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PBS (Tampn fosfato salino): Solucin acuosa y salina que contiene cloruro de sodio, fosfato
de sodio, cloruro de potasio y fosfato de potasio. Se usa principalmente para mantener un
pH estableSDS: Dodecil sulfato de sodio. Detergente de carga negativa. Se une a las protenas y les
confiere dicha carga. Esta unin se da en una proporcin constante, cada gramo de protena
se une a 1,4 g de SDS, sea cual sea la protena.
Anticuerpo primario: Se une y marca la protena de
inters.
Anticuerpo secundario: Determinan si el anticuerpo primario se uni a la protena de
inters, los hay de diversos tipos segn como los queramos o podamos detectar luego:
Ligados a enzimas (veremos un cambio de color), de marcado radiactivo, de marcada
fluorescente (emitir fluorescencia..)
Anticuerpo monoclonal: Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos idnticos, porque
son producidos por un solo tipo de clula del sistema inmune. Se unen a un eptopo en
partcular, una nica regin del antgeno.
Anticuerpo policlonal: Son anticuerpos derivados de diferentes tipos de linfocitos. Los
anticuerpos policlonales son una mezcla de inmunoglobulinas secretados en contra de un
antgeno concreto.
Cmo se prepara y realiza un Western Blot, y en que se basa?
Paso 1. Preparacin de la muestra.
Lo primero de todo, como es obvio, es disponer de una muestra, ya sean muestras tomadas
de un tejido (cerebro de rata, por ejemplo), o de un cultivo celular directamente. Debemos
asegurarnos que en dicha muestra tenemos una cantidad de protenas suficientemente alta
como para poder trabajar.
Trabajamos siempre en eppendorfs!
Debemos coger la muestra, y lo primero que se hace es introducirla en un Buffer de
Extraccin. Cuando buscamos purificar y estudiar proteinas, lo primero que se debe hacer es
romper las clulas , y extraer de el la fraccin de proteina. Todo esto con el buffer de
extraccin. Es un proceso importante, ya que los mtodos que se usan, tanto fsicos como
Despus de tener nuestro pellet (En los procesos de centrifugado, se denomina pellet al
material sedimentado), debemos, con sumo cuidado para no afectar al pellet, vaciar el
eppendorf, sin brusquedades, en un papel limpio y dejarlo abierto para que seque bien, no
debe quedar nada del buffer de extraccin.
Paso 2. Cuantificacin de protenas
Porqu cuantificar protenas? Es muy simple, cuando ms adelante debamos cargar
protenas, para que los resultados tengan algo de sentido, tendremos que saber cuanta
protena tenemos, para cargar lo mismo y que los resultados no dependan de cuanta protena
hemos cargado, si no de las caractersticas de la protena cargada.
Cmo se hace? Por norma general se usa BCA Protein Assay Kit , un kit que ya viene
preparado (y que como todos los kits, no sabes que llevan para que no lo puedas preparar y
te veas obligado a comprarlo a la casa).
Como este paso con el kit es siempre igual (que yo sepa), en este caso si os voy a poner un
protocolo, que est aqu.
Hacemos todas esas diluciones entre en la curva estndar que tiene que tener vuestro
laboratorio, donde veris que longitud de onda corresponde a que cantidad de BCA, y
extrapolando con vuestra longitud de onda, y teniendo en cuenta las diluciones que habis
hecho, sabremos que cantidad de protena tenemos.
As ya sabemos la cantidad de protena que tenemos en nuestras muestras, y jugando con
disoluciones, podremos cargar la cantidad deseada de protena siempre que queramos.
Paso 3. Electroforesis en gel.
La funcin de la electroforesis es separar, basndose en uno o varios criterios, las protenas.
Estos criterios suelen ser: peso molecular, punto isoelctrico, y carga elctrica. Si solo se usa
un criterio, estamos ante un gel en 1 dimensin, si por ejemplo, se combinan en el mismo
gel, el peso molecular y el punto isoelctrico, estamos ante un gel bidimensional.
En los sistemas discontnuos el primer gel, que es el Running, asegura la migracin de todas
las protenas en el frente de migracin, provocndose la acumulacin de todas las que se han
cargado en el pocillo. La separacin realmente comienza a partir del momento en el que el
frente de migracin alcanza la frontera del segundo gel, el stacking. El gel que queda al final
en la parte superior (stacking), es de mayor poro (menor porcentaje de
acrilamida+bisacrilamida) y tiene un pH ms cido que el segundo gel que es el
que realmente separa las protenas. Como ya hemos dicho este sistema es especialmente
adecuado para analizar muestras diluidas sin perder resolucin.
Para la realizacin de la electroforesis, tras preparar los geles de poliacrilamida, al
porcentaje que necesitis, que ser el medio donde colocaremos la protena de nuestra
muestra, debemos colocarlos en la unidad de electroforesis, que si es la primera vez que la
preparais, es as:
Para solo un gel:
En el primer pocillo (aunque podis hacerlo donde queris), aadid un marcador de peso
molecular, para despus saber el peso molecular de vuestras muestras, observando el
marcador y vuestra muestra, y la distancia que han recorrido tras la electroforesis.
