Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas

Facultad de Medio Ambiente y Recursos Naturales

Ingeniera Ambiental
Bioqumica
ACCION CONTAMINANTE EN EL ADN
Autores1:
Yeiver Fabian Vega Bello- 20132180281
Jos Lpez Fino- 20132180019
Jeison ngel Arango - 20132180955
Diego Alexander Escobar- 20141180080
INTRODUCCION
Uno de los enfoques que presenta el tema
sugerido tiene que ver con Las enzimas
de restriccin, tambin conocidas como
endonucleasas, son enzimas que cortan
los enlaces fosfodiester del material
gentico a partir de una secuencia que
reconocen. Las mismas permiten cortar
DNA de hebra doble, donde reconocen
secuencias palindrmicas (secuencias
que se leen igual en ambas direcciones).
Son
extradas
de
organismos
procariticos (bacterias), donde actan
como un mecanismo de defensa, para
degradar material gentico extrao que
entre en la clula. Las bacterias tienen la
capacidad de metilar su DNA, lo cual
sirve para distinguir entre el DNA
extrao y el DNA propio. Las enzimas
de restriccin no pueden cortar DNA
metilado, de este modo solo afectan el
DNA extranjero y no el DNA bacterial.
Aplicaciones
restriccin:

de

las

enzimas

de

1. Hacer mapa de restriccin de un

plsmido o bacterifago.
2Fragmentar DNA genmico para
separacin de electroforesis y Southern
Blot
3Generacin de fragmentos para ser
usados
como sondas marcadas en
Southerny Northern blotting.
4. Generacin de fragmentos para ser
subclonados en los vectores apropiados,
creacin de DNA recombinante.
Con este tema se pretende conocer los
diferentes factores que intervienen en el
ADN. Destacando el estudio de
mutaciones con ayuda de herramientas
como la ingeniera gentica; que se
podra definir como un conjunto de
metodologas que permite transferir
genes de un organismo a otro y
expresarlos (producir las protenas para
las cuales estos genes codifican) en
organismos diferentes al de origen. El
ADN que combina fragmentos de
organismos diferentes se denomina

Estudiantes de Ingeniera Ambiental, espacio acadmico Bioqumica

ADN recombinante. En consecuencia,

las tcnicas que emplea la ingeniera
gentica se denominan tcnicas de ADN
recombinante. As, es posible no slo
obtener protenas recombinantes de
inters sino tambin mejorar cultivos y
animales. Los organismos que reciben un
gen que les aporta una nueva
caracterstica se denominan organismos
RESUMEN
El cido desoxirribonucleico, abreviado
como ADN, es un cido nucleico que
contiene instrucciones genticas usadas
en el desarrollo y funcionamiento de
todos los organismos vivos conocidos y
algunos virus, y es responsable de su
transmisin hereditaria. La funcin
principal de la molcula de ADN es el
almacenamiento a largo plazo de
informacin
La funcin de la reparacin del DNA es
el mantenimiento de la informacin
gentica intacta La reparacin del DNA
est muy relacionada con la replicacin
puesto que en la mayor parte de los
procesos de reparacin se da algo de
replicacin y con la recombinacin,
puesto que la recombinacin es una de
las vas de reparacin. El DNA est
expuesto a multitud de agentes que
pueden producirle daos.
Cmo se produce el Dao en el DNA?
1) Errores en la replicacin: la seguridad
con que una secuencia de DNA se copia
durante la replicacin depende de la
fidelidad de la polimerasa en la seleccin
correcta del dNTP para insertarlo en la
cadena complementaria que se sintetiza
a partir del DNA parental. Los errores en
la replicacin se incrementan si el
balance de los 4 dNTP en la clula del

genticamente modificados (OGM) o

transgnicos. A su vez, la ingeniera
gentica es lo que caracteriza a
la
biotecnologa
moderna
que
implementa estas tcnicas en la
produccin de bienes y servicios tiles
para el ser humano, el ambiente y la
industria

DNA precursor se desordena, si un

dNTP se encuentra en exceso se puede
alterar la normalidad de la polimerasa
e incorporar este nucletido en lugar
del correcto.
2) Daos espontneos: a 37 C miles de
bases se pierden espontneamente,
dejando
sitios
apurnicos
y
apirmidnicos incapaces de determinar
la insercin correcta de las bases en la
cadena complementaria.
3) Daos endgenos: la mayor parte de
estos cambios se producen por la
generacin de radicales libres como
subproductos de la respiracin aerobia
normal. Estos radicales que son
molculas o fragmentos moleculares con
electrones sin aparear son capaces de
acelerar la ruptura de las cadenas del
DNA.
4) Daos exgenos:
a) Radiaciones ionizantes: los rayos X
y , provocan ruptura de simple cadena,
ruptura de doble cadena, bases daadas
por ionizacin directa y generan
radicales libres.
b) Radiaciones ultravioleta (UV): es el
agente que daa el DNA ms estudiado,
causa la formacin de enlaces
intracadenas
(dimerizacin
de
pirimidinas), en orden de abundancia
TT, CT y CC. La figura siguiente
muestra dos tipos de dmero de timina.

