
equipos es necesario la realizacin de una curva de calibracin para el DNS que permita cuantificar
la concentracin de enzima que se produce a partir de medios de cultivos con diferentes
condiciones.

Al analizar la grfica de absorbancia versus concentracin se observa que para todas las
concentraciones de los medios que no fueron sometidos a una agitacin durante la incubacin, hay
una mayor produccin de azcares reductores a una temperatura de 23 C, valor que se aproxima
a los datos ptimos de crecimiento encontrados en la literatura.
Igualmente se observa que la concentracin de sustrato donde hubo mayor produccin de celulasa
fue de 25% de fibra de palma africana para cada una de las temperaturas evaluadas, debido a que
concentraciones menores hay un exceso de humedad en el medio que inhabilita el crecimiento del
hongo Trichoderma sp, y a su vez la degradacin de celulosa debido a que se disminuye la
concentracin de sustrato para consumo. Por otra parte, en concentraciones mayores de sustrato
el medio de cultivo queda bastante seco para el crecimiento del hongo.
Se obtuvo un valor de absorbancia alto para el medio de cultivo sometido a un proceso de
agitacin durante la incubacin, que inicialmente pude indicar que bajo este proceso fsico se
aumenta la produccin de celulasa, sin embargo, no se cuenta sino con un solo dato y no es
posible generalizar con este ya que no se cuenta con ms valores que hagan veraz esta
suposicin. No obstante, al analizar las condiciones del proceso de agitacin, sera lgico que una
mejor distribucin del sustrato homogenizara las condiciones del medio y el hongo tendra una
mejor disposicin de estos para su crecimiento.
Los diferentes medios preparados permiten identificar algunas de las condiciones ptimas que se
pueden adoptar a nivel industrial para la produccin de celulasas, sin embargo, un factor que se
debe considerar es el hecho de haber tomado las lecturas a los 15 das de inoculado el cultivo, ya
que entonces se hace necesario determinar en investigaciones posteriores la curva de crecimiento
con respecto al tiempo del hongo Trichoderma sp, para determinar el tiempo mnimo necesario
para la produccin de determinada cantidad de enzima.

CONCLUSIONES
Al observar el crecimiento del hongo Trichoderma sp en cada uno de los medios preparados se
asume que este posee la cantidad necesaria de nutrientes para el desarrollo del mismo, y que la
fibra puede ser utilizada como fuente de celulosa para implementacin a nivel industrial.
Se determinaron algunas de las condiciones ptimas de crecimiento necesarias para una mayor
produccin de celulasas utilizando como medio de cultivo fibra prensada de palma, y con el empleo
del hongo Trichoderma sp, como lo fueron una concentracin de fibra de aproximadamente 25%,
con una temperatura de incubacin cercana a los 23 C, como un mtodo alternativo de
aprovechamiento de este subproducto, que posteriormente puede ser materia prima para otro tipo
de procesamiento (extraccin de carotenos del aceite residual, o empleo en las calderas de las
plantaciones).
Se determin la importancia de establecer el tiempo mnimo necesario para que se produzca una
cantidad especfica de enzima, as como la elaboracin de la curva de calibracin para la prueba
de DNS, para poder cuantificar la cantidad de enzima producida y establecer ciertas condiciones
de diseo como el tamao del biorreactor y los rendimientos obtenidos bajo las diferentes
condiciones evaluadas.
Se comprob el potencial que posee la fibra prensada de palma como fuente rica de nutrientes
para el crecimiento del hongo Trichoderma sp, y como resultado de esto la produccin de celulasas
para dos fines: 1) comercializacin de la enzima concentrada, y 2) reutilizacin de la fibra agotada
para otros fines como extraccin de carotenos o empleo como combustible en las calderas de las
plantaciones.

BIBLIOGRAFA
1. CASTILLO, M.R., M. Gutirrez-Correa, J. Linden y R.P. Tengerdy. 1994. Mixed culture solid
substrate fermentation for cellulolytic enzyme production. Biotechnol. Lett. 16(9):967-972.
2. DUEAS, R., R.P. Tengerdy y M. Gutierrez-Correa. 1995. Cellulase production by mixed fungi
in solid substrate fermentation of bagasse. World Journal of Microbiology and Biotechnology
11(3):333-337.
3. GACESA, P. 1990. Tecnologa de las enzimas. Editorial Acribia S.A. Zaragoza Espaa. Pp 15
24.
4. SEIBOTH B; Hakola S; March Rl; Suominen Pl; Kubicek Cp. Role de four major cellulases in
triggering of cellulase gene expression by celloluse in Trichoderma reesei. J bacteriol, 1997 sep,
179:17, 5318-20.
5. WAINWRIGHT, M. 1992. Introduccin a la biotecnologa. Editorial Acribia S.A. Zaragoza
Espaa. Pp 18 21.
6. http://www.monografias.com/trabajos5/recicla/recicla.shtml
7. http://webcd.usal.es/web/transgen00/otrdoc/prodacetetona/prodacetetona.htm#cuatro
8. http://www.lead.virtualcentre.org/es/enl/BTJ%20Taller/garciayaneysi.htm
9. Revista Novo Nordisk, 1992.