Se conectan los electrodos a la cubeta de electroforesis, y a la fuente de alimentacin, y
conectamos la corriente elctrica, recordad antes de todo que los electrodos estn
correctamente colocados, cada color con su color, rojo con rojo y negro con negro, y
recordad que el voltaje es variable dependiendo del espesor del gel, de la cantidad de
protenapero que nunca debe bajar de 100V, y se deja correr hasta que el frente azul, que
son nuestras protenas, llegan a la parte inferior del gel, y nada ms sacarlo, recordad
recortar una esquina del gel para saber en que posicin estaba orientado, y as sabremos que
muestra hay en cada pocillo, porqueantes lo habis apuntado! oms os vale tener buena
memoria.
Recordad hacerlo en la campana, que el actico te deja KO! Y tambin, recordad que
debis echar el metanol y el actico en los 925 mL de agua, y no al revs, por motivos
armamentsticosya sabisBUM!
Pasado el tiempo necesario para la destincin, limpiamos el gel con agua destilada, y si es
necesario, ya podemos conservar el gel a 4C durante un largo periodo de tiempo, si fuese
necesario esperar antes de proseguir con el siguiente paso, la transferencia.
Quedar algo as:
Paso 5. Transferencia.
Paso que permite que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos.
Simplemente, los resultados son mucho mejores, y desde siempre se ha hecho as, se se
transfiere a las protenas desde el gel de poliacrilamida, a una membrana que,
normalmente, es de nitrocelulosa o PVDF. En las membranas de nitrocelulosa, las protenas
interaccionan con esta mediante enlaces no covalentes de naturaleza hidrfoba. Por otro
lado, en las membranas de PVDF, resulta que el fluoruro de polivinilideno, inerte
qumicamente, es afn a las protenas, mediante enlaces hidrofbicos y de dipolos membrana
protena.
Las dos opciones son igual de vlidas, pero debis saber que las de PVDF son ms caras, por
el hecho de ser ms resistentes, no son tan fciles de quebrar como las de nitrocelulosa, y
pueden someterse a varias pruebas consecutivas.
La transferencia puede hacerse mediante tres mtodos: Difusin, vaco, o
electrotransferencia, este ltimo es el ms usado con diferencia, y el que mejores resultados
ofrece, pero no viene mal explicar los otros mtodos y as sacamos algo de Historia del
Western Blot.
Transferencia por difusin: Su propio nombre lo indica, simplemente se ponen en contacto
el gel y la membrana, y por simple difusin, se transfiere. Se ponen en contacto entre s y
con un tampn, que asciende por capilaridad hacia el papel de filtro, que se habr colocado
encima de la membrana, y mientras lo hace, arrastrara a las protenas hasta la membrana,
donde quedarn retenidas.
La cantidad de protena transferida no es muy alta, aunque es funcional, pero est siendo
remplazado por los otros mtodos, aunque una modificacin est dndole de nuevo algo de
uso, ya que permite a partir de un mismo gel, transferir el contenido a varias membranas,
pero esto solo sirve si no hace falta cuantificar protenas, y ya os digo yo, que esto no suele
ser lo comn.
Electrotransferencia
Electrotransferencia: La que vais a usar, con diferencia la ms usada y la ms recomendada.
Al igual que durante la realizacin de la electroforesis, se usa una corriente elctrica y un
tampn (Buffer de transferencia), que rellena la cubeta de electrotransferencia, como
resultado se transfieren las protenas. En este caso, se usan los siguientes elementos, que se
colocan partiendo desde el polo negativo (ctodo, rojo!) al positivo (nodo, azul!):
Esponja
Gel
Membrana
Esponja
A este conjunto se le conoce como Sandwich, y una vez montado, debis meterlo en la
cubeta con el negro del sandwich (no la parte torrada del sandwich que trais de casa),
orientado hacia el polo negro de la cubeta.
Al conectar las corriente, a una determinada potencia que depende de diversos factores (que
no debe bajar de 100V), las protenas se desplazarn hacia el polo positivo, y quedarn
retenidas en la membrana.
Os informo de que hay dos tipos de electrotransferencia:
Hmeda: La que yo he usado todas las veces que he hecho electrotransferencia, as que ante
las dudas ya sabis. Para que podis ver la diferencia que hay entre los dos mtodos, aunque
Tris base 25 mM
Glicina 192 mM
pH 8,2
Tris base 50 mM
Glicina 40 mM
0,04% de SDS (p/v)
20% de metanol.
Quedar una copia del gel, pero en la membrana, algo as (como vis, ya no es gel):
Paso 6. Bloqueo.
Con este paso simplemente se trata de bloquear la unin de protenas a la membrana, que
puedan unirse a esta en los lugares que hayan quedado libres, posteriormente a la
transferencia. Sin este paso, el anticuerpo, que es de naturaleza proteica, podra unirse en
esos huecos libres (recordemos que la membrana es afn a las protenas), y dificultar la
distincin del complejo antgeno-anticuerpo que se trata de obtener.