Se hace nfasis en La mutagnesis

(generacin de cambios en el ADN)
puede afectar clulas somticas o
germinales (Figura 10). En las clulas
somticas (cualquier clula del cuerpo)
la mutacin puede transmitirse por
divisin
celular
ocasionando
degeneraciones, como el cncer, o
muerte celular. En las clulas germinales
(vulo,
espermatozoide)
causa
disminucin en la fertilidad, abortos
espontneos, y defectos en las progenie,
estas alteraciones pueden ser dominantes
o recesivas, es decir manifestarse o no en
la
primera
generacin
(Teaf
&Middendorf, 2000)
ABSTRACT
Modern implementing these techniques
in the production of useful goods and
services to humans, the environment and
industry
Deoxyribonucleic acid, abbreviated as
DNA, is a nucleic acid that contains the
genetic instructions used in the
development and functioning of all
known living organisms and some
viruses, and is responsible for his
inheritance. The main function of the
DNA molecule is a long term storage of
information
The role of DNA repair is the
maintenance of the intact genetic
information DNA repair is closely
related to replication since in most of the
repair processes is given some
replication and recombination since
recombination It is one of the avenues of
redress. The DNA is exposed to many
agents, which can cause damage.
How the DNA damage occurs?

1) Errors in replication: the certainty

with which a DNA sequence is copied
during replication depends on the fidelity
of the polymerase in the correct selection
of dNTP to be inserted into the
complementary strand is synthesized
from the parental DNA. The replication
errors are increased if the balance of the
4 dNTPs DNA precursor cell is
disordered, if a dNTP is in excess can
alter normal polymerase and incorporate
this nucleotide in the correct place.
2) spontaneous Damage: 37 C thousand
bases are lost spontaneously, leaving
apurinic sites apyrimidinic unable to
determine the correct insertion of the
bases in the complementary strand.
3) Damage endogenous: most of these
changes are produced by the generation
of free radicals as byproducts of ordinary
aerobic respiration. These radicals are
molecules or molecular fragments with
unpaired electrons are able to accelerate
the breakdown of DNA chains.
4) exogenous Damage:
a) ionizing radiation: X-rays and , cause
single strand break, double strand break,
damaged bases by direct ionization and
generate free radicals.
b) ultraviolet radiation (UV) is the agent
that damages the DNA studied, causes
the formation of intrachain bonds
(pyrimidine dimerization), in order of
abundance T T, C T & C C. The
following figure shows two types of
thymine dimer.
Emphasis is placed on mutagenesis
(generation of DNA changes) may affect
somatic or germ cells (Figure 10). In
somatic cells (any cell of the body) can
be transmitted by the mutation causing

cell division degenerations, such as

cancer, or cell death. In germ cells (egg,
sperm) causes decreased fertility,
spontaneous abortions, and defects in
offspring, these alterations can be
dominant or recessive, that is manifest or
not in the first generation (FASD &
Middendorf, 2000).
Deoxyribonucleic acid, abbreviated as
DNA, is a nucleic acid that contains the
genetic instructions used in the
development and functioning of all
known living organisms and some
viruses, and is responsible for his
inheritance. The main function of the
DNA molecule is the long-term storage
of information. Many times, the DNA is
compared to a blueprint or a recipe, or a
code, since it contains the instructions
needed to construct other components of
cells, such as proteins and RNA
molecules. The DNA segments that carry
this genetic information are called genes,
but other DNA sequences have structural
purposes or are involved in regulating
the use of this genetic information.
ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO

El cido desoxirribonucleico, abreviado

como ADN, es un cido nucleico que
contiene instrucciones genticas usadas

en el desarrollo y funcionamiento de
todos los organismos vivos conocidos y

algunos virus, y es responsable de su

transmisin hereditaria. La funcin
principal de la molcula de ADN es el
almacenamiento a largo plazo de
informacin. Muchas veces, el ADN es
comparado con un plano o una receta, o
un cdigo, ya que contiene las
instrucciones necesarias para construir
otros componentes de las clulas, como
las protenas y las molculas de ARN.
Los segmentos de ADN que llevan esta
informacin gentica son llamados
genes, pero las otras secuencias de ADN
tienen propsitos estructurales o toman
parte en la regulacin del uso de esta
informacin
gentica.
COMPOSICIN Y ESTRUCTURA
DEL ADN
La molcula de ADN es una larga doble
hlice enrollada sobre s misma,
semejante a una escalera de caracol. En
ella, dos ramales compuestos de
molculas de azcar (desoxirribosa) y
fosfatos, se conectan gracias al
apareamiento de cuatro molculas
denominadas bases, las cuales forman
los eslabones de la escalera. Estas
cadenas formadas por cuatro nucletidos
distintos, compuestos adems por un
azcar (la desoxirribosa), un cido
fosfrico, y una de las siguientes bases
nitrogenadas: adenina (A), guanina (G),
citosina (C) o timina (T). En los
eslabones, la adenina se aparea con la
timina y la guanina con la citosina. As
un enlace de hidrgeno. Un gen es
segmento de un ADN, que tiene una
determinada funcin y est constituido
por una secuencia especfica de base
Desde el punto de vista qumico, el ADN
es un polmero de nucletidos, es decir,
un polinucletido. Un polmero es un

compuesto formado por muchas

unidades simples conectadas entre s,
como si fuera un largo tren formado por
vagones. En el ADN, cada vagn es un
nucletido, y cada nucletido, a su vez,
est formado por un azcar (la
desoxirribosa), una base nitrogenada
(que puede ser adeninaA, timinaT,
citosinaC o guaninaG) y un grupo
fosfato que acta como enganche de cada
vagn con el siguiente. Lo que distingue
a un vagn (nucletido) de otro es,
entonces, la base nitrogenada, y por ello
la secuencia del ADN se especifica
nombrando slo la secuencia de sus
bases. La disposicin secuencial de estas
cuatro bases a lo largo de la cadena (el
ordenamiento de los cuatro tipos de
vagones a lo largo de todo el tren) es la
que codifica la informacin gentica: por
ejemplo, una secuencia de ADN puede
ser ATGCTAGATCGC... En los
organismos vivos, el ADN se presenta
como una doble cadena de nucletidos,
en la que las dos hebras estn unidas
entre s por unas conexiones
denominadas puentes de hidrgeno.
Para que la informacin que contiene el
ADN pueda ser utilizada por la
maquinaria celular, debe copiarse en
primer lugar en unos trenes de
nucletidos, ms cortos y con unas
unidades diferentes, llamados ARN. Las
molculas de ARN se copian
exactamente del ADN mediante un
proceso denominado transcripcin. Una
vez procesadas en el ncleo celular, las
molculas de ARN pueden salir al
citoplasma para su utilizacin posterior.
La informacin contenida en el ARN se
interpreta usando el cdigo gentico, que
especifica la secuencia de los
aminocidos de las protenas, segn una

correspondencia de un triplete de
nucletidos
(codn)
para
cada
aminocido. Esto es, la informacin
gentica (esencialmente: qu protenas
se van a producir en cada momento del
ciclo de vida de una clula) se halla
codificada en las secuencias de
nucletidos del ADN y debe traducirse
para poder funcionar. Tal traduccin se
realiza usando el cdigo gentico a modo
de diccionario. El diccionario "secuencia
de
nucletido-secuencia
de
aminocidos" permite el ensamblado de
largas cadenas de aminocidos (las
protenas) en el citoplasma de la clula.
Por ejemplo, en el caso de la secuencia
de
ADN
indicada
antes
(ATGCTAGATCGC...),
la
ARN
polimerasa utilizara como molde la
cadena complementaria de dicha
secuencia de ADN (que sera TACGAT-CTA-GCG-...) para transcribir una
molcula de ARNm que se leera AUGCUA-GAU-CGC-...;
el
ARNm
resultante, utilizando el cdigo gentico,
se traducira como la secuencia de
aminocidos metionina-leucina-cido
asprtico-arginina-...

Las secuencias de ADN que constituyen

la unidad fundamental, fsica y funcional
de la herencia se denominan genes. Cada
gen contiene una parte que se transcribe
a ARN y otra que se encarga de definir
cundo y dnde deben expresarse. La
informacin contenida en los genes
(gentica) se emplea para generar ARN
y protenas, que son los componentes
bsicos de las clulas, los "ladrillos" que
se utilizan para la construccin de los
orgnulos u organelos celulares, entre
otras funciones.

Dentro de las clulas, el ADN est

organizado en estructuras llamadas
cromosomas que, durante el ciclo
celular, se duplican antes de que la clula
se divida. Los organismos eucariotas
(por ejemplo, animales, plantas, y
hongos) almacenan la mayor parte de su
ADN dentro del ncleo celular y una
mnima parte en elementos celulares
llamados mitocondrias, y en los plastos y
los
centros
organizadores
de
microtbulos o centrolos, en caso de
tenerlos; los organismos procariotas
(bacterias y arqueas) lo almacenan en el
citoplasma de la clula, y, por ltimo, los
virus ADN lo hacen en el interior de la
cpside de naturaleza proteica. Existen
multitud de protenas, como por ejemplo
las histonas y los factores de
transcripcin, que se unen al ADN
dotndolo
de
una
estructura
tridimensional determinada y regulando
su expresin. Los factores de
transcripcin reconocen secuencias
reguladoras del ADN y especifican la
pauta de transcripcin de los genes. El
material gentico completo de una
dotacin cromosmica se denomina
genoma y, con pequeas variaciones, es
caracterstico de cada especie.
-ADN cromosmico
Es el ADN de la clula, en el mismo se
almacena
la
informacin
gentica
perteneciente de la misma. Su ubicacin
depende de la clula en cuestin, en el caso
de las eucariotas se encuentra dentro del
ncleo celular y en las procariontes, en el
citoplasma asociado a la cara interna de la
membrana celular.
Se trata de una doble cadena de bases
complementarias formada cada una
por nucletido, cada uno de ellos formados

por una base de pirmidina o purina, azcar

desoxirribosa y un grupo fosfato. El genoma
humano esta constituido por 23 molculas de
ADN con una longitud de entre 50 y 250
millones de bases.

-ADN recombinante o recombinado

Se trata de una unin de secuencias de ADN
producida de manera artificial generalmente
de forma in vitro. Estas cadenas provienen
de dos organismos de especies diferentes
que no tienen ninguna relacin.
Esta tcnica es utilizada para manipular el
material gentico, lo que permite que sea
aadido un nuevo tipo de ADN al
organismo, esto genera modificacin en los
rasgos o la creacin de nuevos. Este
procedimiento es llevado a cabo con
diferentes fines, como por ejemplo para
tratar algn tipo de enfermedad o la
produccin devacunas. Para esto se busca un
organismo que tenga un ADN de inters y
luego se propaga el mismo en otro
organismo, objeto, etc. Esto es muy utilizado
como tratamiento de fertilidad.
-ADN mitocondrial
Este tipo de ADN se refiere al material
gentico existente en orgnulos de la clula
llamados mitocondrias, los cuales son los
encargados de proveer energa a dicha
clula. Este ADN se reproduce por si mismo
cuando la clula eucariota se divide. Se cree
que evolutivamente este tipo de ADN
desciende del genoma de las bacterias, las
cuales fueron englobadas en s clulas
eucariotas.
Estn organizados en forma de nucloides y
su tamao vara segn diversos factores. Se
encuentra en replicacin constante,
independientemente de la clula que lo aloja,
su reproduccin no depende de su ciclo ni
del tipo de la misma.
-ADN fsil

Se
utiliza
en
el
rea
de paleontologa, generalmente para
determinar la antigedad de ADN en
cuestin, para esto se utiliza una reaccin en
cadena de polimerasas lo que permite
estudiar los registros a nivel molecular del
ADN encontrado para determinar la vejez
del mismo. Con este tipo de procedimiento
se dedujo que ADN del fsil ms antiguo
encontrado pertenece a neandertales de no
ms de 50.000 aos.
-ADN superenrollado
Esta molcula tiene como caracterstica
principal que esta, como su nombre lo
indica, enrollada o girada sobre si misma.
Esto fue descubierto gracias a los
diversos estudios topolgicos de la molcula
de ADN. Se reconoce que una secuencia de
ADN puede estar en diferentes estados de
relajacin, es decir planos, o de manera
contraria en varios estados de enrollamiento.
El superenrollamiento se da como
consecuencia de una tensin que sufre la
molcula en su estructura y puede aparecer
de forma tanto negativa como positiva. Esto
est regulado por las enzimas toposomerasas

Mutanogenesis
La mutagnesis (generacin de cambios en
el ADN) puede afectar clulas somticas o
germinales. En las clulas somticas
(cualquier clula del cuerpo) la mutacin
puede transmitirse por divisin celular
ocasionando degeneraciones, como el
cncer, o muerte celular. En las clulas
germinales (vulo, espermatozoide) causa
disminucin en la fertilidad, abortos
espontneos, y defectos en las progenie,
estas alteraciones pueden ser dominantes o
recesivas, es decir manifestarse o no en la
primera generacin (Teaf &Middendorf,
2000).

Los daos en las clulas somticas

embrionarias, causados despus de la
concepcin y antes del nacimiento, es decir
durante el desarrollo del feto, se denomina
teratognesis, este tipo de alteraciones se
producen cuando la hembra en gestacin se
expone a un agente txico. La teratognesis
es consecuencia de diferentes txicos, no
slo aquellos asociados a genotoxicidad
(Vallejo, 1997;Philp, 2001).
La definicin que dio De Vries (1901) de
la mutacin era la de cualquier cambio
heredable en el material hereditario que no
se puede explicar mediante segregacin o
recombinacin.
La definicin de mutacin a partir del
conocimiento de que el material hereditario
es el ADN y de la propuesta de la Doble
Hlice para explicar la estructura del
material hereditario (Watson y Crick, 1953),
sera que una mutacin es cualquier cambio
en la secuencia de nucletidos del ADN.

La mutacin es la fuente primaria de

variabilidad gentica en las poblaciones,
mientras que la recombinacin al crear
nuevas combinaciones a partir de las
generadas por la mutacin, es la fuente
secundaria de variabilidad gentica.
La mutagnesis es el proceso txico por el
cual algunos xenobiticos son
Capaces de inducir una mutacin, o cambio,
en la secuencia normal de los pares bases que
caracterizan la estructura de cada molcula
de ADN. Esta mutacin puede resultar
espontnea, en cuanto consecuencia de un
error en la replicacin
Reparacin del ADN; sin embargo, tambin
puede ser inducida por las actividades de
agentes fsicos, o qumicos, representados
estos ltimos por molculas de xenobiticos
que han penetrado en el organismo vivo.

Muchos compuestos electroflicos pueden

formar enlaces covalentes con la molcula
del ADN para dar lugar a lo que se conoce
con el nombre de aducto. Los aductos se
pueden definir, por lo tanto, como bases del
ADN

grupos metilo o etilo, como en el caso de los

compuestos
alquilantes
(mostazas
nitrogenadas), y otras por el contrario,
pueden ser voluminosos al intervenir
heterociclos con varios anillos, como
aflatoxina Bl, benzo(a)pireno, etc.

Enlazadas a grupos qumicos aadidos, no

asociadas con las funciones fisiolgicas del
ADN. Los aductos no son propiamente

mutaciones; son lesiones en el ADN que en

todo caso pueden ser premutagnicas.

No todos los aductos tienen las mismas

consecuencias fisiolgicas; mientras que
algunos parecen no interferircon las
funciones normales del ADN o son
reparados rpidamente, otros en cambio
son mutagnicos e, incluso, pueden ser
letales.
Los compuestos qumicos electroflicos,
o que dan lugar a metabolitos
electroflicos mediante procesos de
biotransformacin, forman fcilmente
aductos, unas veces de pequeo tamao
debido a la adicin de grupos metilo o
etilo, como en el caso de los compuestos
alquilantes (mostazas nitrogenadas), y
otras por el contrario, pueden ser
voluminosos al intervenir heterociclos
con varios anillos, como aflatoxina Bl,
benzo(a)pireno, etc.
No todos los aductos tienen las mismas
consecuencias fisiolgicas; mientras que
algunos parecen no interferircon las
funciones normales del ADN o son
reparados rpidamente, otros en cambio son
mutagnicos e, incluso, pueden ser letales.
Los compuestos qumicos electroflicos, o
que dan lugar a metabolitos electroflicos
mediante procesos de biotransformacin,
forman fcilmente aductos, unas veces de
pequeo tamao debido a la adicin de

Daos genticos
Algunas sustancias txicas actan como
agentes mutgenos, es decir que producen
mutaciones en el ADN, en plantas, animales
o seres humanos. La alteracin de los genes
humanos puede causar enfermedades como
deformaciones en los pies, labio leporino,
debilitamiento del sistema de defensa del
organismo, y deformaciones en el desarrollo
embrionario que van desde pequeas
lesiones cardiacas hasta malformaciones
letales.
Alteraciones en el funcionamiento de las
hormonas Algunas de estas sustancias tienen
estructura qumica similar a hormonas
humanas como los estrgenos que regulan la
produccin de espermatozoides y pueden
interferir en el funcionamiento del sistema
genital, provocando disminucin de la
fertilidad.
Cncer
Varios productos sintticos y compuestos
que se extraen del petrleo, como el PAH,
los hidrocarburos y el holln son
cancergenos potenciales.
Alergias
Algunos contaminantes txicos como las
dioxinas y el nquel provocan reacciones
alrgicas. Las personas que desarrollan
hipersensibilidad a esas u otras sustancias
sufren
asma,
erupciones
cutneas,
estornudos, etc.

Alteraciones en el comportamiento
Se ha comprobado que algunos animales,
por ejemplo los peces que viven en grandes
cardmenes como forma de protegerse de
sus depredadores, cuando estn intoxicados
por contaminantes olvidan las pautas de
actuacin que les permiten defenderse y se
hacen ms vulnerables.
Resistencia
Muchas plagas y malas hierbas desarrollan
resistencia y aguantan cada vez dosis
mayores de pesticidas o herbicidas sin sufrir
daos. Algo similar sucede con las bacterias
de las enfermedades que se hacen resistentes
a los antibiticos. Cuantas ms sustancias
qumicas sintticas ponemos en la naturaleza
o cuanto mayor es el nmero de antibiticos
que usamos, ms fcil es que se desarrollen
este tipo de resistencias. Esto obliga, a su
vez, a estar buscando continuamente nuevos
pesticidas y antibiticos.
Efectos sinrgicos
Se habla de sinergia cuando el efecto
provocado por dos sustancias juntas es
mayor que la suma de los efectos que
producira cada una por separado.
("1+1=3"). Este efecto se ha comprobado en
varios contaminantes que cuando estn
juntos son mucho ms dainos que la suma
de sus efectos separados.

Tcnicas para la cuantificacin de

ADN
Dot Blot o Splot Blot o Western Blot
Dot Blot es una tcnica de biologa
molecular para detectar biomolculas.
Representa una simplificacin de los
mtodos Northern blot, Southern blot o
Western blot. En un dot blot las
biomolculas para ser detectados no son
separadas por cromatografa. En cambio,

una gota que contiene la molcula para

ser detectada se aplica directamente
sobre una membrana. Esto es seguido
por la deteccin por sondas de
nucletidos (northern blot y southern
blot) o anticuerpos (para un western
blot).
La tcnica ofrece importantes ahorros en
tiempo. Sin embargo, no ofrece
informacin sobre el tamao de la
biomolcula blanco. Adems, si dos
molculas de diferentes tamaos son
detectadas, se seguir viendo como un
solo punto. Por lo tanto el dot blot slo
puede confirmar la presencia o ausencia
de una biomolcula o biomolculas que
pueden ser detectados por las sondas de
ADN o el anticuerpo.
Se utiliza para determinar la presencia y
cantidad de antgenos y de anticuerpos
especficos. En la actualidad el Western
blot es el estudio confirmatorio ms
empleado para el diagnstico del SIDA.
Se emplean antgenos virales obtenidos
por
cultivo
celular.
Mediante
electroforesis se separan las diferentes
protenas vricas por su diferente peso
molecular. Posteriormente se transfieren
a
papel
de
nitrocelulosa
y
secundariamente se incuban con el suero
problema. Los anticuerpos se detectan
aadiendo una anti-IgG humana
marcada con una enzima (peroxidasa)
que produce una banda coloreada al
aadir un sustrato. Esta tcnica identifica
anticuerpos especficos frente a las
distintas protenas del VIH. Las
protenas son separadas en primer lugar
mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida y posteriormente se
transfieren mediante la aplicacin de un
campo elctrico perpendicular al gel a
una membrana. El procedimiento es

anlogo al desarrollado por el Prof. E.

Southern ('Southern blotting') y por ello
se le denomin 'Western'.

Hay sin embargo otros mtodos de

transferir o aplicar protenas sobre una
membrana. El ms sencillo es aplicarlas
directamente en forma de una pequea
gota de una solucin concentrada sobre
la membrana. La absorcin de la gota
provoca la adhesin de la protena a la
membrana, quedando en forma de una
mancha o 'dot' (es el caso del 'dot blot'.
Existen dispositivos que facilitan la
aplicacin de las protenas directamente
a la membrana, aplicando una succin
que facilita la penetracin de la solucin,
y reciben los nombres de 'dot blot' o 'slot
blot' en funcin de que la protena quede
aplicada en forma de una gota circular o
de una lnea.

Tipos
ASO dot blot
Esta tcnica, cuyas siglas ASO vienen
del
ingls
Allele
Specific
Oligonucleotides, constituye una de las
metodologas que aplican la estrategia
dot blot, es decir, la deposicin de
muestras con las molculas de inters
sobre
una
membrana
para,

posteriormente, revelar los resultados de

presencia o ausencia de los elementos de
estudio mediante marcaje con sondas
dirigidas contra dichos elementos.

Este mtodo consiste en amplificar el

ADN de inters (por PCR) por ejemplo)
y fijarlo directamente a la membrana de
trabajo (por ejemplo con irradiacin
UV), para luego aadir oligonucletidos
de unas 20 pb especficos del alelo que
quiere detectarse. Estos oligos son
marcados
previamente
con
radiactividad, fluorforos o cualquier
otro tipo de marcaje. Tras la hibridacin,
se obtienen los resultados detectando el
marcaje utilizado.
Una aplicacin directa de este protocolo
es la deteccin de mutaciones, de manera
que se fija una fila de muestras, cada una
correspondiente a un individuo diferente,
del cual se ha amplificado la regin de
ADN que puede o no contener la
mutacin. Primeramente se hibridan las
muestras con un oligo especfico de uno
de los alelos (el silvestre o normal, por
ejemplo) y se revela el resultado. A
continuacin, se lava la sonda y se aade
una nueva, especfica del otro alelo (el
alelo mutado, por ejemplo). Aquellos
individuos que dieran positivo para las
dos hibridaciones seran heterocigotos
para la mutacin (poseen un alelo normal

y el otro mutado), mientras que aquellos

que solamente presentasen hibridacin
en uno de los casos seran homocigotos
para ese caso (para el alelo silvestre o el
mutado).

En este ejemplo el individuo 1 sera

heterocigoto para dicho gen
(presenta los dos alelos, silvestre y
mutante), el individuo 2 sera
homocigoto para el alelo silvestre o
wild type, el 3 homocigoto para el
mutante, y as sucesivamente con los
restantes.

heterocigosis y si ello determinar el

desarrollo de cierta enfermedad.

El paciente del ejemplo presenta las

dos versiones del alelo 1 (luego es
heterocigoto para dicho gen),
solamente posee la variante normal
del alelo 2, de forma que es
homocigoto para este caso (o bien
presenta una delecin en uno de los
cromosomas de dicha regin de
ADN), es homocigoto para el alelo 3
en su variante mutada, homicigoto
para la versin normal de los alelos 4
y 5, etc.

ASO dot blot inverso

Se basa en el mismo procedimiento

metodolgico que en el ASO dot
blot, con la salvedad de que son los
alelos las molculas fijadas a la
membrana, mientras que el ADN del
paciente o individuo a estudio es el
que hace las veces de sonda.
Normalmente se establecen dos filas
de muestras, cada una con distintas
variantes allicas normales o
mutantes (cada columna equivale a
un alelo en su versin normal o
mutada). Y sobre dichas muestras se
aplica el ADN marcado del individuo
a estudio. As, se averigua qu alelos
presenta en homocigosis o en

Cuantificacin del ADN mediante

espectrofotometra
El
ADN,
el
ARN,
los
oligonucletidos e incluso los
mononucletidos
pueden
cuantificarse
directamente
en
soluciones acuosas, en forma diluida
o sin diluir, midiendo la absorbancia
A (o densidad ptica, DO) de luz
ultravioleta (tambin puede hacerse
en el intervalo visible). Si la muestra
es pura, es decir, no contiene
cantidades
significativas
de
contaminantes como protenas, fenol
o
agarosa,
la
medicin
espectrofotomtrica de la irradiacin
ultravioleta absorbida por las bases
es sencilla y exacta. En este mtodo,
los tampones acuosos con escasa
concentracin inica (por ejemplo,
tampn TE) resultan idneos. La
concentracin de cidos nucleicos
suele determinarse midiendo a 260
nm y comparando con un blanco. La

interferencia de contaminantes puede

determinarse
calculando
un
cociente. Dado que las protenas
absorben a 280 nm, se emplea el
cociente A260/A280 para calcular la
pureza de los cidos nucleicos. Los
cocientes respectivos del ADN y el
ARN puros son aproximadamente de
1,8 y 2,0. Una absorcin a 230 nm
significa que la muestra est
contaminada con hidratos de
carbono,
pptidos,
fenoles,
compuestos aromticos u otras
sustancias. El cociente A260/A230
de las muestras puras es de 2,2
aproximadamente.
Cuando
la
cantidad disponible de cidos
nucleicos es escasa, puede emplearse
el mtodo de la placa de agarosa con
bromuro de etidio. Permite calcular
la cantidad de cidos nucleicos a
partir de la intensidad de la
fluorescencia emitida por el bromuro
de etidio irradiado con luz UV,
comparndola con unos patrones de
concentracin.
El espectrofotmetro se funda en la
transmisin de la luz a travs de una
solucin
para
determinar
la
concentracin de un soluto presente
en la misma. El aparato funciona
conforme a un principio sencillo: se
irradia una muestra con una
radiacin luminosa de longitud de
onda conocida y se mide la energa
luminosa transmitida con una clula
fotoelctrica situada detrs de la
muestra.

Reaccin en cadena de la Polimerasa

La invencin de la reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR) por K. Mullis y sus
colaboradores en 1985 ha revolucionado
la biologa molecular y la medicina
molecular (Saiki et al., 1985). La
reaccin en cadena de la polimerasa es
una tcnica in vitro utilizada para
amplificar enzimticamente una regin
determinada de ADN situada entre dos
regiones de ADN cuya secuencia se
conoce. Mientras que antes solo podan
obtenerse cantidades mnimas de un gen
especfico, ahora incluso un nico
ejemplar de un gen puede amplificarse
con la PCR hasta un milln de
ejemplares en tan solo unas pocas horas.
Las tcnicas de PCR se han hecho
indispensables
para
muchos
procedimientos comunes, como la
clonacin de fragmentos especficos de
ADN, la deteccin e identificacin de
genes para diagnstico y medicina legal,
y en la investigacin de modelos de
expresin
de los
genes.
Ms
recientemente, la PCR ha permitido la
investigacin de nuevos campos, como
el control de la autenticidad de los
alimentos, la presencia de ADN
modificado
genticamente
y
la
contaminacin microbiolgica. Para
comprender los principios de la PCR y
sus aplicaciones, debe atenderse en
primer lugar a la naturaleza de la

molcula del ADN, por lo que en la

seccin siguiente se describen la
estructura y la replicacin del ADN.
La PCR se basa en el mecanismo de la
replicacin in vivo del ADN: el ADN
bicatenario se desenrolla y pasa a ADN
monocatenario, se duplica y se vuelve a
enrollar. Esta tcnica consiste en ciclos
repetitivos de: desnaturalizacin del
ADN por fusin a temperatura elevada, a
fin de convertir el ADN bicatenario en
ADN monocatenario; unin

(anillamiento) de dos oligonucletidos,

utilizados como cebadores, al ADN
diana; extensin de la cadena de ADN
por adicin de nucletidos a partir de los
cebadores utilizando ADN polimerasa
como catalizador, en presencia de iones
Mg2+.

que

Agentes

parasitan.
nutricionales

metablicos.

Reacciones de autoinmunidad.
Factores asociados a la edad
materna.

Agentes de tipo fsico, como las

radiaciones alfa, beta, gamma, X,
ultravioleta, etc. Los cuales
producen rupturas o lesiones
cromosmicas.

La radiacin UV tiene un efecto letal y

mutagnico, que depende de su longitud de
onda. Ello se debe a la absorcin selectiva de
longitudes de onda por parte de ciertas
molculas biolgicas; por ejemplo:

Las protenas tienen dos picos (es

decir, mximos) de absorcin: uno a
280 nm, debido a los aminocidos
aromticos (Trp, Tyr, Phe), y otro a 230
nm, debido a los enlaces peptdicos.
El ADN y el ARN absorben a 260 nm,
debido al enlace doble entre las
posiciones 4 y 5 de las bases pricas y
pirimidnicas.

Agentes de tipo qumico, como

algunas sustancias del humo del
cigarrillo, drogas y componentes
vegetales.

Por su parte Los rayos UV no tienen

actividad ionizante, pero provocan cambios
qumicos en las molculas absorbentes, de
modo que aparecen molculas alteradas
denominadas genricamente fotoproductos.
Los fotoproductos originan la inactivacin
de macromolculas

Agentes de tipo biolgico, como

ciertos virus que afectan al
material gentico de la clula a la

Los efectos biolgicos de una exposicin a

la radiacin que ms preocupan son un
posible de dao gentico y el cncer. Los
estudios cientficos han mostrado que estos

Factores contaminantes en el ADN

efectos son poco probables y aparecen varios

aos despus de ocurrida la exposicin. En
el caso de dao gentico en seres humanos,
no se ha demostrado ningn caso de
enfermedad hereditaria causada por una
exposicin a la radiacin. Por el contrario, en
casos de cncer se ha comprobado la
aparicin de ciertos tipos de esta
enfermedad, algunos aos despus de la
irradiacin con dosis altas, superiores a los
100 rads.

La irradiacin del organismo es otra causal

de
anomalas
cromosmicas.
Experimentalmente, se han irradiado clulas
in vitro durante la etapa G1 del ciclo y las
mismas han desarrollado anomalas al llegar
a la fase M, es decir, cuando se dividen. Se
supone que estas anomalas reflejan
alteraciones
fsico-qumicas
en
los
cromosomas, que impediran su separacin
normal
durante
la
mitosis.

EFECTOS GENTICOS

ACCION UV-B en plantas

Los efectos genticos de cualquier agente

externo que acte sobre una clula son el
producto de las alteraciones (mutaciones)
que el agente pueda causar en el ADN de las
clulas reproductivas del individuo,
espermatozoides
u
vulos.
Los
descendientes de este individuo son
portadores de la mutacin y pueden sufrir las
consecuencias de sta e incluso trasmitirla a
sus propios hijos,

El ADN es particularmente sensible a

radiacin UV-B, debido a que los fotones del
tipo ultravioleta promueven transiciones PP* en las bases nitrogenadas que constituyen
los nucletidos alterando directamente el
establecimiento normal de enlaces qumicos
(95). La fototransformacin producida en el
ADN afecta principalmente a bases de
timina adyacentes, las que por efecto de la
radiacin UV-B forman estructuras cclicas
denominadas dmeros de pirimidina
ciclobutano (CPDs)

Diversos estudios experimentales que

utilizan sistemas biolgicos de prueba como
bacterias, roedores y cultivos de clulas
humanas, han demostrado que la radiacin,
las sustancias qumicas y los virus, son
posibles agentes mutagnicos, es decir,
causantes de mutaciones. Con respecto a las
mutaciones reproductivas (mutaciones que
ocurren en el vulo o el espermatozoide), la
evidencia cientfica se limita a los estudios
en roedores, en los que se han medido la
induccin de muerte fetal, las alteraciones en
el color del pelo, en el esqueleto, en la
estructura de los ojos y en los cromosomas
de la descendencia.
Los agentes conocidos capaces de producir
estos efectos son algunas sustancias
qumicas de uso poco frecuente (por
ejemplo, el metil-metano-sulfonato) y la
radiacin. La induccin de estos efectos es
tan poco probable que para poderlos
cuantificar, se requiere exponer a miles de
animales al agente mutagnico estudiado.

Bajo condiciones de radiacin UV-B no slo

se observan lesiones en el ADN del tipo
CPDs, tambin esta radiacin induce la
formacin
de
otros
fotoproductos
denominados dmeros de pirimidina
pirimidona (6-4 PPs) entre bases adyacentes
de timina y citosina y en el caso del RNA
dmeros de uracilo (97).
Del total de las lesiones provocadas por la
radiacin UV-B sobre el ADN, el 75%
corresponde a los CPDs y el resto a
fotoproductos
de
pirimidina
(6-4)
pirimidona (98). Ambos tipos de dmeros
alteran los procesos de transcripcin de
genes y de duplicacin del ADN, debido a
que tanto la Efecto de la radiacin
ultravioleta-B en plantas 67 ADN
polimerasa como la ARN polimerasa no son
capaces de leer la hebra de ADN a travs de
estos fotoproductos (99, 100). Por tal
motivo, la eliminacin de los CPDs y 6-4
PPs resulta esencial para la supervivencia de

las distintas especies afectadas por este tipo

de dao (99)

Niveles de plomo y dao en el ADN en

nios con trastornos del espectro autista
Los trastornos del espectro autista (TEA) se
consideran una familia de alteraciones del
neurodesarrollo
caracterizadas
por
dificultades en la comunicacin, en la
interaccin social, en la atencin, en los
trastornos cognitivos y en los defectos en el
aprendizaje, en la investigacin se tomaron
15 nios (11 varones y 4 nias) entre 4 y 11
aos de edad que sufran de un trastorno
espectro autista primario procedentes de la
consulta de psiquiatra del hospital
Peditrico del Cerro en la Habana, Cuba.
Fue evaluado el coeficiente de inteligencia
de acorde con la prueba Terman-Merrill; los
nios fueron clasificados segn el grado de
severidad, en dos grupos: trastornos ligeros
y moderados/severos. Los niveles de plomo
fueron determinados en 1mL de sangre total
por el mtodo de espectrofotometra de
absorcin atmica con horno de grafito por
correcion Zeeman.
El dao del ADN fue estimado por el ensayo
cometa (electroforesis alcalina de clulas
individuales de leucocitos de sangre
perifrica). Aislando linfocitos en una
muestra de sangre total (control negativo),
que se utiliz en una corrida electrofortica
junto a los linfocitos de los pacientes.
En los resultados obtenidos no se mostr
diferencia significativa de los niveles de
plomo entre los dos grupos. El dao del
ADN fue mayor en los pacientes autistas en
relacin con el grupo control, cuya
diferencia fue significativa (p < 0.05 ),
cuando comparamos los grupos teniendo en
cuenta la severidad del retardo mental. Los
pacientes con trastorno moderado/severo
mostraron un dao en el ADN

significativamente superior a los que

mostraron un trastorno ligero o del grupo de
control. Con esto se confirmo la presencia de
dao del ADN en pacientes con trastorno del
espectro autista, lo cual suguiere que esto
pudiera ser un factor que se relaciona con la
severidad del retardo mental en los
enfermos.
CONCLUSIONES
El ADN es particularmente sensible a
radiacin UV-B, debido a que los fotones del
tipo ultravioleta promueven transiciones PP* en las bases nitrogenadas que
constituyen los nucletidos alterando
directamente el establecimiento normal de
enlaces
qumicos
(95).
La
fototransformacin producida en el ADN
afecta principalmente a bases de timina
adyacentes, las que por efecto de la
radiacin UV-B forman estructuras cclicas
denominadas dmeros de pirimidina
ciclobutano (CPDs)
Uno de las razones por la que se ocasiona
contaminacin en el ADN, tiene que ver con
las tcnicas de laboratorio empleadas;
haciendo hincapi en conocimiento previo
de algunas tcnicas de laboratorio. Por
ejemplo tener condiciones de esterilidad
mayores de las habituales en un laboratorio
a la hora de aplicar tcnicas de biologa
molecular; como Northern Blot y southern
Blot. Ya que se presentan agentes
contaminantes en el ambiente o
endgenos, como ARNasas.
La mutanognesis es un proceso en el cual
se evidencia la formacin de aductos, estos
aductos son compuestos premutagenicos
que dependiendo de la cantidad y
capacidad que tenga, puede o no provocar
una mutacin en gran medida, y
dependiendo del organismo puede
ocasionar cambios tanto fsicos como
metablicos.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
-Niveles de plomo y dao en el ADN en
nios con trastornos del espectro autista
Artculo consultado el 111 de mayo de 2015
desde:file:///C:/Users/vega/Downloads/co
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-Efectos De Los Contaminantes Txicos.
Consultado el 10 de abril del 2015 desde:
http://www4.tecnun.es/asignaturas/Ecologia
/Hipertexto/09ProdQui/140EfToxic.html

-Jos Bello Gutirrez, Adela Lpez de

Cerain Salsamendi (2007) fundamento
de ciencia toxicolgica. EDITORIAL
REVERTE.
-usubel FM, Brent R, Kingston RE,
Moore DD, Seidman JG, Smith JA,
Struhl K (eds) (2005): Current
Protocols in Molecular Biology. Vols 1
a 4. New York: Greene & John Wiley
(New York). Manual de protocolos. La
nueva Biblia del Bilogo Molecular
actualizada trimestralmente
-Chen, W, Kuo T (1993): A simple and
rapid method for the preparation of
gramnegative bacterial genomic DNA.
Nucleic Acids Res 21: 2260.
Biologa y ciencias de la tierra.
Consultado el 10 de mayo del 2015
desde:https://cienciadelatierra.wordpres
s.com/especiales/virus/capsides-viricas/