Para bloquear, se suele usar una solucin proteca, que incluye albmina de suero bovino
(BSA), leche en polvo o casena, y algo de detergente, como Tween 20. Esta solucin proteca
rellena los huecos libres, y como el anticuerpo que se usar es especfico, no se unir en
estos huecos,ya que no habr en ellos la proteina que el anticuerpo busca, con lo cual no nos
molestarn para los siguientes pasos.
Paso 7. Deteccin.
Se trata de buscar en la membrana una determinada protena, y por este mismo motivo se
usa un anticuerpo especfico, unido a una enzima, que si encuentra su sustrato ( la protena
indicada, o ms bien su antgeno), se producir una reaccin y podremos observar a la
protena por diversos mtodos. Hay muchos procesos que llevan a una deteccin, voy a
mencionar el ms famoso o conocido, o que directamenteutilizo yo y considero ms moln.
Deteccin en dos pasos: El de toda la vida! Se tiene que usar un anticuerpo primario y un
anticuerpo secundario.
Anticuerpo primario
El que se une a la protena buscada. El anticuerpo se consigue inoculando la protena a un
animal, que puede ser casi cualquiera de los que vemos en un zoo, conejos, monos, o,
mucho ms ecolgico, procedente de un cultivo celular. Esto desencadena en el animal una
respuesta inmune, produciendo as un anticuerpo, primario, porque reconoce la protena.
Cogemos la membrana que habamos bloqueado y se deja en agitacin moderada junto a una
disolucin, pequeisisisisisisima, de anticuerpo primario, que solo tiene desde 0,5 a 5 ug/ml,
y se usan microlitros. Los anticuerpos se guardan en un congelador a -20C, por norma
general, y son caros, as que ms vale que no os vean malgastando alguno. Cogemos el
mismo tupper que tenamos, previo lavado, y juntamos la membrana junto a la ya
mencionado disolucin, que lleva cloruro de sodio, algo de detergente (Tween 20), y en
ocasiones BSA o otras protenas. Se deja incubando desde media hora hasta Overnight,
es decir, durante toda la noche.
Lavado del anticuerpo primario.
Para lavar la membrana y dejarla limpia de anticuerpo primario, se puede usar TBS, 2
lavados de 30 segundos. El TBS ( o Buffer salino de Tris), se prepara de forma muy simple
con:
50mM Tris.
150 mM NaCl
Ajustar pH con HCl hasta 7,6.
La forma ms simple de prepararlo es usar unas tabletas ya preparadas de TBS, que vienen
formuladas para diluirlas en 500 ml de agua desionizada.
Puede usarse tambin T-TBS, que no esms que TBS al que se le aade Tween 20, un
detergente, que ofrece mejores resultado. Se prepara:
Cabe indicar que tambin venden pastillas ya preparadas con esta formulacin para ser
diluidas en 500 mL de agua desionizada.
Anticuerpo secundario.
Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone
al anticuerpo secundario. ste reconoce de forma especfica una regin concreta del
anticuerpo primario, a la cual se une, y estos secundarios suelen estar marcados para ser
detectables por diversos mtodos (unin a biotina, a una enzima reporter como la
fosfatasa alcalina, etc.). Varios de estos anticuerpos se unirn a cada anticuerpo primario,
por lo que acaban resultando en una amplificacin del anticuerpo primario, y no solo eso, si
no que ahora podemos detectar al anticuerpo primario. Un anticuerpo secundario antiratn es aquel capaz de reconocer casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de
ratones. Y as con el resto de anticuerpos secundarios anti-(inserte animal), anti-cabra,
anti-conejo cabe indicar que pueden emplearse tambin protenas y no anticuerpos,
como las protenas A y G.
Lavado del anticuerpo secundario.
Para lavar la membrana y dejarla limpia de anticuerpo secundario, pueden darse 3 lavados
de 3 minutos de T-TBS, que no es ms que TBS al que se le ha aadido Tween 20. (explicada
su preparacin arriba)
Paso 8. Anlisis
Simplemente, dependiendo del tipo de anticuerpo secundario que hayamos usado, lo
analizaremos de una determinada forma. Os recomiendo ver el glosario de nuevo:
Anlisis colorimtrico
Considero que el ms sencillo. La deteccin colorimtrica depende de la incubacin del
Western blot con un sustrato unido al anticuerpo secundario que es una enzima reporter ,
(una peroxidasa, por ejemplo) , producindose una reaccin que acaba en un cambio de
Paso 9. Resultado
Resultado del Western blot: una membrana con las protenas separadas en la electroforesis
unidas, de las que slo se disciernen aquellas contra las se ha aadido un anticuerpo.
Despus de esto podemos escanearlas y estudiarlas de mil maneras diferentes, que no son
motivo de esta entrada. (vase la x que marca la orientacin)
Por reaccin colorimtrica:
Por fluorescencia: