Partie II : GENETIQUE MOLECULAIRE

I. ADN : MATERIEL GENETIQUE DE LA CELLULE

L’ADN est une macromolécule qui est le constituant essentiel des chromosomes. Il
représente l’information génétique qui englobe les gènes. Un gène est un segment d’ADN
qui contient l’information nécessaire pour la synthèse d’un produit biologique fonctionnel,
une protéine ou un ARN. Donc, la fonction unique de l’ADN est le stockage et la
transmission de l’information génétique.

I.1. La découverte de l’ADN

Une expérience réalisée par Avery McLeod et McCarty en 1944 a apporté la preuve
directe que l’ADN est le porteur de l’information génétique de la cellule. Cette expérience
est partagée en trois étapes :
a). la première étape consiste à injecter une souris avec une souche virulente S d’une
bactérie Streptococcus pneumoniae ce qui a causé sa mort.
b). la deuxième étape consiste à injecter une autre souris avec une souche non virulente
R de cette même bactérie. Cette souris a survécu.
c). la troisième étape est de mélanger la souche non-virulente vivante avec une souche
virulente tuée par la chaleur et d’injecter ce mélange à une souris. Le résultat est la mort
de cette souris. La conclusion de cette expérience est qu’il y a un agent transformant qui
a provoqué la conversion de la souche non-virulente en une souche virulente. Les
chercheurs ont extrait l’ADN de la souche virulente tuée par la chaleur, ont éliminé le plus
de protéines possibles et l’ont ajouté aux bactéries non-virulentes. Ces dernières ont été
transformées de façon permanente en des bactéries virulentes. L’agent transformant est
donc l’ADN. Aucune des autres fractions cellulaires, protéines, lipides ou glucides, n’a pu
aboutir à cette transformation.
Une deuxième expérience importante a donné la preuve définitive que l’ADN porte
l’information génétique. En 1952, Hershey et Chase ont utilisé du phosphore radioactif
P32 et du soufre radioactif S35 pour démontrer que lorsque le bactériophage T2 infecte son
hôte E. coli, c’est l’ADN contenant le phosphore et non les protéines de la paroi cellulaire
de T2 contenant le soufre qui pénètre dans la cellule hôte et fournit l’information
génétique pour la réplication du virus.

93
I.2. La composition chimique de l’ADN
L’ADN est formé de plusieurs unités qui sont les nucléotides. Chaque nucléotide est
formé de 3 composés caractéristiques a) une base azotée, b) un pentose, le
désoxyribose et c) un groupe phosphate. La molécule sans le phosphate est appelée un
nucléoside. Les bases sont des dérivés de composés appelés des purines et des
pyrimidines. Les purines sont l’adénine (A) et la guanine (G) et les pyrimidines sont la
cytosine (C) et la thymine (T) (figure 26).

NH 2 O NH 2 O

N N
N NH N NH

N N
N H N NH 2 N O
H N O
H H

Adenine Guanine Cytosine Thymine

PURINES PYRIMIDINES
Figure 26: Les bases de l’ADN.

La liaison entre une base et le sucre est une liaison covalente entre le N-1 de la
pyrimidine ou le N-9 de la purine et le C1’ du pentose. Ce type de liaison est appelée N-
glycosidique. Le phosphate est estérifié au carbone 5’ par une liaison phosphodiester
(figure 27).
N H 2

N
N

N
O N

-O P O
O

O - H H

H H
O H H

Nucléoside(sucre+base)
Nucléotide (sucre+base+ phosphate)

Figure 27 : L’unité structurale de l’ADN.

94
Ainsi, chaque chaîne d’ADN a une extrémité 5’ et une autre extrémité 3’ et donc une
orientation de 5’ vers 3’ (figure 28). L’axe principal de la chaîne appelé aussi «le squelette
carboné» est formé de résidus de phosphates et de pentoses alternés. Ils sont
hydrophiles car les groupes hydrogènes des pentoses forment des liaisons hydrogènes
avec l ‘eau et les phosphates sont négativement chargés à un pH de 7. Ces charges sont
neutralisées par les interactions avec des charges positives portées par les protéines, les
métaux et les polyamines. Les groupes attachés à cet axe principal à des intervals
réguliers sont les bases azotées. Un acide nucléique court (contenant 50 nucléotides ou
moins) est appelé un oligonucléotide. Celui qui est plus long est appelé un
polynucléotide.

e x tré m ité 5 '

O -

-O P O

A
O

C H 2
O
H H

H H
O H

O P O -

O G

C H 2
O
H H

H H
O H

O P O -

O T

C H 2
O
H H

H H
O H H

e x tré m ité 3 '

Figure 28: Chaîne d’ADN.

Les purines et les pyrimidines sont des bases faibles. Leurs propriétés chimiques peuvent
affecter la structure et éventuellement la fonction des acides nucléiques.

95
Les purines et les pyrimidines de l’ADN sont des molécules hautement conjuguées, une
propriété très importante pour la structure, la distribution électronique, et l’absorption de
lumière des acides nucléiques. La résonance des atomes dans la structure cyclique des
bases donne à la plupart des liaisons un caractère de double-liaison partielle. Ces
dernières peuvent changer de place ce qui fait que les bases peuvent avoir des formes
tautomériques. Certaines formes tautomériques prédominent à un pH de 7. Le résultat de
la résonance est que toutes les bases absorbent les rayons ultra-violets (UV) à des
longueurs d’onde de 260nm.
Les purines et les pyrimidines sont hydrophobes et relativement insolubles dans l’eau au
pH neutre de la cellule. A des pH acides et basiques, les bases deviennent chargées et
leur solubilité dans l’eau augmente. L’entassement des bases dans un acide nucléique
implique la combinaison des forces de Van der Waals qui sont très importantes dans la
stabilité de la structure tri-dimensionnelle des acides nucléiques.

I.3. Propriétés physiques de l’ADN

L’ADN peut subir une fusion réversible si on le chauffe à 98°C ; la chaleur rompt les
liaisons hydrogènes entre les bases, ce qui se manifeste par la séparation des deux
brins. La fusion est subite à une certaine température appelée température de fusion
(Tm) définie par la température à laquelle la moitié de la structure hélicoïdale est perdue.
Le fait que la fusion soit subite montre que la structure de l’ADN est hautement
coopérative.
La fusion de l’ADN est aussi accompagnée par un hyperchromisme qui est une
augmentation de l’absorbance en allant d’une structure double à une structure simple. Si
l’ADN est riche en GC, Tm augmente. Si par contre il est riche en AT Tm diminue.

Les lois de Chargaff

En 1950, Erwin Chargaff a étudié la quantité de bases dans une large sélection d’ADN
provenant d’organismes différents. Ces études ont mené aux déductions suivantes
appelées les lois de Chargaff :
1). La quantité totale des pyrimidines (T+C) est toujours égale à la quantité totale des
purines (A+G).
2). La quantité de T est toujours égale à la quantité de A, et la quantité de C est toujours
égale à la quantité de G. Cependant, la quantité de A+T n’est pas toujours égale à G+C.
Ce rapport est différent selon les organismes.

96
I.4. La structure des acides nucléiques
La structure de l’ADN a été mise en évidence en 1953 par James Watson et Francis
Crick. Cette découverte a été faite après une série de recherches sur l’ADN, exploitant
ainsi les résultats obtenus auparavant concernant la composition des bases de Chargaff
et les résultats de la diffraction aux rayons X de Wilkins. A partir de ces données et
utilisant leur propres constatations, Watson et Crick élaborèrent le concept de la double
hélice d’ADN :
1). Deux chaînes polynucléotidiques de directions opposées et qui tournent autour d’un
axe commun pour former une double hélice droitière.
2). Les purines et les pyrimidines sont à l’intérieur de l’hélice, alors que les unités de
phosphate et de sucre sont à l’extérieur, formant ainsi le squelette carboné de la
molécule d’ADN.
3). Le diamètre de l’ADN est de 20A°. Les bases adjacentes sont séparées par 3.4 A° au
long de l’axe de l’hélice et reliées par une rotation de 36°C. La structure hélicoïdale est
répétée tous les 10 résidus ou à des intervalles de 34 A°, représentant le pas de l’hélice.
4). L’adénine est appariée à la thymine par deux liaisons hydrogènes alors que la
guanine est appariée à la cytosine par trois liaisons hydrogènes. La double hélice est
aussi stabilisée par des interactions entre les bases entassées sur la même chaine .Cet
appariement de bases est fortement soutenu par les études préliminaires de Chargaff.
5). La séquence de bases d’une chaîne polynucléotidique n’est pas restreinte. Elle porte
l’information génétique.

Figure 29 : Structure hélicoïdale de la double hélice d’ADN.

97
I.5. Les différentes formes tri-dimensionnelles de l’ADN
Le modèle proposé par Watson et Crick est celui de l’ADN B. Il a été déduit sur la base
de la diffraction aux rayons X de fibres d’ADN. D’autres informations structurales peuvent
être obtenues d’analyses de rayons X sur des cristaux d’ADN. Ces dernières ont révélé
que l’ADN peut avoir beaucoup plus de diversité et de variabilité qu’envisagé avant.

L’analyse par Dickerson d’un dodécamère d’ADN montre que celui-ci ressemble
beaucoup à l’ADN B de Watson et Crick à l’exception du fait qu’il présente des variations
locales. Celles ci sont dues à des angles de rotation entre les bases qui varient de 28 à
42 degré au lieu d’un angle de rotation constant de 36° dans le modèle de Watson et
Crick. L’autre variation est due au phénomène de «propeller twist» qui est une rotation
opposée des deux bases sur le long de leur axe. Ceci augmente l’entassement des
bases de chaque chaîne. Une autre source de variabilité est le «tilting» qui représente
l’enroulement des pairs de base relativement à leurs voisines. Ces variations locales de
la double hélice dépendent de la séquence de bases. Une autre caractéristique de l’ADN
B est qu’il peut être plié lentement en un arc ou superenroulé sans changer la structure
locale de l’ADN. Cette déformation facile est très importante biologiquement parce qu’elle
permet la formation de l’ADN circulaire et permet à l’ADN de s’enrouler autour des
protéines. Cela permet aussi la condensation de l’ADN pour qu’il rentre dans un volume
restreint telle une cellule. L’ADN peut être aussi plié à certains sites tels une séquence de
quatre adénines ou l’attachement d’une protéine.

Une autre caractéristique est la présence de sillons majeur et mineur. Ils sont formés car
les liaisons glycosidiques d’une paire de bases ne sont pas diamétralement opposées. La
largeur du sillon majeur fait qu’il est plus accessible aux interactions avec les protéines
qui reconnaissent des séquences spécifiques d’ADN.

I.5.1. La forme de l’ADN-A

L’ADN-A est formé quand l’humidité relative tombe jusqu’à 75%. Il est plus large et plus
court que l’ADN-B et ses paires de bases sont courbées par rapport à l’axe de l’hélice. Le
sillon mineur presque disparaît. Les groupes phosphates dans l’ADN-A s’attachent à
moins de molécules d’eau que les phosphates dans l’ADN-B (figure 4 b).

98
I.5.2. La forme de l’ADN-Z
L’ADN-Z a été découvert quand des cristaux d’une chaîne courte d’ADN (un
hexanucléotide) avec des cytosines et des guanines alternées (CGCGCG…) ont été
analysés par diffraction aux rayons X par Rich et ses collaborateurs. Ils ont trouvé que
cette double hélice est gauchère contrairement aux doubles hélices d’ADN A et B qui
sont droitières. Une autre différence est que les phosphates sont en forme de zigzag du
fait que l’unité répétée est un dinucléotide au lieu d’un mononucléotide, d’où l’appellation
ADN-Z (figure 4c). La troisième différence réside dans le fait que l’ADN-Z contient un
sillon profond.
Il a été constaté que la structure Z peut exister à l’intérieur de l’ADN-B. La conversion de
la forme B en Z peut se faire en tournant les pairs de base de 180° et en tournant les
sucres des résidus de purine. Cependant, on notera que la formation de l’ADN Z est
thermo dynamiquement défavorable à cause de la répulsion entre les groupes
phosphates qui sont plus rapprochés dans la forme Z que dans la forme B. La transition
vers la forme Z est cependant favorisée par la méthylation de la cytosine en C-5, une
modification très connue chez les eucaryotes. La comparaison entre les trois formes
d’ADN est résumée dans le tableau I :

Tableau 10 : Caractéristiques des différentes formes d’ADN

Geometry attribu A-form B-form Z-form

Helix sense right-handed right-handed left-handed
Repeating unit 1 bp 1 bp 2 bp
Rotation/bp 33.6° 35.9° 60°/2
Mean bp/turn 10.7 10.0 12
Inclination of bp to a+19° -1.2° -9°
Rise/bp along axis 0.23 nm 0.332 nm 0.38 nm
Pitch/turn of helix 2.46 nm 3.32 nm 4.56 nm
Mean propeller twist+18° +16° 0°
C: anti,
Glycosyl angle anti anti
G: syn
C: C2'-endo,
Sugar pucker C3'-endo C2'-endo
G: C2'-exo
Diameter 2.6 nm 2.0 nm 1.8 nm

99
 (a) (b) (c)
Figure 30: les trois formes de l’ADN : (a) forme A, (b) forme B et (c) forme Z.

I.6. La chromatine: organisation fonctionnelle du génome

I.6.1. Introduction
Dans les cellules eucaryotes, le matériel génétique est organisé en une structure
complexe constituée d'ADN et de protéines et il est localisé dans un compartiment
spécialisé, le noyau. Cette structure a été baptisée chromatine. Environ deux mètres
d'ADN dans chaque cellule doivent être contenus dans un noyau de quelques μm de
diamètre. En plus de cet énorme degré de compaction, l'ADN doit être rapidement
accessible afin de permettre son interaction avec les machineries protéiques régulant les
fonctions de la chromatine: la réplication, la réparation et la recombinaison. Ainsi
l'organisation dynamique de la structure chromatinienne influence, potentiellement, toutes
les fonctions du génome.

L'unité fondamentale de la chromatine est appelée le nucléosome qui est composé

d'ADN et d'histones. Il constitue le premier niveau de compaction de l'ADN dans le
noyau. Cette structure est ensuite régulièrement répétée pour former le nucléofilament
qui peut, lui-même, adopter des niveaux d'organisation plus compacts (Figs 1 et 3), le
niveau de condensation le plus élevé étant atteint au sein du chromosome métaphasique.
Au sein du noyau interphasique, la chromatine est organisée en territoires fonctionnels.
La chromatine a été divisée en: euchromatine et hétérochromatine.

100
L'hétérochromatine a été définie comme une structure qui ne change pas d'état de
condensation au cours du cycle cellulaire tandis que l'euchromatine apparaît
décondensée pendant l'interphase. L’euchromatine se colorie de façon légère alors que
l’hétérochromatine se colore de façon plus dense parce qu’elle est plus condensée que
l’euchromatine. La plupart du génome est formé d’euchromatine dans laquelle la plupart
des gènes sont actifs . L'hétérochromatine est localisée principalement en périphérie du
noyau et du nucléole tandis que l'euchromatine est répartie à l'intérieur du nucléoplasme.
On distingue:
L'hétérochromatine constitutive qui contient peu de gènes, formée principalement de
séquences répétées et dont les plus grandes régions sont situées à proximité des
centromères et des télomères, de
L’hétérochromatine facultative qui contient des régions codantes pouvant adopter les
caractéristiques structurale et fonctionnelle de l'hétérochromatine, comme le
chromosome X inactif chez la femelle des mammifères.
Dans cette revue, nous rappèlerons les composants de la chromatine et nous
présenterons les différents niveaux d'organisation de la chromatine, en partant du niveau
du nucléosome jusqu'à celui de l'organisation en domaines dans le noyau. Nous
discuterons ensuite comment les variations dans la composition fondamentale de la
chromatine peuvent influencer son activité et comment les facteurs capables de faciliter la
formation de ces structures jouent un rôle critique pour transmettre des caractères de
diversité dans la structure chromatinienne dynamique. Finalement, nous exposerons
comment la chromatine influence l'organisation du génome à l'échelle du noyau.

I.6.2. Le nucléosome
La digestion partielle de l'ADN organisé en chromatine génère des fragments de 180 à
200 paires de bases. La régularité de cette structure a été ensuite confirmée par analyse
en microscopie électronique révélant une chromatine constituée de particules
régulièrement espacées, dont l'aspect rappelle celui d'un "collier de perles". La
stochiométrie ADN-histones est de 1/1 en masse.
Le nucléosome est l'unité fondamentale de la chromatine. Il est composé d’: une particule
cœur et d’une région de liaison (ou région internucléosomale) qui relie les particules
coeurs adjacentes (Figure 31).

101
Figure 31. Eléments de définition du nucléosome et du chromatosome.

La particule cœur, dont la structure est très conservée parmi les espèces, est composée
de 146 paires de bases d'ADN enroulées selon environ 1,7 tour autour d'un octamère
protéique comprenant deux exemplaires de chacune des histones H3, H4, H2A et H2B.
La longueur de la région d'ADN internucléosomale varie selon l'espèce et le type
cellulaire. C'est au niveau de cette région que les histones internucléosomales également
variables, sont incorporées. Ainsi, la longueur d'ADN caractéristique d'un nucléosome
peut varier selon les espèces entre 160 et 241 paires de bases. Des analyses ont révélé
d'une part, l'enroulement de l'ADN autour de l'octamère d'histones et d'autre part, les
interactions entre histones/ADN et histones/histones par leur "motif histone fold" selon
une configuration en poignée de mains.

I.6.2.1. Les histones

A. Les histones de la particule coeur
Les histones de la particule coeur, H3, H4, H2A et H2B sont de petites protéines
basiques très conservées au cours de l'évolution (Figure 32). La région la plus conservée
de ces histones est leur domaine central structuré composé du "motif histone fold" qui
comprend trois hélices séparées par deux boucles. En revanche, les extrémités N-
terminales de ces histones sont plus variables et sont dépourvues de structure
secondaire. Ces extrémités sont particulièrement riches en résidus lysine et arginine et
donc très basiques. Elles sont la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles
pouvant affecter leurs charges mais aussi l'accessibilité à l'ADN et les interactions
protéines/protéines avec le nucléosome.

102
Il est important de noter que d'autres protéines impliquées dans les interactions avec
l'ADN présentent ce type de "motif histone fold".

B. Les histones internucléosomales

Les histones internucléosomales sont formées de H1, les protéines qui s'associent à la
région d'ADN de liaison entre deux nucléosomes. Contrairement aux histones de la
particule cœur, elles sont peu conservées parmi les espèces. Chez les eucaryotes
supérieurs, elles sont composées de trois domaines: un domaine globulaire central non
polaire très conservé pendant l’évolution, essentiel pour les interactions avec l'ADN, et
deux extrémités N- et C- terminales non structurées, hautement basiques, et soumises à
des modifications post-traductionnelles. Dans certains tissus, comme les érythrocytes
aviaires, H1 est remplacée par H5 une autre protéine histonique. Les histones
internucléosomales joueraient un rôle dans l'espacement des unités nucléosomales et
dans la compaction de l'ADN au sein du nucléosome en créant une région d'interaction
entre les nucléosomes adjacents.

I.6.2.2. Les différentes étapes dans l'assemblage de la chromatine

L'assemblage de l'ADN en chromatine comprend plusieurs étapes qui commencent par la
formation de son unité fondamentale, le nucléosome, et finissent par des niveaux
d'organisation supérieurs en domaines spécifiques dans le noyau. Les différentes étapes
de cet assemblage sont décrites schématiquement dans la Figure 32.

. La première étape comprend la mise en place, sur l'ADN, d'un tétramère d'histones (H3-
H4)2 nouvellement synthétisées formant la particule sub-nucléosomale, à laquelle
viennent s'adjoindre deux dimères H2A-H2B. L'ensemble constitue la particule
nucléosomale coeur composée de 146 paires de base d'ADN enroulées autour de
l’octamère d'histones. Cette particule cœur et l'ADN de liaison forment le nucléosome.
Les histones nouvellement synthétisées sont spécifiquement modifiées (ex: acétylation
de l'histone H4).

. L'étape suivante est une étape de maturation nécessitant la présence d'ATP, au cours
de laquelle les nucléosomes sont régulièrement espacés et forment le nucléofilament.
Pendant cette étape, les histones nouvellement incorporées sont désacétylées.

. Ensuite l'incorporation des histones internucléosomales est accompagnée par le

repliement du nucléofilament en fibre de 30 nm dont la structure n'est pas élucidée à ce

103
jour. Deux modèles principaux existent : le modèle de type solénoïde et le modèle de
type zig zag.

. Finalement, un grand nombre de repliements successifs conduisent à des niveaux

d'organisation supérieurs en domaines spécifiques dans le noyau.
A chacune des étapes décrites ci-dessus, des variations dans la composition et l'activité
de la chromatine peuvent être obtenues en modifiant soit ses composants élémentaires,
soit l'activité de facteurs impliqués dans les processus d'assemblage et de
désassemblage.

Figure 32. Les principales étapes de l'assemblage de la chromatine.

104
L'assemblage commence avec la mise en place d'un tétramère (H3-H4)2 d'histones
nouvellement synthétisées (1), à laquelle viennent s'adjoindre deux dimères H2A-H2B (2)
pour former la particule nucléosomale cœur. Les histones nouvellement synthétisées sont
spécifiquement modifiées; la modification la plus conservée est l'acétylation de l'histone
H4 sur les lysines 5 et 12 (H3-H4*). L'étape de maturation nécessite la présence d'ATP
afin d'établir un espacement régulier des nucléosomes et les histones nouvellement
incorporées sont désacétylées (3). L'incorporation des histones internucléosomales est
accompagnée par le repliement du nucléofilament. Ici est présenté le modèle de type
solénoïde dans lequel il y a 6 nucléosomes par tour (4). Finalement, plusieurs
repliements successifs conduisent à des niveaux d'organisation supérieurs en domaines
spécifiques dans le noyau (5).

I.6.2.3. Les variations dans les composants élémentaires

Dès les premières étapes de l'assemblage de la chromatine, la particule élémentaire peut
être soumise à des variations. Ces variations sont au moins au nombre de deux :

. au niveau de l'ADN (par exemple, par méthylation), ou

. au niveau des histones qui peuvent soit présenter différentes modifications post-
traductionnelles, soit exister sous des formes variantes (par exemple CENP-A, variant de
l'histone H3).
Toutes ces variations sont capables d'induire des différences dans la structure et dans
l'activité de la chromatine. La grande diversité des modifications post-traductionnelles des
extrémités amino-terminales des histones, présentée dans la Fig 2, (comme l'acétylation,
la phosphorylation, la méthylation, l'ubiquitination, ainsi que la polyADP-ribosylation), et
leur association à des processus biologiques spécifiques, ont conduit à proposer
l'hypothèse d'un "langage" baptisé le "code histone" (notons que ce code est une
hypothèse de travail). Ce code serait "lu" par d'autres protéines ou complexes protéiques,
capables de reconnaître et d'interpréter des profils de modification spécifiques.
L'incorporation de formes variantes des histones peut être importante pour des domaines
spécifiques du génome: ainsi CENP-A, variant de l'histone H3, est associé aux régions
centromériques et macro H2A au chromosome X inactif chez la femelle de mammifères.
H2A-X interviendrait dans la formation de foyers contenant des facteurs de réparation
dans des régions où des cassures d'ADN double brin ont eu lieu. H2A-Z pourrait jouer un
rôle en modifiant la structure de la chromatine afin de réguler la transcription.

105
Pendant l'étape de maturation, l'incorporation d'histones internucléosomales, de
protéines chromatiniennes non histones appelées HMG (High Mobility Group) ou d'autres
facteurs se liant spécifiquement à l'ADN peuvent affecter l'espacement et le repliement du
nucléofilament. Ainsi les premières étapes de l'assemblage peuvent avoir une grande
incidence sur la nature finale de la chromatine dans des domaines spécifiques du noyau.

I.7. Les facteurs d'assemblage en chromatine

I.7.1. Les facteurs interagissant avec les histones
Des facteurs de nature acide peuvent former des complexes avec les histones et ainsi
favoriser leur mise en place. Ces facteurs sont considérés comme des chaperons
d'histones qui facilitent la formation de la particule nucléosomale sans faire partie
intégrante de cette particule. Ces facteurs, aussi appelés facteurs d'assemblage de la
chromatine, se lient préférentiellement à une sous population d'histones.
Par exemple, le facteur CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) interagit avec les histones
H3 et H4 acétylées nouvellement synthétisées et participe à l'assemblage de la
chromatine couplé à la réplication de l'ADN. CAF-1 est aussi capable de promouvoir
l'assemblage de la chromatine spécifiquement couplé à la réparation de l'ADN.
L'interaction entre CAF-1 et la protéine PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) établit
un lien moléculaire étroit entre l'assemblage en chromatine et les processus de
réplication et de réparation de l'ADN. L'assemblage de structures spécialisées comme les
régions centromériques, en déposant des variants d'histones comme CENP-A, ou
télomériques, pourraient faire intervenir la spécificité et la diversité des chaperons
d'histones.

I.7.2. Les facteurs de remodelage et les enzymes modifiant les histones

Des facteurs interviennent aussi pendant l'étape de maturation de la chromatine en
organisant et en maintenant un état défini de cette chromatine. Ils peuvent affecter la
chromatine en induisant des changements conformationnels au niveau du nucléosome
mais aussi au niveau de larges domaines de chromatine. Ces facteurs sont de deux
types: les premiers nécessitent de l'énergie sous forme d'ATP et sont généralement
appelés facteurs de remodelage de la chromatine, et les seconds sont des enzymes
qui modifient post-traductionnellement les histones.

106
a). Facteurs de remodelage: ce sont des complexes multiprotéiques (familles SWI/SNF,
ISWI, Mi2/NuRD). L'activité ATPase permet au complexe de modifier la structure
nucléosomale, en partie grâce à l'énergie libérée par l'hydrolyse de l'ATP. L'étude des
facteurs qui favorisent un espacement régulier des nucléosomes pendant l'assemblage
de la chromatine a permis d'identifier plusieurs complexes multiprotéiques capables in
vitro de faire "glisser" des nucléosomes sur de l'ADN. Bien que ces facteurs de
remodelage aient en commun la présence de nombreuses sous unités protéiques dont
l'ATPase, ils présentent toutefois des différences dans leur quantité et dans leur activité.

b). Modifications post-traductionnelles: l'hypothèse du "code histone" a été proposée pour

expliquer la diversité des activités de la chromatine dans le noyau. Les extrémités N-
terminales non structurées des histones pointent à l'extérieur de la particule
nucléosomale cœur et sont la cible d'enzymes qui les modifient post-traductionnellement.
La modification la mieux étudiée jusqu'à maintenant est l'acétylation des résidus lysine.
L'état d'acétylation résulte d'un équilibre entre deux activités antagonistes: l'activité
histone-acétyltransférase (HAT) et l'activité histone-désacétylase (HDAC) (ex:HAT A,
présentant une activité histone-acétyltransférase, et HDAC1, histone-désacétylase). De
nombreuses protéines jouant un rôle dans la régulation de la transcription ont une activité
histone-acétyltransférase intrinsèque. De même, des histone-désacétylases ont été
décrites comme faisant partie de complexes multiprotéiques associés avec la nature
répressive de la chromatine. Parmi ces complexes, se retrouvent les facteurs de
remodelage de la famille Mi2, suggérant un lien entre le remodelage des nucléosomes et
la désacétylation des histones pendant la fonction répressive de la chromatine.
La méthylation des histones, joue un rôle fonctionnel important. En effet, une
méthyltransférase méthyle spécifiquement l’histone H3 sur son résidu lysine 9, modifiant
l'interaction de H3 avec des protéines associées à l'hétérochromatine.
Les deux modifications possibles (acétylation/méthylation) sur le même résidu (lysine 9)
de l'extrémité N-terminale de H3 illustre parfaitement l'hypothèse du "code histone" en
action. En effet, les lysines acétylées des extrémités N-terminales de H3 et H4 sont
reconnues par un domaine spécifique, appelé le chromodomaine, présent dans de
nombreuses protéines présentant une activité histone-acétyltransférase. En revanche, H3
méthylée sur son résidu lysine 9 est reconnu par le chromodomaine d'une protéine
spécifique de l'hétérochomatine (HP1, Heterochromatin Protein 1).

107
Ainsi, en plus des altérations produites dans la charge totale des extrémités des histones
proposées être à l'origine de la déstabilisation physique du nucléosome, ces
modifications semblent donner une spécificité aux interactions protéines:protéines avec
les histones. Elles sont associées à différentes régions du génome et ont été corrélées
avec des fonctions nucléaires précises.

I.8. Organisation du génome dans le noyau

Au delà des nucléosomes, la chromatine présente des niveaux d'organisation supérieurs
encore peu caractérisés. Le nucléofilament se compacte pour former la fibre de 30 nm
qui s'organise en boucles de 150 à 200 kb (250 nm pendant l'interphase) pour atteindre
un niveau de compaction maximum dans le chromosome métaphasique (850 nm).
En interphase, l'organisation du génome est reliée à la structure des chromosomes dont
les différentes régions organisées en bandes peuvent être visualisées par l'utilisation de
colorant comme le Giemsa.
Les principales bandes sont: les bandes G et C qui sont répliquées tardivement en phase
S correspondent à l'hétérochromatine, les bandes G sont riches en adénine et thymine
qui sont stables et les bandes R qui sont répliquées précocement en phase S
correspondent à l'euchromatine. Les bandes R sont enrichies en histones acétylées qui
sont conservées entre l'interphase et la mitose, suggérant un rôle de marqueur
fonctionnel de cette modification pouvant servir de mémoire de l'organisation de ces
domaines au cours du cycle cellulaire.
Une autre technique de coloration est la Q qui utilise le quinacrine qui s’attache
préférentiellement aux régions riches en A et T ; les bandes Q sont visualisés avec le
microscope à fluorescence. Les bandes Q et G sont équivalentes sur le chromosome.
La technique la plus moderne est celle de FISH. Qui utilise une sonde d’un gène
fluorescente qui s’hybride à un gène pour le localiser sur le génome.
Un karyotype est le groupe de tous les chromosomes métaphasiques. Le caryotype est
spécifique à l’espèce. La paire de chromosomes la plus grande est la première. Seul le
chromosome 21 est plus petit que le 22 ; le caryotype peut détecter certaines mutations.
La localisation des chromosomes dans le noyau interphasique révèle que chaque
chromosome occupe un espace bien défini. Chez les mammifères, l'organisation des
chromosomes dans le noyau varie en fonction du type cellulaire. Pendant l'interphase, les
bandes des chromosomes métaphasiques sont localisées dans le noyau en fonction de
leur réplication: les bandes G répliquées tardivement occupent la périphérie du noyau

108
tandis que les bandes R contenant la majorité des gènes résident dans la partie interne
du nucléoplasme.
Ainsi, bien que chaque chromosome occupe un territoire différent, des parties
appartenant à des chromosomes distincts peuvent se réunir pour former des domaines
fonctionnels. La localisation de régions codantes ou non codantes suggère que les gènes
tendent à être localisés à la surface des territoires chromatiniens.
D'après un modèle reposant sur la localisation de quelques gènes, les transcrits seraient
alors libérés dans des canaux interchromosomiques, transférés au niveau des sites
d'épissage, puis exportés dans le cytoplasme après maturation.
Toutes ces études ont permis de proposer que le noyau est organisé en domaines. La
localisation de l'ADN dans ces domaines peut être, en partie, une conséquence des
activités de la chromatine. Le ciblage de protéines pourrait aider à apporter des protéines
spécifiques dans des domaines particuliers du noyau. Dans un modèle hypothétique, les
protéines associées à l'hétérochromatine (par exemple HP1, Polycomb, Sir3/pSir4p,
ATRX), les facteurs de transcription (comme Ikaros) et les facteurs d'assemblage de la
chromatine (comme CAF-1) sont des candidats pour l'établissement et le maintien des
domaines nucléaires.
La valeur C est le nombre haploide de chromosomes dans le génome Il est
caractéristique de chaque espèce. La valeur C d’un noyau eucaryotique est 1000 fois
plus élevé que celui des bactéries et 100000 fois plus élevé que celui d’un virus.

I.9. Les classes cinétiques de l’ADN eucaryotique

I.9.1. Les séquences à copies uniques de gènes
C’est le cas de la plupart des gènes. Quand cet ADN est fragmenté, dissocié et incubé
dans des conditions de réassociation la cinétique de réassociation est très lente. Chez la
plupart des eucaryotes l’ADN à copie unique représente à peu pré 70% de l’ADN
chromosomique.

I.9.2. Les séquences répétées modérément

Le génome humain contient 25% à 30% de ces séquences. Il est formé de familles de
gènes répétées de façon dispersée dans le génome. On prend comme exemple les
histones ou transposons qui peuvent être répétées un million de fois. L’organisation de
ces séquences est faite de la manière suivante :une séquence de 300 p.b. répétée de
façon modérée suivie par une séquence unique de 1200p.b. Certaines de ces séquences

109
sont des séquences régulatrices. Certaines de 100 à 500 pb sont appelées SINES,
d’autres de 5000 pb sont appelées LINES. La famille Alu est la plus étudiée parmi les
SINES. Cette dernière de 300 pb est répétée 9.105. Pour cela ces séquences sont
considérées comme étant une classe hétérogène d’ADN eucaryotique.

I.9.3. Les séquences hautement répétées

Elles constituent 10% du génome et sont répétés en tandem comme les gènes de l’ARNr
et ARNt. On les trouve aussi au niveau des centromères et des télomères. Elles forment
une bande distincte après centrifugation dans un gradient de Chlorure de Caesium ; cette
bande est appelée satellite et peuvent ne pas être centromériques suivant l’espèce.

I.10. L'Hétérochromatine: du chromosome à la protéine

I.10.1. Le concept d'hétérochromatine
Chez les eucaryotes, contrairement aux procaryotes, l'ADN est empaqueté sous forme
d'un complexe nucléo-protéique appelé chromatine, qui porte le message héréditaire. Elle
est localisée dans un noyau et apparaît organisée en plusieurs entités distinctes que sont
les chromosomes.
En 1928, basé sur des observations exclusivement histologiques, Emil Heitz définit
l'hétérochromatine (HC) comme les segments de chromosome qui apparaissent très
condensés et très colorés dans le noyau interphasique. En fait, la chromatine se présente
comme un enchevêtrement de fibres dont le diamètre varie, non seulement au cours du
cycle cellulaire, mais aussi en fonction des régions chromosomiques observées.
L'euchromatine active est constituée d'une fibre dont le diamètre correspond à celui d'un
nucléosome, segment d'ADN double brin enroulé autour de 8 molécules d'histones
identiques deux à deux, H2A, H2B, H3, et H4. Dans l'euchromatine inactive, cette fibre
peut s'enrouler en un solénoïde grâce aux histones H1. Ce solénoïde est davantage
organisé grâce à des interactions avec des protéines non-histones (topoisomérase II, la
scaffold protein 2 ou SC2, les lamines...). En ce qui concerne l'hétérochromatine telle que
nous l'avons définie, la fibre qui la compose est encore plus condensée, apparaît souvent
en agrégats, et implique de nombreuses autres protéines, notamment les protéines HP1
(heterochromatin protein 1).

110
I.10.2. Deux types d'hétérochromatine
Il existe deux types d'hétérochromatine, constitutive et facultative, qui présentent
quelques différences, essentiellement liées à l'ADN qu'elles contiennent. La richesse en
ADN satellite conditionne la permanence ou la réversibilité de l'hétérochromatine, son
polymorphisme éventuel et ses propriétés tinctoriales (Tableau 11).

Tableau 11 : Différences entre hétérochromatine constitutive et hétérochromatine facultative.

HC constitutive HC facultative
stable réversible
Contient de l’ADN satellite Enrichie en séquences LINES
Polymorphisme + Polymorphisme -
Bandes C+ Bandes C-

I.10.3. L'hétérochromatine constitutive

L'hétérochromatine constitutive contient un ADN tout à fait particulier, appelé ADN
satellite et constitué de séquences courtes et répétées en tandem un très grand nombre
de fois: ADN alpha-satellite, ADN satellite I, II et III. Ces séquences d'ADN satellite
peuvent se replier sur elles mêmes et pourraient jouer un rôle important dans la structure
très compacte que présente l'HC constitutive.
L'hétérochromatine constitutive est très polymorphe probablement du fait de l'instabilité
de l'ADN satellite. Ce polymorphisme peut concerner aussi bien la taille, que la
localisation de l'hétérochromatine et n'entraîne apparemment aucun effet phénotypique.
En plus, elle est fortement colorée par la technique des bandes C, ce qui pourrait résulter
de la renaturation très rapide de l'ADN satellite après dénaturation.

I.10.4. L'hétérochromatine facultative

L'hétérohromatine facultative est caractérisée par la présence de séquences répétées de
type LINES. De telles séquences, dispersées dans le génome, pourraient favoriser la
propagation d'une structure chromatinienne condensée.
L'hétérochromatine facultative est réversible, son «état hétérochromatique» dépendant
du stade de développement ou du type cellulaire. L'X inactif (Corps de Barr) dans les
cellules somatiques en est un exemple d'HC facultative. L'hétérochromatine facultative,
n'étant pas particulièrement riche en ADN satellite, ne présente pas de polymorphisme;
en plus, elle n'est jamais colorée par la technique des bandes C.

111
I.10.5. L'hétérochromatine est condensée
C'est la définition même de l'hétérochromatine; d’ailleurs, elle s'applique aussi bien à
l'hétérochromatine constitutive qu'à l'hétérochromatine facultative. Cette condensation
entraîne une intense chromophilie et la rend inaccessible à la DNAse 1 et aux enzymes
de restriction en général.

I.10.6. L'ADN de l'hétérochromatine est de réplication tardive

L'incorporation de différents analogues des nucléotides montre que l'ADN contenu dans
l'hétérochromatine, facultative et constitutive, a une réplication tardive. La réplication
tardive de l'HC résulte d'une part de sa forte condensation qui empêche la machinerie de
réplication d'accéder facilement à l'ADN, et d'autre part de sa localisation dans un
domaine nucléaire excentré, pauvre en éléments actifs.

I.10.7. L'ADN de l'hétérochromatine est méthylé

L'ADN de l'hétérochromatine constitutive est très méthylé sur les cytosines. Ainsi, un
anticorps anti-5-methyl-cytosine colore fortement toutes les régions d'hétérochromatine
constitutive. Pour ce qui est de l'hétérochromatine facultative, la méthylation de l'ADN est
plus discrète. Des enzymes de restriction, sensibles à la méthylation, permettent
cependant de déceler une forte méthylation des ilots CpG, spécifiquement localisés dans
les régions régulatrices des gènes.

I.10.8. Fonctions de l'hétérochromatine

On s'est longtemps demandé si l'hétérochromatine avait un rôle précis dans le génome
humain car son polymorphisme important ne semblait pas avoir de conséquence
fonctionnelle ou phénotypique.

I.10.8.1. Rôle de l'hétérochromatine dans l'organisation des domaines nucléaires

L'hétérochromatine et l'euchromatine occupaient des domaines nucléaires différents:
l'hétérochromatine est généralement localisée à la périphérie du noyau et accolée à la
membrane nucléaire. La chromatine active occupe, au contraire, une position centrale.
La localisation préférentielle de l'hétérochromatine contre la membrane nucléaire pourrait
être due à l'interaction de la protéine HP1 avec le récepteur de la lamine B, composant
intégral de la membrane nucléaire interne.

112
La localisation périphérique de l'hétérochromatine concentre les éléments actifs vers
l'intérieur du noyau, permettant à l'euchromatine active de se répliquer et d'être transcrite
avec une efficacité maximum.

I.10.8.2. Rôle de l'hétérochromatine dans la fonction centromérique

Dans la plupart des eucaryotes, les centromères sont enrobés d'une masse non
négligeable d'hétérochromatine. Il a été proposé que l'hétérochromatine centromérique
soit nécessaire pour assurer la cohésion des chromatides sœurs et permettre une
disjonction normale des chromosomes mitotiques.
Chez la levure Saccharomyces pombe, l'homologue de la protéine HP1, Swi6, est tout à
fait nécessaire à la cohésion efficace des chromatides soeurs pendant la division
cellulaire.
De plus, des expériences de délétion de l'ADN satellite montrent qu'une large région
répétée d'ADN satellite est indispensable pour que la fonction centromérique soit
correcte. Il est supposé que l'hétérochromatine centromérique pourrait créer, de facto, un
compartiment en augmentant la concentration locale du variant d'histone centromérique
CENP-A et en favorisant l'incorporation de CENP-A plutôt que d'histone H3 pendant la
réplication.

I.11. Maladies de l'hétérochromatine

I.11.1. Maladies de l'hétérochromatine constitutive
Ces maladies résultent généralement d'une altération des processus de différenciation
cellulaire. Elles peuvent être constitutionnelles comme le syndrome ICF ou le syndrome
de Roberts: Le syndrome ICF associe une Immunodéficience, une instabilité des
Centromères et une dysmorphie Faciale (Immunodeficiency, centromeric instability, facial
anomalies). Il s'agit d'une maladie récessive, rare, liée à des mutations du gène
DNMT3B, DNA methyl transférase. Les ADN satellites II et III riches en G-C sont
particulièrement déméthylés, ce qui provoque une ségrégation anormale des chromatides
sœurs, la formation de figures multiradiales, des délétions, des micronoyaux…
Elles peuvent être acquises : dans de nombreux cancers, des anomalies de
l'hétérochromatine constitutive ont été mises en évidence, portant soit sur l'ADN soit sur
les protéines de l'hétérochromatine.

113
Dans les lymphomes non hodgkiniens et le myélome multiple ont notamment été
montrées des anomalies de la constriction secondaire du chromosome 1, et ces
anomalies miment les anomalies retrouvées dans le syndrome ICF. Il a en effet été
montré l'existence d'une hypométhylation globale du génome, associée plus
particulièrement à une hypométhylation de l'ADN satellite II.
Dans le cancer du sein métastatique, a été démontrée une diminution de la protéine HP1
alpha, cette protéine étant normalement localisée dans les régions centromériques des
chromosomes.

I.11.2. Maladies de l'hétérochromatine facultative

Elles peuvent résulter du défaut d'inactivation d'un chromosome X dans les cellules
somatiques chez la femme (mutation dans le gène XIST), et entraînera l'expression de
maladies récessives liées au chromosome X chez la femme.
Elles peuvent résulter d'un défaut de condensation de la vésicule sexuelle, dans les
cellules germinales mâles et entraîner une stérilité due à l'arrêt de la méiose au stade
pachytène.
En conclusion, l'hétérochromatine, bien qu'apparemment amorphe et isolée en périphérie
du noyau, semble jouer un rôle tout à fait essentiel dans l'organisation et la fonction du
génome. Tout au long de cet exposé nous avons essentiellement présenté les
caractéristiques liées à l'hétérochromatine, qu'elle soit constitutive ou facultative.

I.12. L’organisation de l’ADN

I.12.1. Familles de gènes
Plusieurs protéines sont codées par des familles de gènes homologues à travers tout le
génome. Ex les actines de 5 à 30, les globines 5 les histones 100 à 1000 les séquences
d’ADN dans une même famille peuvent diverger ce qui peut résulter en gènes
homologues de fonctions différentes. Quelques gènes deviennent inactifs. On les appelle
les pseudogènes.

I.12.2. Les familles de gènes répétés en tandem

Les cellules qui contiennent des produits de certains gènes en grandes quantités ont des
gènes répétés en tandem. Un bon exemple est l’organisateur nucléaire. En 1960, il a été
suggéré que le NO est répété en tandem qui code pour l’ARNr.

114
Ces différentes observations suggèrent que la répétition d'une séquence d'ADN, en
tandem, un grand nombre de fois, est capable de générer, à elle seule, la formation
d'hétérochromatine. De telles séquences répétées permettraient d'atteindre un degré plus
élevé de compactage de la chromatine, formant ainsi des structures particulières. Ces
structures pourraient alors être reconnues par des protéines spécifiques comme les
protéines HP1, et l'ensemble conduirait à la formation d'une chromatine d'un ordre
supérieur.

115
 II : REPLICATION DE L’ADN

Watson et Crick ont proposé un modèle de réplication de l’ADN un mois après avoir
proposé le modèle de la structure de l’ADN. Ce modèle est celui de la réplication semi-
conservative. Une des chaînes filles de l’ADN est nouvellement synthétisée à partir d’une
des chaînes parentales qui s’est séparée de l’autre chaîne. Néanmoins, deux autres
modèles ont été proposés: le modèle conservateur et le modèle dispersif. L’expérience
réalisée par Messelson et Stahl (1957) a permis de fournir la preuve en faveur du modèle
semi-conservatif.
Ces chercheurs ont utilisé E. coli car sa culture dans un milieu minimal est facile et rapide
et son temps de génération est court, ce qui permet de suivre l’évolution de l’ADN à
travers les générations successives. E. coli est cultivé pendant plusieurs générations
dans un milieu contenant comme seule source d’azote le NH4Cl contenant du N15. Le
résultat est que tous les composés cellulaires de la bactérie contenant de l’azote entre
autres les purines et les pyrimidines de l’ADN seront marqués par le N15 qui fait que son
ADN est plus dense que l’ADN normal contenant le N14. La bactérie est ensuite transférée
rapidement dans un milieu contenant le N14.
La distribution de N14 et N15 est révélée par la technique de centrifugation sur gradient de
densité. Elle consiste à dissoudre une petite quantité d’ADN dans une solution
concentrée de Chlorure de Césium qui a une densité proche de celle de l’ADN
(1,7g /cm3). Cette solution est centrifugée jusqu’à atteindre l’équilibre. Un gradient stable
de densité est établi qui varie de 1,66 à 1,76g/cm3. Les molécules d’ADN formeront une
bande à l’endroit du gradient qui correspond à leur densité. Un mélange d’ADN N14 et
d’ADN N15 a donné des bandes séparées parce que leur densité est différente de 1%. Si
on extrait l’ADN une génération après l’avoir transférée dans un milieu contenant le
N14H4Cl, une seule bande apparaît qui est intermédiaire entre la bande contenant
seulement le N15 et celle contenant seulement le N14. Ceci indique que cette bande est
formée d’un hybride de N15 et de N14, ce qui veut dire que la moitié de son ADN est
parental et l’autre moitié est nouvellement synthétisée. Si on extrait l’ADN deux
générations après le transfert des bactéries dans un milieu contenant le N14, on trouve
deux bandes : l’une est la bande intermédiaire que nous avons déjà trouvé après la
première génération et l’autre correspond à la bande qui contient entièrement du N14
(figure 33).

116
Figure 33: Expérience de Messelson et Stahl

II.1. Les enzymes de la réplication de l’ADN

En 1955, Arthur Kornberg et ses collègues avaient entrepris des recherches afin de
purifier les enzymes de la réplication pour pouvoir comprendre les réactions impliquées
dans ce processus. En mettant un mélange de réaction contenant des fragments d’ADN,
tous les 4 précurseurs nucléotidiques (dNTP) marqués radioactivement, et un lysat
préparé de cellules d’E. coli, ils ont accompli avec succès pour la première fois une
synthèse d’ADN. En réalisant que le lysat de E. coli contient le composé crucial de la
synthèse qui est l’enzyme, il l’ont analysé et ont pu isoler cette enzyme nécessaire à la
synthèse. Cette enzyme a été originalement appelée l’enzyme de Kornberg mais elle est
maintenant appelée l’ADN polymérase I parce qu’elle a été isolée en premier.

117
Les chercheurs ont conclu que toutes les ADN polymérases ont besoin de 4 ingrédients :
1). Les 4 dNTPs qui sont les précurseurs activés des nucléotides.
2). Les ions magnésium (Mg2+).
3). Un fragment d’ADN ou d’ARN qui représente une amorce ayant une extrémité 3’OH
libre.
4). Une matrice. Cette matrice peut être de l’ADN simple brin ou double brin. Ce dernier
est une matrice efficace seulement quand l’une de ses chaînes est cassée à un site ou
plus.
La réaction de polymérisation est la suivante:
ADN ADN polymérase ADN
{(dNMP)n}+ dNTP {(dNMP)n+1} + PPi

Cette réaction représente la catalyse par l’ADN polymérase d’une réaction d’addition d’un
nucléotide à une chaîne d’ADN existante avec la libération d’un pyrophosphate
inorganique (PPi). C’est une attaque nucléophyllique de l’extrémité 3’OH de l’amorce sur
l’atome de phosphore le plus interne du désoxyribonucléoside triphosphate. La liaison
formée est une liaison phosphodiester. L’hydrolyse subséquente du pyrophosphate va
donner l’énergie suffisante pour la polymérisation. L’élongation de l’ADN se fait toujours
dans la direction 5’ 3’ puisque les ADN polymérases connues jusqu’à présent ne
peuvent allonger la chaine d’ADN que dans cette direction.

II.1.1. L’ADN polymérase I

L’ADN polymérase I est codée par le gène polA et consiste en un seul polypeptide. Une
mutation de ce gène a été découverte en 1969 quand De Lucia et Cairns ont isolé le
mutant polA1. Ce mutant qui est déficient pour la polymérase I avait la capacité de se
reproduire et de croître normalement ; cependant, quand il est exposé aux rayons UV ou
à des mutagènes chimiques, son taux de mutation est très élevé. Ceci montre que la
fonction primaire de l’ADN polymérase I n’est pas la synthèse de l’ADN mais une
réparation spécifique de l’ADN appelée «nick translation». En fait, cette fonction est
assurée par l’activité exonucléasique 5’ 3’ absente chez la plupart des autres
polymérases. Cette activité est localisée dans un domaine structural (appelé le fragment
Klenow) qui peut être séparé du reste de l’enzyme par un traitement protéolytique léger
(figure 34).

118
 3’ à 5’ exonucléase 5’à 3’ exonucléase polymérase

petit fragment grand fragment ou fragment klenow

Figure 34: les différents domaines d’activité de la polymérase I.

L’activité 5’ 3’ est aussi responsable de l’hydrolyse de l’amorce d’ARN pendant la

réplication. L’ADN polymérase I a une faible vélocité qui est estimée à 16-20 nucléotides
par seconde.
Des études menées sur plusieurs mutants ont pu démontrer l’existence d’autres enzymes
polymérisantes dans la cellule. Il s’agit notamment des ADN polymérases II et III. Des
recherches encore plus récentes ont pu mettre en évidence l’existence d’autres
polymérases: les ADN polymérases III et IV.

II.1.2. L’ADN polymérase II

Elle a été découverte en 1970. Elle est codée par le gène polB et consiste en quatre
sous-unités.

II.1.3. L’ADN polymérase III

Elle a été découverte en 1971 et s’est avérée être l’enzyme principale de la réplication de
l’ADN dans la cellule et donc la plus étudiée. Elle est formée de 10 sous-unités codées
par plusieurs gènes. Trois de ses sous-unités constituent le centre catalytique de
l’enzyme: 1) la sous-unité alpha (α) codée par le gène dnaE ou polC responsable de
l’activité polymérasique 2) la sous-unité epsilon (ε) codée par le gène dnaQ possède une
activité exonucléasique 3’ 5’ qui a le rôle de lecture d’épreuves pour assurer la
fidélité de la réplication et 3) la sous-unité theta (θ) codée par le gène holE qui s’associe
aux deux autres sous-unités citées ci-dessus pour former ce qu’on appelle une
polymérase «core» qui peut synthétiser l’ADN mais avec une activité catalytique limitée.
Deux polymérases «core» peuvent être liées en un complexe par un dimère de sous-
unité tau (г). L’activité catalytique de l’enzyme est augmentée par l’association de 4 sous-
unités beta (β). Elles permettent l’accrochage du centre catalytique à la matrice en
s’associant en pairs et forment une structure de «donut» qui entoure l’ADN et agit comme
une pince. Ceci permet une activité catalytique de 500000 et une vitesse de réplication de
250-1000 nucléotides par seconde.

119
Chaque cellule d’E. coli contient 200 molécules de cette enzyme alors que le nombre de
molécules de la polymérase I est de 10-20 molécules seulement. La fonction de l’ADN
polymérase II et le nombre de molécules de cette enzyme dans la cellule ne sont pas
encore connus. On croit qu’elle est concernée par la réparation de l’ADN.
Toutes les trois enzymes contiennent une activité exonucléasique 3’ 5’ responsable
du mécanisme de «lecture d’épreuves» ou correction des erreurs. Si un polymère
contient un mésappariement de C au lieu d’un T devant un A, l’addition d’une polymérase
I et de dTTP excise le C misapparié avant la continuation de la polymérisation. Ceci
montre que les ADN polymérases assurent une fidélité de réplication très élevée car elles
examinent le résultat de chaque polymérisation avant de procéder à la suivante, ce qui
permet la stabilité du matériel génétique.
Deux autres polymérases, les polymérases IV et V, ont été découvertes en 1999. Il
semble qu’elles sont concernées par une réparation inhabituelle de l’ADN.

II.2. La réplication de l’ADN

II.2.1. chez les procaryotes
La réplication de l’ADN requiert la présence de plus de 20 protéines, ayant chacune une
fonction spécifique. Tout le système est appelé l’ADN réplicase ou le réplisome. La
réplication de l’ADN est divisée en trois phases : l’initiation, l’élongation et la terminaison.

II.2.1.1. L’initiation
L’autoradiographie et la microscopie électronique ont révélé la présence de structures en
forme de theta (θ) chez E. coli, suggérant ainsi que la molécule d’ADN maintient sa forme
circulaire pendant la réplication. Il est clair aussi qu’il y a une absence de segments longs
d’ADN simple brin. Donc, les brins parentaux ne se séparent pas complètement pour
servir comme matrice. En fait, la synthèse d’ADN nouveau est couplée au déroulement
de l’ADN parental. Le site de déroulement et de synthèse spontanés est appelé une
fourche de réplication.
La réplication étant un processus rigoureusement contrôlé, les chercheurs ont supposé
qu’il doit y avoir un site d’initiation spécifique. Ceci est en fait démontré par des études
sur les quantités relatives de certains gènes dans des cultures de E. coli où la réplication
est rapide. Les fréquences relatives de ces gènes ont été déterminées par l’hybridation
avec des sondes complémentaires de ces gènes.

120
Au moment où les chercheurs tentaient d’expliquer le déroulement de la réplication au
niveau moléculaire, un certain nombre de points sont restés ambigus : il s’agit, entre
autres, de :
a). Origine de réplication : est-elle fixe ou mobile ?
b). Direction de la réplication : est-elle uni- ou bidirectionnelle ?
Deux expériences menées séparément ont permis de lever tous les doutes concernant
l’origine et la direction de la réplication.

a. Origine de réplication
Sur le chromosome circulaire de E.coli, on considère deux gènes a et b tels que a est
proche de l’origine de réplication alors que b est loin de cette origine.
Premier cas : Dans le cas où l’origine de réplication est fixe, le gène a se répliquera avant
le gène b. Dans une culture bactérienne en croissance rapide, il y aura deux fois plus de
gène a que de gène b.
Deuxième cas : Par contre, dans le cas où l’origine de réplication est mobile, c'est-à-dire
aléatoire, le nombre de gènes a sera égal au nombre de gènes b puisque la réplication
démarrera tantôt à côté de a tantôt à côté de b.
Le résultat expérimental est en faveur d’une origine fixe.

b. Direction de la réplication
Afin de mettre en évidence la direction de la réplication, les chercheurs ont encore une
fois fait appel à E.coli. Des bactéries sont cultivées dans un milieu radioactif contenant de

la thymine (…) à faible densité. Apres le début de la réplication, elles ont été transférées

dans un autre milieu radioactif mais contenant de la thymine à haute densité (…..)

a). Si la réplication se faisait d’une manière unidirectionnelle (qu’elle se dirige à droite ou

à gauche), on constatera après autoradiographie la présence de radioactivité à faible
densité suivie de la radioactivité à haute densité.

ori…………………… ou ………………….ori
b). Si la réplication se faisait d’une manière bidirectionnelle, on verra la radioactivité à
faible densité au milieu flanquée de la radioactivité à haute densité de part et d’autre.

………………………ori…………………….

121
Les preuves expérimentales ont été en faveur de la réplication bidirectionnelle.
Ces études ont montré que les fréquences relatives de ces gènes dépendent de leur
position dans le génome et que :
1). La réplication est initiée à un site unique identifié comme oriC localisé à 83mn sur la
carte génétique standard de E. coli qui est de 100mn.
2). La réplication procède simultanément dans les deux directions opposées, à la même
vitesse. En d’autres termes, on trouve deux fourches de réplication, une se déplace dans
la direction des aiguilles d’une montre, l’autre se déplace dans la direction opposée des
aiguilles d’une montre.
3). Les deux fourches de réplication se rencontrent à «ter» (31’ sur la carte) ou la région
de terminaison, qui est opposée à la région de l’origine de réplication (figure 35).

Figure 35 : Réplication bidirectionnelle à partir de deux fourches de réplication opposées.

L’origine de réplication oriC est constituée de 245pb contenant des séquences

hautement conservées parmi les origines de réplication bactériennes. Les séquences
clés sont formées de deux séries de répétitions courtes : 3 à 13pb et 4 à 9pb. Au moins 9
enzymes ou protéines participent dans l’initiation de la réplication. Ils forment un
complexe et séparent les deux brins de l’hélice à l’origine. Le composé clé dans le
processus d’initiation est la protéine DnaA. Un complexe unique de 20 DnaA s’associe
aux 4 répétitions de 9pb, puis reconnaissent et dénaturent avec succès l’ADN dans la
région des trois répétitions de 13 pb, qui sont riches en AT (figure 36).

122
3 séquences de 13pb Sites de liaison à la protéine dnaA : séquences de 9pb.
en tandem

Séquence séquence
consensus consensus
GATCTNTTNTTT TTATCCACA
Figure 36: L’arrangement des séquences de l’origine de réplication oriC d’E. coli.

Ce processus requiert la présence de l’ATP et HU qui ressemble à une histone. La

protéine DnaB s’attache ensuite à la région de séparation par une réaction impliquant la
protéine DnaC. Deux héxamères de DnaB s’attachant chacun à un brin de l’ADN agissent
comme des hélicases, déroulant l’ADN bidirectionnellement et créant deux fourches de
réplication potentielles.

Figure 37: formation d’une fourche de réplication à partir d’un point d’origine et initiation d’un nouveau
brin d’ADN chez E. coli.

123
La protéine SSB (single-strand binding protein) ou protéine de liaison à l’ADN monobrin,
s’attache ensuite coopérativement à chacun des deux monobrins et les empêche de se
rénaturer ; alors que la gyrase (ADN topoisomérase II) libère le stress topologique créé
par la DnaB hélicase. La gyrase agit en convertissant l’énergie de l’ATP en un super
enroulement. Elle a une forme de losange sur laquelle 200pb d’ADN peuvent s’enrouler.
Le déroulement de l’ADN engendré par la DnaB est couplé à la réplication quand d’autres
protéines de réplication sont ajoutées.

Figure 38 : Stabilisation de l’ADN simple brin par la protéine SSB.

L’initiation est la seule phase de la réplication de l’ADN qui est régulée. Cette régulation
est telle que la réplication se fait une seule fois dans le cycle cellulaire. Le mécanisme de
cette régulation n’est pas encore totalement connu.

II.2.1.2. L’élongation
Elle inclut deux opérations distinctes : la synthèse du brin continu et du brin discontinu.
La première est plus directe. En raison de l’incapacité des ADN polymérases à assurer
une synthèse de novo d’ADN, la réplication doit commencer par la synthèse d’une courte
amorce d’ARN dotée d’une extrémité 3’OH (10 à 60 nucléotides) à l’origine de la
réplication par la primase (DnaG). La synthèse de l’ADN par la polymérase III se fait par
l’addition par cette enzyme de désoxyribonucléotides à l’extrémité 3’OH de l’amorce de
façon continue.

124
La synthèse de l’autre chaîne a posé un problème aux chercheurs puisque la polymérase
III ne peut pas synthétiser l’ADN dans la direction 3’ 5’. Ce problème a été résolu par
Okazaki (1979) qui a découvert que la synthèse de cette chaîne se fait de façon
discontinue. En effet, quand Okazaki a marqué le milieu de culture par la thymine tritiée
(H3) pendant des périodes de temps très courtes (5 secondes), il a trouvé de la
radioactivité dans des petits fragments de 1000 à 2000 nucléotides. Cependant, quand il
a marqué le milieu durant des périodes de temps plus longues, il a trouvé de la
radioactivité dans des fragments plus longs. Ces recherches ont prouvé que l’ADN est
synthétisé en petits fragments au début de la réplication qui sont ensuite liés pour former
des fragments plus longs. En fait, des petits fragments d’ARN sont synthétisés par la
primase. Cette enzyme est aidée par un complexe de six protéines qui forment le
primosome et qui se déplace tout le long de la chaîne parentale qui a une polarité de 5’
3’. Les fragments d’ARN ainsi synthétisés sont utilisés ensuite comme des amorces pour
la synthèse de petits fragments d’ADN par la polymérase III. A ce niveau, la synthèse des
deux brins est coordonnée. Elle est réalisée par un dimère de polymérase III unique de
façon simultanée. Cela est accompli par la formation d’une boucle par le brin parental
servant de matrice au brin discontinu. Les amorces d’ARN sont ensuite hydrolysées par
l’activité exonucléasique 5’ à 3’ de l’ADN polymérase I et le vide est comblé par la même
enzyme. Les extrémités de ces fragments d’ADN sont ensuite liées par une enzyme
découverte en 1967: l’ADN ligase. La réaction catalysée par cette enzyme est la
suivante :

Brin d’ADN –3’OH+ -O-P-O-5’-Brin d’ADN Brin d’ADN –3’-O-P-O-5’-Brin d’ADN

L’ADN ligase catalyse la formation d’une liaison phosphodiester entre le groupement

3’OH à l’extrémité d’une chaîne d’ADN et le groupement 5’-phosphate de l’extrémité de
l’autre chaîne en utilisant l’énergie. Chez E. coli et d’autres bactéries, le NAD+ fournit
cette énergie alors que chez les cellules animales, l’ATP est la source d’énergie.
Cependant, Il faut noter que l’ADN ligase ne peut pas lier deux molécules d’ADN simple
brin. Seuls les duplexes d’ADN sont liés par cette enzyme.

125
Figure 39 : Les événements chronologiques qui prennent place au niveau de la fourche de réplication
chez E. coli.

126
Une fourche de réplication typique comprend un nombre impressionnant d’enzymes et de
facteurs afin d’assurer un bon déroulement de la réplication, comme illustré dans la
figure.

Figure 40 : La fourche de réplication montrant les protéines majeures.

II.2.1.3. La terminaison
Les deux fourches de réplication du chromosome circulaire de E. coli se rencontrent dans
une région terminale contenant des copies multiples d’une séquence de 20 pairs de
bases appelée «Ter». Les séquences «Ter» sont arrangées sur le chromosome pour
créer un piège qu’une fourche de réplication ne peut pas dépasser. Les séquences «Ter»
sont des sites d’attachement d’une protéine appelée «Tus» (terminus utilization
substance). Un seul complexe «Ter-Tus» fonctionne par cycle de réplication, celui qui est
rencontré en premier par l’une des deux fourches de réplication.
Quand l’une des deux fourches rencontre le complexe «Ter-Tus», elle s’arrête. L’autre
fourche s’arrête quand elle rencontre la première fourche déjà arrêtée. Les dernières
centaines de pairs de bases d’ADN entre ces deux complexes sont répliquées par un
mécanisme inconnu complétant deux chromosomes circulaires liés topologiquement et
appelés des caténanes. Les deux cercles sont séparés par la topoisomérase IV, une
topoisomérase de type II.

127
II.2.2. La réplication chez les eucaryotes
L’ADN des cellules eucaryotiques est beaucoup plus complexe que celui des
procaryotes. Il est organisé en structures nucléoprotéiques complexes, ce qui rend sa
réplication plus difficile et compliquée. Cependant, les caractéristiques essentielles de la
réplication sont les mêmes chez les procaryotes et les eucaryotes.
Les origines de la réplication appelées réplicateurs ou ARS (séquences réplicatives
autonomes) ont été identifiées et le mieux étudiées chez la levure. Ces réplicateurs
peuvent s’étendre sur 150pb et contiennent plusieurs séquences conservées. Il y aurait
400 réplicateurs distribués parmi les 17 chromosomes du génome haploïde de levure.
L’initiation de la réplication chez tous les eucaryotes requiert une protéine formée de
plusieurs sous-unités appelée l’ORC (le complexe de reconnaissance de l’origine) qui
s’associe à plusieurs séquences du réplicateur. ORC interagit et est régulé par d’autres
protéines impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire. Le taux de mouvement de la
fourche de réplication chez les eucaryotes (50/s) est de 1/20 celui de E. coli. Les
chromosomes eucaryotes sont beaucoup plus grands que les chromosomes procaryotes,
ce qui requiert la présence d’origines multiples de réplication. En effet, les expériences
d’autoradiographie ont montré que la réplication est initiée à plusieurs sites
simultanément de façon bidirectionnelle. Chaque unité de réplication est appelée un
réplicon et il existerait 30000 réplicons dans le génome haploïde humain.

Figure 41 : Événements chronologiques de l’initiation de la réplication chez les eucaryotes.

128
La complexité de la réplication du chromosome eucaryotique est exacerbée par la
structure même de l’ADN. En effet ; celui-ci est constitué d’éléments de contrôle variés
comme indiqué par la figure suivante.

Figure 42 : Eléments de contrôle de la réplication chez les eucaryotes.

A l’instar des bactéries, les organismes eucaryotes possèdent plusieurs types d’ADN
polymérases; quelques unes sont impliquées dans la réplication de l’ADN mitochondrial.
La réplication du chromosome nucléaire requiert l’ADN polymérase alpha (α) associée à
l’ADN polymérase delta (δ). L’ADN polymérase alpha est formée de sous-unités multiples
avec des structures et des caractéristiques similaires dans toutes les cellules eucaryotes.
Une des sous- unités possède l’activité de la primase et la plus grande sous-unité
contient l’activité de la polymérase. Néanmoins, cette polymérase ne possède pas
l’activité de lecture d’épreuve de l’exonucléase 3’ 5’, ce qui veut dire qu’elle n’est pas
l’enzyme principale de la réplication. On croit que sa fonction essentielle est de
synthétiser des amorces pour les fragments d’Okazaki dans le brin discontinu. D’autre
part, l’ADN polymérase delta possède l’activité exonucléasique 3’ 5’ et synthétise
ainsi l’ADN des deux brins continu et discontinu en formant un complexe analogue à la
polymérase III dimérique des bactéries. Cette enzyme est aussi associée et stimulée par
une protéine PCNA (antigène nucléaire de prolifération cellulaire) qu’on trouve à des taux
élevés dans les noyaux des cellules en prolifération. Cette protéine a une structure et une
fonction similaires à la sous unité bêta (β) de la polymérase III de E. coli, formant une
pince circulaire autour de l’ADN et augmentant ainsi son activité catalytique. Une autre
polymérase, la polymérase epsilon (ε) remplace l’ADN polymérase delta dans quelques
situations, comme lors de la réparation de l’ADN. Cette polymérase peut aussi
fonctionner au niveau de la fourche de réplication, jouant ainsi un rôle analogue à celui de
la polymérase I en assurant l’hydrolyse des fragments d’Okazaki sur le brin discontinu.

129
La polymérase bêta (β) participe dans la réparation de l’ADN. Elle est constituée d’une
chaîne polypeptidique unique alors que la polymérase gamma (γ) est responsable de la
réplication de l’ADN mitochondrial. Ces deux dernières enzymes comme la polymérase
alpha n’ont pas d’activité nucléasique. Seuls alpha delta et gamma ont des activités
nucléasiques de lecteurs d’épreuves.
Deux autres complexes de protéines fonctionnent aussi dans la réplication des ADN des
cellules eucaryotes. RPA est une protéine qui s’attache à l’ADN simple-brin pendant la
réplication et qui a donc une fonction équivalente à celle de la protéine SSB de E.coli.
RFC fonctionne comme une pince qui accroche la PCNA et facilite l’assemblage de
complexes de réplications actives.
La linéarité des chromosomes eucaryotes pose un problème de terminaison. En effet, la
terminaison de la réplication sur ces chromosomes implique la synthèse de structures
appelées télomères aux extrémités des chromosomes.

130
 III. LES MUTATIONS

L’ADN peut être endommagé par une variété d’agents physiques et chimiques. Les bases
peuvent être altérées ou perdues, et la chaîne d’ADN peut être cassée. Ces mutations
peuvent donner naissance à des phénotypes pathologiques.
Les mutations de l’ADN peuvent être de différents types :

III.1. Les mutations ponctuelles

a). substitutions ou misappariements: c’est la mutation la plus commune. Elle se produit
quand une base est remplacée par une autre. Elle est appelée une transition quand une
purine est remplacée par une autre purine ou une pyrimidine est remplacée par une
pyrimidine. Elle est appelée une transversion quand une purine est remplacée par une
pyrimidine ou l’inverse, c’est-à- dire une pyrimidine est remplacée par une purine.
b). mutations silencieuses: dans ce cas, la mutation n’induit pas de changement d’acide
aminé à cause de la dégénérescence du code génétique.
c). mutation non-sens: la mutation aboutit à un codon de terminaison (Stop) qui provoque
la terminaison prématurée de la traduction d’une protéine.
d). addition ou délétion d’une base unique: c’est quand une seule base est ajoutée ou
délétée, ce qui provoque un décalage du cadre de lecture, aboutissant à la synthèse
d’une protéine complètement différente de la protéine du type sauvage.
Il existe d’autres mutations qui touchent des régions beaucoup plus étendues du
chromosome (mutations dans la structure) et d’autres qui touchent le nombre de
chromosomes ou même le niveau de ploïdie. Celles-ci sont appelées des anomalies ou
aberrations chromosomiques. Ces mutations peuvent être spontanées ou induites.

III.2. Les mutations spontanées

Les mutations spontanées peuvent être la conséquence de plusieurs types
d’évènements :
Elles peuvent être provoquées par des erreurs des enzymes pendant la réplication. La
fréquence de ces erreurs est très basse vu la grande fidélité des enzymes de réplication.
Elle est de l’ordre de 10-9-10-11. Ces mutations peuvent être ponctuelles ou peuvent être
des additions et des délétions.

131
-Les mutations ponctuelles sont dues à la tautomérisation des bases qui fait que ces
bases forment des liaisons hydrogènes différentes, ce qui donne naissance à des
mésappariements. Par exemple, pour les pyrimidines, la cytosine dans son état
tautomérique rare s’apparie avec l’adénine au lieu de la guanine et la thymine
tautomérisée s’apparie avec la guanine au lieu de l’adénine. Pour les purines, la forme
tautomérisée de la guanine s’apparie avec la thymine et la forme tautomérisée de
l’adénine s’apparie avec la cytosine.

Figure 43: Formes tautomériques des bases : Mésappariements de bases résultant de formes rares de
pyrimidines (a) et de purines (b).

-Les additions et délétions sont provoquées spontanément pendant la réplication quand

une boucle est formée dans un brin parental ou dans le brin nouvellement synthétisé,
généralement dans des régions où une des bases est répétée. Si la boucle est formée
dans le brin matrice, une délétion en résulte. Si, par contre, la boucle est formée dans le
brin nouvellement synthétisé, une addition en résulte.

132
Figure 44: Formation de mutants par addition et délétion de bases durant la réplication.

Elles peuvent être aussi le résultat de changements chimiques spontanés : la

dépurination et la désamination de bases particulières. Dans la dépurination, une purine,
l’adénine ou la guanine, est enlevée du brin d’ADN quand la liaison glycosidique entre le
sucre et la base est rompue.
NH2
N N O
- OH
O P O O
O N N
O- H H NH2 NH2
-
O P O O Adénine H H
- H H NH2 O H N N N
O +
H H
O H N - N O N N
O P O O
- N O O- H H
O P O O H H
OH H Adénine libéré
O- H H
H H de l'ADN
OH H
Figure 45: Dépurination d’un simple-brin d’ADN.

133
Des milliers de purines sont perdues en une génération dans une cellule de mammifère
en culture tissulaire. La désamination est l’enlèvement d’un groupe amine d’une base.
Comme exemple, la désamination de la cytosine donne l’uracile. L’ADN des procaryotes
et des eucaryotes contient une quantité relativement petite de la base modifiée 5-
méthylcytosine (5mC) à la place de la cytosine. La désamination de la 5mC donne la
thymine résultant en des transitions de CG à TA. Comme la thymine est une base
normale de l’ADN, il n’y a aucun mécanisme de réparation qui peut détecter et réparer
ces mutations. La localisation de 5mC dans le génome est appelée ainsi des «hot spots»
ou des régions chaudes car la fréquence des mutations dans ces régions est plus élevée
que la moyenne.

NH2 O

N NH

N O N O
H H

Cytosine Uracil

NH2 O

CH3
N désamination NH

N O N O
H H

5-méthylcytosine(5mC) Thymine
Figure 46 : Désamination de la 5mC en thymine.

Les mutations peuvent aussi être induites par des agents physiques ou chimiques. Ces
agents capables d’induire une mutation sont appelés des mutagènes et le processus est
appelé la mutagenèse.

134
III.3. Les mutations induites
Dans ce cas, des agents physiques et/ou chimiques sont impliqués dans la mutagenèse.

III.3.1. Les agents physiques

Les mutagènes physiques sont représentés par les rayons UV et les rayons X. Les UV
causent la formation des dimères de pyrimidines c‘est à dire la formation de deux liaisons
covalentes entre deux pyrimidines adjacents surtout entre deux thymines. Cette
dimérisation provoque la distorsion du brin touché à cause de l’impossibilité de la
formation de liaisons hydrogènes entre les bases complémentaires (fig).

O O O O
CH 3 UV CH 3 CH 3
H3C

HN NH NH
+

O N N O O N N O
H H H H H H H H

Thymine Thymine Dimère de thymine

Figure 47: Production de dimère de thymine par UV. Les deux composés du dimère sont liés de façon
covalente.

Les rayons X sont des radiations ioniques qui peuvent provoquer des cassures et des
réarrangements chromosomiques importants comme les inversions et les translocations
et d’autres dégâts comme des mutations ponctuelles.

III.3.2. Les agents chimiques

III.3.2.1. Les analogues de base
a) Le 5-bromouracil (5-BU) : c’est un analogue de la thymine donc il peut le remplacer
pendant la réplication. Son tautomère s’apparie avec la Guanine au lieu de l’Adénine, ce
qui cause une transition AT GC.
b) Le 2-aminopurine (2-AP) : c’est un analogue de l’adénine mais dans sa forme
tautomérique, il ressemble à la guanine et s’apparie ainsi avec la cytosine (fig). Il
provoque ainsi des transitions AT GC ou GC AT.

135
 H
H
O N

Br C N
H N C
N
C
C C
N
N
N O
H

5 - b ro m o u r a c il s e A d é n in e
c o m p o rte c o m m e (é ta t n o rm a l)
la th y m in e ; é ta t
n o rm a l

Figure 48: l’appariement de base de 5-bromouracil dans son état normal

O H O

C
N
Br H N C
N
C
C C
O N
N
N H
H N

H
5 -b ro m ouracil se G u an ine
co m porte com m e (état norm al)
la cy tosine; état
rare

Figure 49: l’appariement de base de la 5-bromouracil dans son état rare

T Ajouter 5BU T
A A

Replication 5BU 5 BU redevient 5BU C

De l’ADN A normal G G

Replication T
de l’ADN A

Figure 50: Changement d’une paire de base AT en GC

III.3.2.2. Les modificateurs de base

Ces agents agissent directement en modifiant directement la structure chimique ainsi que
les propriétés des bases.
a) L’acide nitreux (HNO2): il agit en désaminant la guanine, la cytosine et l’adénine. La
désamination de la guanine donne la xanthine qui s’apparie avec la cytosine, ce qui ne
donne aucune mutation. La désamination de la cytosine donne l’uracile qui s’apparie
avec l’adénine et cause une transition CG TA. La désamination de l’adénine donne
l’hypoxanthine qui s’apparie avec la cytosine et donne des transitions AT GC.

136
b) L’hydroxylamine (NH2OH) : Il réagit avec la cytosine en ajoutant un groupe hydroxyl
(OH) de façon à ce qu’il s’apparie avec l’adénine au lieu de la guanine induisant ainsi une
mutation CG TA.
c) les agents alkylants représentent le groupe le plus large de mutagènes. On en cite le
gaz moutarde, l’époxide, le diméthylsulfonate et le méthylméthane sulfonate (MMS). Ce
dernier introduit des groupes alkyls (-CH3, -CH2CH3) à certaines bases comme les
guanines et les thymines qui deviennent méthylées. Du coup, la guanine méthylée
s’apparie avec la thymine au lieu de la cytosine, donnant des transitions de GC AT
et une thymine méthylée s’apparie avec la guanine au lieu de l’adénine donnant des
transitions de TA CG.
O O
NH2

N
N
NH HNO2 ou NH
N
H
a c id e n itr e u x C
HN
N
N NH2 N O
N O
H
dr H
G u a n in e X a n th in e C y to s in e
H

NH 2 H
O H N
N

a c id e n itr e u x
N HNO 2 NH N NH

HN
HN N
O
O H

C y to s in e U ra c il A d é n in e
H

N H 2 O H H
N N
H C C
a c id e n itre u x N C

H N N N H N C
H N O 2
N N C C N
N O
rd O
dr
H
A d é n in e H y p o x a n th in e C y to sin e

H
OH
NH 2 H N H
H N N H

h y d r o x y la m in e
H N H N N
N H 2O H H N
N N dr
N
rd O rd O H

H y d r o x y a la m in o c y to s in e A d é n in e
C y to sin e

Figure 51: Mutations crées par changements structuraux des bases.

137
Les agents intercalaires : On en cite la proflavine, l’acridine orange, le bromure d’éthidium
et l’ICR-170. Ils agissent en s’intercalant entre deux bases adjacentes dans une ou les
deux chaînes de la double hélice d’ADN. Le résultat est une addition ou une délétion
suivant à ce que l’agent intercalaire s’insère dans la chaîne qui joue le rôle de matrice
pendant la réplication ou dans la chaîne nouvellement synthétisée.
CH3
H3C
NH2 N N N CH3
NH2

H3C

A B

Figure 52: Structure de la proflavine (A) et de l’acridine orange (B).

III.4. Réparation des mutations

L’excision des dimères de pyrimidine formés par l’exposition de l’ADN aux rayons UV
peut être réalisée par plusieurs systèmes de réparation.
Systèmes exempts d’erreur :

III.4.1. La photoréactivation
C’est un système qui utilise la lumière visible d’une longueur d’onde qui varie entre 320 et
370nm pour stimuler une enzyme spécifique appelée photolyase ou enzyme
photoréactivante (PRE) qui s’associe au dimère et provoque sa dissociation. La
photolyase est une enzyme ubiquitaire et apparemment très efficace puisque très peu de
dimères de thymines sont laissés non corrigés après son passage.

III.4.2. Réparation des lésions dues à des agents alkylants

Dans ce cas, des systèmes de réparation spécifiques interviennent. On prend comme
exemple, une enzyme codée par le gène «ada» appelée 6-méthyl-guanine méthyle
transférase, qui reconnaît le 6-méthyl-guanine dans l’ADN et enlève le groupe méthyle, le
changeant à sa forme originale.

138
III.4.3. Réparation par excision
C’est le mécanisme le mieux connu parmi les mécanismes de réparation. Il a été
découvert en 1964 par Setlow et Carrier. Les dimères de pyrimidine bloquent la
réplication et l’expression des gènes. Un complexe enzymatique codé par uvrABC
détecte la distorsion créée par le dimère de thymine. Ce complexe enzymatique, appelé
excinucléase est une endonucléase qui coupe des deux côtés de la lésion de 8
nucléotides du côté de 5’ et de 4 nucléotides du côté de 3’. Le résultat est l’excision d’un
fragment d’ADN de 12 pairs de bases et le vide est rempli par la polymérase I et liés par
la ligase.

Figure 53: Réparation par excision mettant en jeu un système multi-enzymatique.

139
Ce système opère seulement dans l’obscurité et est appelé système «dark repair». Il
répare non seulement les dimères de thymine mais toute lésion qui crée une distorsion
dans l’ADN comme celles qui sont créées par l’aflatoxine B (AFB) et les époxydes de
benzopyrène. Ce système existe dans la plupart des organismes étudiés jusqu’à
maintenant. Chez la levure et les mammifères 12 gènes sont connus qui codent des
protéines impliquées dans le système de réparation par excision. Des mutations dans ces
gènes qui donnent des enzymes de réparation défectueuses peuvent être à l’origine de
maladies graves, comme la Xérodermie pigmentée. C’est une maladie à transmission
autosomique récessive causée par une déficience dans l’un des gènes codant pour les
protéines du système d’excision. Les symptômes cliniques de cette maladie montrent
l’importance des systèmes de réparation de l’ADN. La peau est très sensible à la lumière
du soleil ou UV. Des ulcérations sur la peau et autour de la cornée de l’œil commencent à
apparaître dès l’enfance. Ces ulcérations peuvent donner le cancer de la peau et les
malades meurent en général avant l’âge de trente ans à cause des métastases.

III.4.4. Réparation par les ADN glycosylases

Chaque cellule possède une classe d’enzymes appelées «ADN glycosylases» qui
reconnaissent des lésions d’ADN communes comme les produits de la désamination de
l’adénine et la cytosine. Ces enzymes clivent la liaison N-glycosidique entre le sucre et la
base libérant ainsi la base altérée et créant un site apurinique ou apyrimidique AP. Celui-
ci est ensuite réparé par une AP endonucléase. On trouve plusieurs sortes de
glycosylases : uracile glycosylase, par exemple, qu’on trouve dans la plupart des cellules,
enlève de l’ADN l’uracile altéré. Cette glycosylase n’enlève pas des uraciles altérés de
l’ARN ou des thymines de l’ADN. Son action est très spécifique. D’autres ADN
glycosylases reconnaissent et enlèvent l’hypoxanthine et les bases alkylées comme la 3-
méthyladénine et la 7-méthylguanine. Des glycosylases qui reconnaissent des dimères
de pyrimidines ont été aussi identifiées. Il faut noter que des sites apuriniques sont aussi
générées par une mutation spontanée, une hydrolyse lente des liaisons N-glycosyle.

III.4.5. Réparation post-réplicative ou prône à l’erreur

Les systèmes de réparation par excision fonctionnent quand un seul des deux brins
d’ADN est endommagé. L’autre brin peut alors agir comme matrice pour réparer le brin
endommagé. Cependant, quand les deux brins sont endommagés créant des cassures

140
de l’ADN double brin, ou quand l’ADN est simple brin, la cellule doit recourir à d’autres
mécanismes de réparation.
Deux systèmes peuvent entrer en jeu.

a). Réparation par recombinaison génétique homologue

Dans ce système la région où se trouve la lésion est appariée au chromosome
homologue avec lequel un échange de fragments s’effectue appelé recombinaison
génétique homologue d’où un échange d’informations pour réparer le vide. Ce modèle
de recombinaison a été proposé en 1964 par Holliday. Dans ce modèle, deux duplexes
homologues sont alignés. Un des brins d’un duplexe et le brin correspondant de l’autre
duplexe sont coupés par une endonucléase. L’extrémité de chaque brin coupé quitte son
propre duplexe et se déplace vers l’autre duplexe. Les brins des deux différents duplexes
sont ensuite joints l’un à l’autre pour former un intermédiaire de recombinaison qui est
dynamique. L’échange de brins peut continuer, permettant le déplacement du crossing-
over, un processus appelé migration de branche ou «branch migration». Cet
intermédiaire peut être ensuite clivé et rejoint de deux façons différentes pour donner
deux produits de recombinaison différents (voir figure).
Le processus de recombinaison homologue chez E. coli dépend des gènes rec. La
protéine RecA, produit du gène recA, catalyse la réaction d’assimilation de brins avec
l’hydrolyse d’un ATP. Le produit de la réaction est un simple brin déplacé et un double-
brin, ayant la forme de la lettre D, d’où l’appellation de structure de D-boucle. Le
fonctionnement de cette protéine est le suivant: la protéine recA s’attache à une région
d’ADN simple brin. Un filament de molécules recA s’enroule autour de l’ADN simple brin
avec un monomère de recA par 4 nucléotides. Ce filament recA-simple brin d’ADN se lie
ensuite à l’ADN double brin. La protéine recA se déplace le long de l’ADN double brin
pour trouver une séquence complémentaire à celle de l’ADN double brin. L’ADN double
brin est en partie déroulé pour faciliter la lecture de sa séquence de base. Quand une
séquence complémentaire est trouvée, le duplexe est déroulé encore plus pour permettre
un changement de pair de base. Quand l’ADN simple brin est apparié avec le brin
complémentaire du duplexe ciblé. Une fois initiée de cette façon, l’échange de brins
continue, un processus appelé «branch migration» Les actions de recombinaison de la
recA sont aidées par l’hydrolyse de l’ATP. Le filament recA a une polarité de 5’ à 3’. Cette
unidirectionalité va permettre à l’ADN simple brin de dépasser les régions endommagées
du duplexe qui ne lui sont pas complémentaires.

141
L’hydrolyse de l’ATP aide le «branch migration» en enroulant l’ADN duplexe autour du
filament. La recombinaison requiert que l’ADN invasif soit simple brin. Les études ont
montré que les gènes recB , recC et recD sont importants pour la recombinaison. Ils
codent des protéines qui forment un complexe recBCD de 328Kd. Le recB catalyse le
déroulement de l’ADN doublet-brin avec l’hydrolyse de l’ATP la recD est une nucléase. Le
complexe s’attache à une extrémité de l’ADN double brin linéaire et le déroule à un taux
de 300 nucléotides par seconde.
Le clivage se fait à une séquence appelée chi. 5’GCTGGTGG3’

b). Réparation par le système SOS

Il est stimulé quand l’exposition aux rayons UV est très forte et que les systèmes
d’excision sont saturés et n’arrivent pas à réparer tous les dimères de pyrimidine. Ce
système dépend d’une protéine RecA qui, activée par la présence de dimères, stimule
l’auto-clivage d’un répresseur de 17 gènes: le LexA. Le clivage de ce dernier l’inactive et
stimule l’expression des 17 gènes qu’il réprime. Les protéines codées par ces gènes sont
donc exprimées à un niveau élevé. Parmi eux, les protéines UvrA , UvrB impliquées dans
les systèmes de réparation par excision. Une autre protéine, UmuD est clivée en une
forme plus courte, UmuD’, qui forme un complexe avec UmuC pour créer la polymérase
V. Cette dernière enzyme est capable de répliquer sans enlever les dimères de
pyrimidine, mais avec un niveau élevé d’erreurs. Une autre enzyme, dont le gène dinB
est stimulé par ce système, est produite. C’est la polymérase IV qui réplique avec une
fréquence élevée d’erreurs. Ce système est donc hautement mutagène, ce qui tue les
cellules parfois. Seulement, il est nécessaire à cause du fait que c’est un système
d’urgences où la cellule est en condition de désespoir.

c). Système de réparation mismatch

Ce système opère après la réplication chez E. coli pour réparer les erreurs dues à la
réplication. Il augmente ainsi la fidélité de réplication par un facteur de 102 à 103. Ce
système doit distinguer entre la matrice et le brin d’ADN nouvellement synthétisé. Cela
est accompli grâce à une protéine, la Dam méthylase, codée par le gène dam, et qui
méthyle toutes les adénines d’une séquence 5’GATC3’ chez E. coli dans la chaîne
matrice. Ceci est accompli pendant une période de temps très courte après la réplication.
La réparation des erreurs mismatch du brin nouvellement synthétisée se fait toujours
dans le voisinage de la séquence GATC jusqu’à une distance maximale de 1000 paires

142
de base de cette séquence. Le fonctionnement de ce système chez E. coli est sous
l’influence de trois gènes: mutS, mutL et mutH comme suit:
-la protéine MutL forme un complexe avec MutS qui s’associe aux paires de bases
misappariées (sauf C-C).
-la protéine MutH s’associe avec la protéine MutL du complexe MutS-MutL et à toutes les
séquences GATC rencontrées par le complexe.
-l’ADN des deux côtés du mismatch est ramené de façon à former une boucle.
-à ce stade, MutH agit comme une endonucléase qui clive le brin non méthylé à
l’extrémité 5’ de GATC.

Figure 54 : Mécanisme de réparation mismatch.

Si le mismatch est du côté 5’ du site de clivage, le brin non-méthylé est déroulé par une
hélicase. II et dégradé dans la direction 3’ 5’ par l’exonucléase I ou l’exonucléase X.

143
Le segment dégradé est remplacé par la polymérase I et ensuite lié au reste de l’ADN par
la ligase. Le même mécanisme opère si le mismatch est du côté de 3’ du site de clivage
sauf que l’exonucléase est remplacée par l’exonucléase VII (qui dégrade l’ADN simple
brin dans la direction 5’ 3’ ou 3’ 5’) ou la nucléase RecJ (qui dégrade l’ADN simple
brin dans la direction 5’ 3’.
Toutes les cellules des organismes eucaryotes possèdent des protéines structurellement
et fonctionnellement analogues aux protéines MutS et MutL des bactéries. Cependant, le
mécanisme détaillé n’est pas encore connu.

III.5. Le test de Ames

Chez les mammifères, il existe une forte corrélation entre les mutations et le cancer. Pour
cela, on a développé un test qui peut détecter l’effet mutagène de certains produits. Ce
test, développé au début des années 1970s par Bruce Ames, utilise la bactérie
Salmonella typhimurium. Deux souches sont utilisées toutes les deux auxotrophes pour
l’histidine. L’une des deux souches est auxotrophe pour l’histidine à cause d’une mutation
ponctuelle et l’autre à cause d’une mutation frameshift. Dans ce test, des foies de rat sont
homogénéisés et centrifugés pour sédimenter les débris cellulaires. Les enzymes du foie
de rat dans le surnageant sont ajoutées à la culture liquide de Salmonella typhimurium,
avec l’agent chimique à tester. Ces enzymes sont ajoutées parce qu’elles peuvent jouer
un rôle dans la toxification d’agents chimiques, y compris des mutagènes potentiels.
Dans l’expérience 1, on utilise la souche qui porte une mutation ponctuelle, et dans
l’expérience 2, on utilise la souche qui porte la mutation frameshift (décalage du cadre de
lecture). En même temps, deux expériences contrôle sont fait sans le mutagène potentiel,
l’une avec la souche qui porte la mutation ponctuelle et l’autre avec la souche qui porte
un changement dans le cadre de lecture. Le mélange est ensuite versé dans un milieu
de culture ne contenant pas d’histidine. Les boîtes de Pétri sont ensuite incubées et
examinées pour la présence de colonies qui survivent sur un milieu qui ne contient pas
de histidine, ce qui veut dire qu’elles ont subi une inversion de la mutation et sont
devenues His+. Si la proportion de colonies qui ont subi une inversion est
significativement plus élevée dans les boîtes où on a mis le produit chimique que dans
les boîtes contrôle, le produit chimique est donc un mutagène. Le nombre de colonies sur
la boîte de contrôle représente les colonies qui ont subi des mutations spontanées. Le
test de Ames a identifié jusqu’à ce jour un grand nombre de mutagènes comme les
teintures de cheveux et les colorants nutritionnels naturels et synthétiques.

144
 IV. TRANSCRIPTION
SYNTHESE D’ARN A PARTIR DE MATRICES D’ADN

La transcription est le transfert d’informations d’une matrice double-brin à une molécule

d’ARN simple-brin. La traduction est la conversion dans la cellule d’une séquence de
bases d’un ARN messager (ARNm) en une séquence d’acides aminés d’un polypeptide.
A l’inverse de la réplication de l’ADN qui se produit seulement pendant une période du
cycle cellulaire (surtout chez les eucaryotes), la transcription et la traduction sont
généralement faits à travers tout le cycle cellulaire (même si ils sont réduits pendant la
phase M du cycle cellulaire).
En 1956, Crick a donné le nom de dogme central de la biologie moléculaire au processus
de transcription suivi par la traduction qui est le suivant :

transcription traduction
ADN ARN protéines
Transcriptase inverse (chez certains virus)

Il existe trois types d’ARN : l’ARNm, l’ARNt et l’ARNr.

L’unité de l’ARN est le ribonucléotide formé de trois éléments : a) le sucre qui est le
ribose , b) la base et c) le groupe phosphate.
O

NH

N O
O

-O P O
O

O- H H

H H
OH OH

Figure 55 : Structure d’un ribonucléotide

On remarque que la structure de l’ARN est très similaire à celle de l’ADN sauf que le
sucre est le ribose au lieu du désoxyribose et la base uracile remplace la thymine. L’ARN
est aussi simple brin en général avec des régions à structure double brin : les épingles.
Ces régions double brin peuvent former jusqu’à 50% de la molécule d’ARN.

145
Les cellules contiennent différents types d’ARN. L’ARN messager est la matrice pour la
synthèse de protéines. Une molécule d’ARN est produite pour chaque gène ou groupe de
gènes exprimés. Donc, l’ARNm est une classe très hétérogène de molécules. Chez E.
coli, la longueur moyenne d’un ARNm est de 1,2Kb. L’ARN de transfert (ARNt) porte des
acides aminés en une forme activée au ribosome pour la formation d’une liaison
peptidique. Il existe au moins un ARNt pour chacun des 20 acides aminés. L’ARNt
consiste de à peu pré 75 nucléotides qui le rend le plus petit des molécules d’ARN.
L’ARNr (ribosomal) est le composé majeur des ribosomes, mais son rôle précis dans la
synthèse des protéines n’est pas encore connu. Chez E. coli, il existe trois types d’ARNr,
appelés 23S, 16S et 5S ARN à cause de leur comportement pendant la sédimentation.
Chaque ribosome contient une molécule de ces trois types d’ARNr. L’ARNr est le plus
abondant. L’ARNt vient après et ensuite l’ARNm, qui constitue seulement 5% de l’ARN
total. Les cellules eucaryotes contiennent des petites molécules d’ARN additionnelles,
comme les molécules d’ARNsn ou petites nucléaires, qui participent dans l’épissage des
exons. Une petite molécule d’ARN dans le cytosol joue un rôle dans le ciblage des
protéines nouvellement synthétisées.

IV.1. L’ARN messager

Le concept d’ARN messager a été formulé par François Jacob et Francis Monod en
1961. Ils ont préconisé la présence d’un intermédiaire qui fait passer le message du
noyau dans lequel on trouve les gènes au cytoplasme, le site de synthèse des protéines.
Les points les plus importants sont venus de leur expérience sur l’induction d’un système
enzymatique par la présence du lactose. Ils ont proposé le concept du messager avec les
propriétés suivantes:
1). Le messager doit être un polynucléotide.
2). La composition de base du messager doit être similaire à celle de l’ADN qui le
spécifie.
3). Les messagers doivent être de tailles différentes car les gènes ou les groupes de
gènes sont de tailles différentes.
4). Le messager doit être associé de façon transitoire avec les ribosomes, les sites de
synthèse de protéines.
5). Le messager doit être synthétisé et dégradé rapidement.

146
Après avoir énoncé le concept d’ARN messager, une expérience réalisée par Brenner,
Jacob et Messelson a prouvé son existence. Leur étude faite sur des cellules d’E. coli
infectées par le bactériophage T2 a montré qu’une fraction mineure d’un ARN avec une
demi-vie de courte durée apparaît juste après l’infection. Les bactéries ont été cultivées
dans un milieu contenant des isotopes lourds (N15 et C13), ensuite elles ont été infecté par
les phages et transférés dans un milieu contenant des isotopes légers (N14 et C12).
Les ribosomes synthétisés avant et après l’infection sont séparés par la technique de
centrifugation sur gradient de densité à cause de la différence dans leurs densités
(lourdes et légères). En plus, l’ARN nouveau a été marqué par le P32 ou C14-uracile et les
protéines nouvellement synthétisées par S35. Les résultats montrés par la courbe ci-
dessous montrent que:

1). Les ribosomes ne sont pas synthétisés après l’infection, ce qui est montré par
l’absence de ribosomes «légers».
2). L’ARN est synthétisé après l’infection. La plupart de l’ARN marqué se trouve dans le
pic des ribosomes «lourds». Donc, il est associé avec les ribosomes préexistants et non
pas nouvellement synthétisés.
3). L’isotope S35 est apparu dans le pic des ribosomes «lourds», ce qui a montré que les
protéines nouvellement synthétisées existent le sont dans des ribosomes préexistants.

147
Ces expériences ont montré que les ribosomes sont des structures non spécialisées, qui
synthétisent, à un certain temps, des protéines dictées par le message qu ‘ils
contiennent.
En 1961, Sol Spiegelman a développé une technique dénommée hybridation moléculaire
en menant l’expérience suivante :
1). Un échantillon d’ARNm de T2 a été marqué par le P32. L’ADN de T2 marqué avec H3
est préparé séparément.
2). Un mélange d’ARNm et d’ADN de T2 est chauffé jusqu’à 100°C, ce qui aboutit à la
dénaturation de la double hélice d’ADN en simple brin. Cette solution d’ADN et d’ARN
simple brin a été refroidi lentement à la température ambiante.
3). Le mélange refroidi est ensuite analysé par centrifugation sur gradient de densité.
Le résultat de l’expérience a révélé trois bandes. La plus dense est constituée de l’ARN
simple brin. La deuxième contient de l’ADN double brin. La troisième contient des
molécules hybrides d’ADN et d’ARN à côté de la bande d’ADN double brin. Ainsi, l’ARNm
de T2 a formé un hybride avec l’ADN de T2. D’autres expériences ont montré que l’ARNm
ne s’hybride pas avec l’ADN dérivé d’une variété de bactéries et d’autres organismes.
Ces expériences ont révélé que la séquence de bases de l’ARNm est complémentaire à
celle de l’ADN matrice.
La technique d’hybridation a permis de démontrer que les l’ARNr et l’ARNt sont aussi
synthétisés en utilisant une matrice d’ADN. Les hybrides ADN-ARN ou ADN-ADN sont
retenus par un filtre de nitrocellulose alors que les ADN ou ARN simple-brin ne le sont
pas. Plusieurs types d’ARN marqués par le P32 ont été ajouté à de l’ADN non marqué de
la même espèce. Ces mélanges sont chauffés, ensuite refroidis lentement, puis filtrés à
travers le filtre de nitrocellulose. La radioactivité retenue par le filtre a été mesurée. Les
résultats ont montré que des hybrides sont formés avec les trois types d’ARNr, et avec
l’ARNt, montrant que ces molécules contiennent des séquences complémentaires à ces
molécules d’ADN qui sont présentes dans le génome de E. coli.

VI.2. L’ARN polymérase d’E. coli

L’ARN polymérase, l’enzyme qui synthétise l’ARN à partir d’une matrice d’ADN a été
découverte indépendamment en 1960 par deux chercheurs: J. Hurwitz et S. Weiss. Cette
enzyme requiert la présence des composés suivants :
1). Une matrice. La matrice préférée est l’ADN double-brin mais l’ADN simple-brin peut
agir comme matrice. L’ARN, ou l’hybride ARN-ADN ne sont pas des matrices efficaces.

148
2). Des précurseurs activés. Tous les quatre nucléosides triphosphates: ATP, GTP, UTP,
et CTP doivent être présents.
3). Les ions divalents Mg++ et Mn++ sont efficaces, mais les ions Mg++ sont requis in vivo.
4). L’ARN polymérase catalyse l’initiation et l’élongation de chaînes d’ARN. La réaction
de catalyse est la suivante :
(ARN)n+ NTP (ARN)n+1 +PPi

La synthèse d’ARN ressemble beaucoup à celle d’ADN.

1° La direction de synthèse est de 5’ à 3’. 2°. Le mécanisme d’élongation est le même. Le
groupe 3’OH produit une attaque nucléophilique sur le phosphate interne d’un nucléoside
triphosphate. 3° La synthèse est commandée par l’hydrolyse du pyrophosphate. D’autre
part, l’ARN polymérase ne requiert pas une amorce. Une autre différence est que l’ARN
polymérase ne possède pas l’activité nucléasique de lecture d’épreuves que possède
l’ADN polymérase.
L’ARN polymérase de E. coli est une holoenzyme de 450kd qui est formée de 6 sous
unités: α2ββ’ωσ. La sous unité σ s’attache au site promoteur où la transcription débutera.
Une fois la synthèse de l’ARN est initiée, cette sous-unité se dissocie du reste de
l’enzyme. L’ARN polymérase démunie de cette sous-unité est appelée enzyme «core»
qui catalyse la réaction de synthèse de l’ARN. La sous-unité β’ s’attache à la matrice, et
la sous-unité β aux précurseurs de ribonucléosides triphosphates. L’ARN polymérase a
plusieurs fonctions:
1). Elle cherche les sites d’initiation. Il existe 2000 sites promoteur dans le génome d’E.
coli de 4x106 paires de base.
2). Elle déroule un petit segment d’ADN double-brin qui servira de matrice pour la
transcription.
3). Elle sélectionne le ribonucléoside triphosphate correcte et catalyse la formation d’une
liaison phosphodiester. Cette enzyme a une potence catalytique très élevée, ce qui lui
permet de synthétiser un transcrit du début à la fin.
4). Elle détecte des signaux de terminaison qui spécifient la fin de la transcription.
5). Elle interagit avec les répresseurs et les activateurs qui modulent le taux de
transcription. La régulation des gènes se fait surtout au niveau de la transcription.

149
IV.3. Transcription chez les procaryotes
La transcription se fait en trois étapes: l’initiation, l’élongation et la terminaison.

IV.3.1. L’initiation
L’ADN matrice contient des régions appelées sites promoteurs qui se lient spécifiquement
à l’ARN polymérase et déterminent le début de la transcription. Ces sites ont été identifiés
de la façon suivante:
On ajoute l’ARN polymérase, ensuite l’ADNase à l’ADN matrice. En l’absence de
ribonucléosides triphosphates, l’ARN polymérase reste attachée aux promoteurs et les
protège de la digestion par l’ADNase. Des fragments de 60 paires de base sont produits
après une digestion extensive. La position et la séquence de ces fragments sont ensuite
étudiées. Chez les bactéries, trois promoteurs sont identifiés: la boîte Pribnow, qui
possède la séquence consensus 5’TATAAT3’ et centré à –10. La deuxième séquence,
appelée séquence –35, a la séquence consensus 5’TTGACA3’. Une troisième séquence
riche en AT, appelée UP (upstream promoter), ou promoteur en amont, se trouve entre
les positions -40 et –60 dans les promoteurs de certains gènes hautement exprimés.
L’élément UP se lie à la sous-unité α de l’ARN polymérase. Le premier nucléotide est en
général une purine.
Chez les eucaryotes, un site promoteur similaire à la boîte Pribnow existe à –30. Cette
séquence, appelée boîte TATA ou boîte Hogness, a pour consensus TATAAA. Les
promoteurs eucaryotes exhibent aussi une boite CAAT centrée à –75 mais qui peut
exister dans d’autres régions chez certains gènes. Elle possède une séquence
consensus 5’-GGCCAATCT-3’. La boîte GC a la séquence consensus 5’ GGGCGG3’ qui
peut exister en plusieurs copies dans un promoteur et peut fonctionner dans les deux
orientations. Cette boîte existe surtout dans les gènes constitutifs et peut aider
l’attachement de l’ARN polymérase à côté du point d’initiation de la transcription. Des
séquences «enhancers» existent aussi qui peuvent opérer à distance en amont ou en
aval du site d’initiation et qui stimulent la transcription.
L’efficacité avec laquelle l’ARN polymérase s’attache à un promoteur pour initier la
transcription dépend beaucoup sur les séquences consensus, la distance entre eux et la
distance qui les sépare du site d’initiation de la transcription. Les promoteurs forts
causent des initiations fréquentes chaque deux secondes chez E. coli et possèdent des
régions –10 et –35 qui correspondent très fortement à la séquence consensus.

150
Les promoteurs faibles ont des substitutions multiples dans leur séquence consensus. La
fréquence de la transcription qui dépend de ces promoteurs faibles peut aller jusqu’à une
fois chaque 10 minutes. La distance entre ces séquences conservées est importante,
avec une distance optimale de 17 nucléotides. Aussi, les protéines régulatrices peuvent
influencer fortement la fréquence de la transcription.
L’attachement de l’ARN polymérase au promoteur se fait en deux étapes: la première
étape consiste à un faible attachement à la région –35 du promoteur pendant que l’ADN
est toujours double-brin. La deuxième étape implique un changement d’un attachement
faible à un attachement plus fort entre l’ARN polymérase et l’ADN. Ce changement est
accompagné par un déroulement local d’à peu pré 17 paires de base autour de la région
–10, ce qui est équivalent à deux tours d’hélice de l’ADN. Une fois que l’ARN polymérase
s’attache à cette région, elle est correctement orientée pour initier la transcription (fig).
Le facteur sigma (σ) est essentiel pour la reconnaissance de la séquence promotrice
sans lequel aucune initiation efficace de la transcription n’est possible. En fait, il existe
plusieurs facteurs sigma différents chez E. coli qui jouent un rôle important dans la
régulation de l’expression des gènes. Chaque facteur sigma s’associe à l’enzyme «core»
et lui permet de reconnaître un promoteur spécifique. La plupart des promoteurs avec les
séquences consensus discutées ci-dessus sont reconnus par un facteur sigma de poids
moléculaire 70000 da, appelé σ70. Sous des conditions extrêmes, comme la chaleur, la
quantité d’azote limitée et l’infection avec des virus, des facteurs sigma différents
s’attachent à l’ARN polymérase «core» qui s’associent à des promoteurs différents pour
stimuler la transcription de gènes spécifiques en réponse du stress.
La plupart des chaînes d’ARN nouvellement synthétisées commencent par pppG ou
pppA. Ceci a été découvert en marquant le phosphore en position gamma (γ) de l’ATP
avec le P32 dans un mélange d’incubation synthétisant l’ARN. Cet ATP a été détecté dans
la chaîne d’ARN, signifiant ainsi que le nucléotide terminal est un pppA.

IV.3.2. L’élongation
La dénaturation de l’ADN dans la région de synthèse de l’ARN forme une bulle de
transcription qui contient toujours 17 paires de base déroulées (fig). Après la transcription
de 8 ou 9 nucléotides d’ARN, le facteur sigma quitte la polymérase et peut être utilisé
dans d’autres réactions d’initiation. Dans la région de dénaturation de l’ADN, quelques
bases d’ARN sont liées à l’ADN et forment un hybride ADN-ARN d’une longueur de 12pb
alors que le reste de l’ARN est déplacé loin de l’ADN.

151
La vitesse de transcription moyenne est de 30-50 nucléotides /seconde. Comme pour la
réplication de l’ADN, la tension créée par le déroulement de l’ADN est libérée par la
topoisomérase II. La transcription se fait toujours dans la direction 5’ 3’, comme dans la
synthèse de l’ADN. Ce fait est montré par l’expérience suivante: quand on utilise le GTP
ou l’ATP marqué avec le γP32 comme substrat dans un milieu d’incubation qui synthétise l
‘ARN, on trouve que le rapport de l’incorporation de P32 sur le total des nucléotides
incorporés est le plus élevé juste après le mélange des composés puis diminue
progressivement.
Il est à noter que puisque l’ARN polymérase ne possède pas d’activité nucléasique, la
fidélité de transcription est moindre que celle de l’ADN polymérase. Le taux d’erreur de la
synthèse d’ARN est de 1/104 ou de 1/105. Ce taux d’erreur plus élevé que celui de l’ADN
polymérase est toléré parce qu’il n’est pas hérité par la progéniture. En plus, il y a
plusieurs transcrits d’un même gène qui ne contiennent pas tous des erreurs.

IV.3.3. La terminaison
La phase de terminaison est aussi précisément contrôlée que l’initiation. L’arrêt de la
transcription dépend de la présence de signaux de terminaison. On distingue au moins
deux classes de signaux chez E. coli. La première classe ne dépend pas d’une protéine
appelée ρ et la deuxième classe dépend de cette protéine.
Terminaison-indépendante de la protéine ρ.
La première classe est la plus simple. C’est une région palindromique riche en GC suivie
par une région riche en AT. Le transcrit d’ARN contenant une région auto-
complémentaire va former une structure en épingle stable à cause de sa richesse en GC.
Cette structure est suivie par quatre ou plus de U. Elle va contribuer à la terminaison de
la transcription de la façon suivante :

1). Il est probable que l’ARN polymérase ralentit quand elle rencontre la structure en
épingle.
2). L’hybride ADN-ARN qui se trouve après la structure en épingle est instable à cause de
son contenu en A-U pairs de base.
3). Donc, il y aura dissociation de l’ARN de sa matrice d’ADN et ensuite de l’enzyme.
L’ADN double brin se reformera dans la région de la bulle de transcription après la
libération de l’ARN nouvellement synthétisée. L’enzyme «core» a beaucoup moins
d’affinité pour l’ADN double-brin que pour l’ADN simple brin, d’où son détachement.

152
Figure 56 : Etapes d’initiation et d’élongation de la transcription.

Terminaison- dépendante de la protéine Rho

Pour certains gènes, la terminaison de la transcription dépend de la présence d’un
facteur additionnel: la protéine Rho. Ceci a été démontré par le fait que certains ARN
synthétisées in vitro par l’ARN polymérase seule sont plus longues que celles
synthétisées in vivo du même gène. Par exemple, l’ARN synthétisé de l’ADN du phage
filamenteux M13 en la présence de «ρ» a un coefficient de sédimentation de 10S alors
que celui qui est synthétisé en son absence a un coefficient de sédimentation de 23S.

153
Une information additionnelle sur l’action de «ρ» a été obtenue en ajoutant ce facteur de
terminaison à un mélange d’incubation à des temps variables après l’initiation de la
transcription. On a obtenu de l’ARN de 13S, 17S, et 23S après l’addition de ρ quelques
secondes après le début de la transcription, deux minutes et 10 minutes respectivement
(fig). Ce résultat indique que l’ADN contient trois sites de terminaison qui répondent à ρ et
un site de terminaison qui ne répond pas à ρ.
Le mécanisme par lequel ρ provoque la terminaison de la synthèse est indiqué par le fait
que cette protéine hydrolyse l’ATP en présence d’ARN simple brin mais pas en la
présence de l’ADN ou l’ARN double-brin. Rho est un hexamère autour duquel un
fragment d’ARN simple brin de 72 nucléotides s’enroule. Elle possède une activité
ATPasique qui lui permet de se déplacer de façon unidirectionnelle au long de l’ARN
jusqu’à arriver à la bulle de transcription. Elle dissocie ensuite l’hybride ADN-ARN en
déplaçant l’ARN loin de l’ADN. D’autres protéines chez E. coli ont été découvertes qui
provoquent la terminaison de la transcription. Par exemple, la protéine nusA permet à
l’ARN polymérase d’E. coli de reconnaître une classe spécifique de sites de terminaison.

IV.3.4. Modifications post-transcriptionnelles

Chez les procaryotes, les molécules d’ARNm subissent très peu ou aucune modification
post-transcriptionnelle. En fait, la plupart sont traduites pendant la transcription.
Cependant, l’ARNr et l’ARNt sont produits par clivage et modification de l’ARN natif. Par
exemple, chez E. coli, trois types d’ARNr et un type d’ARNt sont produits par le clivage
d’ARN primaire qui contient aussi des espaces «spacers». D’autres transcrits primaires
contiennent plusieurs types d’ARNt ou plusieurs copies d’un même ARNt . Les nucléases
qui clivent ces molécules primaires d’ARN sont hautement précises.
Un deuxième type de modification est l’addition de nucléotides aux extrémités de
certaines chaînes d’ARN. Par exemple, un CCA est ajouté à l’extrémité 3’ des molécules
d’ARNt qui ne possèdent pas encore cette extrémité.
Un troisième type de modification est celui de bases et du ribose des molécules d’ARNr.
Chez les procaryotes, certaines bases sont méthylées, alors que chez les eucaryotes le
groupe 2’-OH de 1/100 riboses est méthylé. Des bases étranges sont présentes dans
toutes les ARNt, comme le pseudouridylate et ribothymidylate. Ces modifications
génèrent de la diversité.

154
IV.4. Transcription chez les eucaryotes
Chez les eucaryotes, on trouve trois types d’ARN polymérases qui diffèrent dans la
spécificité de la matrice, la localisation et la susceptibilité aux inhibiteurs. L’ARN
polymérase I est localisée dans le nucléole, et elle transcrit une série de gènes pour
l’ARNr 18S, 5,8S et 28S. L’ARNr 5S et tous les ARNt sont synthétisés par l’ARN
polymérase III, qui est localisée dans le nucléoplasme. Les précurseurs de l’ARNm sont
synthétisés par la polymérase II, localisée aussi dans le nucléoplasme. Plusieurs d’autres
petites molécules comme le U1sn ARN de l’épissage sont aussi synthétisées par l’ARN
polymérase II.

IV.4.1. Les facteurs de transcription de base

L’ARN polymérase II a été étudiée de façon extensive. Elle est beaucoup plus complexe
que celle des procaryotes. Elle est constituée de 12 sous-unités et ne peut pas transcrire
in vitro sans l’intervention de certaines protéines appelées les facteurs de transcription de
base (TFII) avec lesquelles elle forme un complexe de transcription. Ces facteurs de
transcription sont hautement conservés parmi les eucaryotes. La transcription est divisée
en quatre phases : l’assemblage, l’initiation, l’élongation et la terminaison.
L’assemblage :
La formation d’un complexe fermé commence quand la protéine TBP (TATA binding
protein) s’associe à la boîte TATA; le TBP est ensuite lié par le facteur de transcription
TFIIB qui se lie aussi à l’ADN des deux côtés de TBP. L’association de TFIIA qui n’est
pas essentielle, peut stabiliser le complexe TFIIB-TBP surtout sur des promoteurs non-
consensus où l’association de TBP avec l’ADN est faible. Un autre complexe, formé de
TFIIF et l’ARN polymérase II s’associe avec celui-là. En interagissant avec le TFIIB, le
TFIIF aide l’ARN polymérase II à trouver ses promoteurs. Finalement, le TFIIH et le TFIIE
s’associent pour former un complexe fermé. Le TFIIH agit comme une hélicase qui va
dérouler l’ADN pour initier la transcription créant ainsi un complexe ouvert.
L’initiation
TFIIH possède une fonction supplémentaire pendant l’initiation. Elle possède une activité
de kinase qui phosphoryle le terminal carboxyle de l’ARN polymérase II qui causera un
changement de conformation du complexe et stimulera ainsi l’initiation de la transcription.
Après 60-70 nucléotides d’ARN, le TFIIE et le TFIIH quittent le complexe et marquent
ainsi le début de la phase d’élongation.

155
Elongation, terminaison et libération. TFIIF reste associé à l’ARN polymérase II pendant
toute la phase de l’élongation. L’activité de l’ARN polymérase II est renforcée par des
facteurs d’élongation. Une fois le transcrit est complété, la terminaison de la transcription
se fait par des mécanismes qui sont encore mal compris. L’ARN polymérase II est
déphosphorylée et recyclée.

Figure 57: Evénements prenant place pendant les étapes d’initiation et d’élongation de la transcription
dirigée par l’ARN polymérase.

IV.4.2. Modifications post-transcriptionnelles chez les eucaryotes

L’ARNm est modifié en général aux deux extrémités 5’ et 3’ par des enzymes spécifiques
en plus de l’épissage qui coupe les introns des transcrits primaires.

a. Capping de l’extremité 5’P

Elle implique l’addition de m7G (7-méthyl guanosine) au nucléotide terminal de 5’ par une
liaison 5’-5’ et l’addition de deux groupes méthyls aux deux premiers nucléotides de la
chaîne d’ARN. Ce capping est fait quand le transcrit est de 20-30 nucléotides de long.

156
Le cap ou coiffe est essentiel pour l’association du ribosome à l’extrémité 5’ de l’ARN
pendant la phase initiale de la traduction. Il est aussi essentiel pour les réactions
d’épissage suivantes. Il contribue aussi à la stabilité de l’ARNm en protégeant leur
extrémité 5’ des phosphatases et des nucléases.

b. Addition d’une queue 3’ polyA

Chez la plupart des gènes eucaryotiques, on a une addition d’une queue polyA de 50 à
250 nucléotides à l’extremité 3’OH du pré-ARNm. Néanmoins, on ne trouve pas cette
queue sur tous les ARNm eucaryotes. Par exemple, les ARNm des histones dans les
cellules de mammifères ne possèdent pas la queue poly A. Elle n’est pas codée par
l’ADN. En fait, il existe un site d’une séquence AAUAAA reconnu par une endonucléase
qui clive le transcrit primaire pour signaler l’extrémité 3’ de l’ARNm.
Cependant, cette séquence ne signale pas la fin de la transcription qui peut continuer
pour des centaines de nucléotides après. Le clivage n’aura pas lieu si cette séquence ou
un segment de 20 nucléotides du côté de 3’ est délété. Quelques ARNm matures
contiennent la séquence AAUAAA. Donc, cette séquence fait seulement partie d’un signal
de clivage. Après le clivage par une endonucléase, une polymérase poly A va ajouter la
queue polyA. L’ATP est le donneur de l’Adénine dans cette réaction.
Le rôle de cette queue poly A est une énigme. Le blocage de cette synthèse n’affecte pas
le transport de l’ARNm du noyau vers le cytoplasme. On croit que sa présence est
importante pour allonger la demi-vie de la molécule d’ARNm.
L’épissage de L’ARNm.
Les introns sont épissés de façon précise chez les eucaryotes. Les jonctions entre les
introns et les exons ont été révélatrices. Ces séquences qui varient en complexité des
levures aux mammifères ont un motif en commun. Ils commencent toujours par GU et
finissent par AG. La séquence consensus chez les vertébrés est la suivante:
5’AGGUAAGU3’ et à l’extrémité 3’ la séquence consensus est de 10 pyrimidines (U ou C)
suivi par n’importe quelle base et se terminant par AG. Les introns contiennent aussi un
site de branchement de 20-30 nucléotides en amont du site d’épissage 3’. Chez la levure,
le site de branchement est presque toujours UACUAAC, alors que chez les mammifères il
est variable. La figure ci-dessous résume :
site d’épissage 5’ site d’épissage 3’
exon en amont AGGUAAGU ..………….A..…………Py NCAGGexon en aval

157
La jonction intron-exon 5’ impliquent au moins 7 nucléotides La séquence consensus
chez les vertébrés est la suivante : GUAAGUDU. Celle de l’extrémité 3’ implique 10
nucléotides et un site de branchement de 20-30 nucléotides. Chez les mammifères, la
séquence consensus du site de branchement est YNCURAY (Y représente une
pyrimidine et R représente une purine et N une base quelconque.) Les introns ont une
longueur de 50 –10000 nucléotides.

Figure 58: Etapes de la formation de l’ARN mature chez les eucaryotes.

Les évènements qui amènent à l’épissage sont les suivants:

a). clivage à la jonction 5’ qui mène à la séparation de l’exon I du reste de l’ARNm qui
contient l’intron I et l’exon 2.
b). L’extrémité libre 5’ de l’intron forme une boucle qui va ensuite joindre un nucléotide A
qui fait partie du site de branchement. La structure qui apparaît est appelée le lariat.

158
c). Clivage à la jonction 3’ et ligation des deux exons.
d). Le lariat est ensuite rendu linéaire et dégradé par des enzymes spécifiques.

L’épissage se fait par des complexes appelés spliceosomes qui sont formés par le pré-
ARNm associé à des particules petites ribonucléaires (snRNP) ou snurps. Ces ARN
nucléaires sont associés à des protéines. Il existe 6 snRNA : U1-U6, chacun d’eux est
associé à 6-10 protéines pour former les snRNP.
On trouve U4 et U6 dans le même snRNP alors que chacun des autres est associé à un
seul snRNP. Un modèle pour l’assemblage d’un spliceosome et son rôle dans l’épissage
est le suivant :
a). U1 snRNP s’attache au site d’épissage 5’ par un appariement.
b). U2 snRNP s’attache au site d’embranchement
c). Une particule préassemblée U4/U6/U5 joint le complexe par l’association de la
particule avec les U1 et U2 snRNPs.
d). U4 snRNP se dissocie du complexe
Il n’est pas clair encore comment le spliceosome enlève l’intron.

c. Modifications de l’ARNt eucaryotique

Chez les eucaryotes, les modifications de l’ARNt en ARNt mature implique : le clivage de
la séquence leader, l’épissage pour enlever les introns, le remplacement du terminal
3’UU par CCA et la modification de plusieurs bases.
Au moins quelques gènes d’ARNt des eucaryotes contiennent des introns qui sont
présents la plupart du temps dans la région de l’anticodon. L’épissage de cet intron se
fait par une endonucléase spécifique et la ligation des fragments d’ARN qui restent se fait
par une ARN ligase.
Les autres modifications de l’ARNt eucaryote impliquent :
a). l’addition d’un 5’ CCA3’ à l’extrémité 3’.
b). La modification chimique extensive de certains nucléotides à plusieurs endroits
de la chaîne.
Le type et l’étendue de ces modifications varient d’un ARNt à un autre, mais elle implique
typiquement la méthylation de bases spécifiques, la réduction de certains uridines pour
donner par exemple la dihydrouridine ou le réarrangement de certains uridines pour
produire des pseudouridines (Ψ) (fig). Ces modifications spécifiques, créées par des

159
enzymes spécifiques donnent à chaque ARNt une configuration bi ou tri-dimensionnelle
spécifique qui lui permet de s’attacher à un acide aminé spécifique et au ribosome.

Figure 59: Modèle d’assemblage d’un spliceosome et épissage des introns.

160
d. Modifications post-transcriptionnelles de l’ARNr
La plupart des eucaryotes qui ont été examiné ont un large nombre de copies des gènes
pour chacun des espèces d’ARNr : 18S, 5.8S, 28S et 5S. On les trouve adjacents l’un à
l’autre dans l’ordre 18S, 5.8S, et 28S, avec chaque groupe répété plusieurs fois pour
former des unités répétées en tandem et appelées unités répétées rADN. Ils représentent
les gènes modéremment répétés. Chez la plupart des organismes, les gènes de 5S ARNr
sont localisés à un site ou à des sites différents de ceux des autres gènes d’ARNr. Chez
les humains, ils sont groupés en une seule location. Très peu d’organismes ont des
introns dans les gènes d’ARNr (Drosophila, Tetrahymena). L’épissage de ces introns est
très différent de celui qu’on trouve dans l’épissage des introns des ARNm et des ARNt.
Les inhibiteurs antibiotiques
L’actinomycine et la rifamycine sont deux antibiotiques qui inhibent la transcription de
deux façons différentes. La rifamycine, un dérivé d’une souche de Streptomyces, et la
rifampicine, un dérivé semi-synthétique, inhibent spécifiquement l’initiation de la
transcription. La rifampicine bloque la formation de la première liaison phosphodiester
dans la chaîne d’ARN. L’élongation de la chaîne n’est pas affectée. Le site d’action de la
rifampicine est la sous-unité β de l’ARN polymérase. Quelques mutants (appelés rif-r) ont
une chaîne β altérée et sont résistants à la rifampicine.
L’actinomycine D, un antibiotique contenant un polypeptide, qu’on obtient d’une souche
différente de Streptomyces, inhibe la transcription en se liant fortement et spécifiquement
à l’ADN double-brin et l’empêchant ainsi à devenir une matrice efficace pour la synthèse
d’ARN. Cet antibiotique ne se lie jamais à l’ADN ou à l’ARN simple brin, à l’ARN double-
brin ou aux hybrides d’ADN-ARN. Cette liaison est renforcée par la présence de résidus
de guanine. L’actinomycine agit comme un agent intercalaire qui se glisse entre deux
bases adjacentes dans l’ADN à cause de sa structure cyclique (anneau de
phénoxazone).

161
 V. LA TRADUCTION : SYNTHESE DES PROTEINES

V.1. Le code génétique

L’évidence que le code génétique est formé de 3 nucléotides est venue d’expériences
faites par Francis Crick, Leslie Barnett, Sidney Brenner et R. Watts-Tobin au début des
années 60. Les expériences ont utilisé le bactériophage T4 dont les mutants RII
produisent des plaques claires sur E. coli B, alors que les souches sauvages produisent
des plaques turbides. En plus, les mutants RII sont incapables de se reproduire sur E.
coli K12.
Crick et ses collègues ont pris une souche r+ qui a été traité avec un mutant la proflavine
qui cause une addition ou une délétion d’une paire de base dans l’ADN. Ils ont raisonné
que si les mutants RII sont le résultat d’une addition ou une délétion, leur traitement avec
de la proflavine peut causer une inversion de ces mutants en r+. Ce qui veut dire que si la
mutation originale était une addition, elle peut être corrigée par une délétion et l’inverse
est vrai. Ainsi, ils ont pu isoler un nombre de révertants r+ en cultivant une population de
rII traités avec la proflavine sur une boite de E. coli K12 (λ).
1). Un code formé s’une seule base peut spécifier seulement 4 types d’acides
aminés parce qu’il y a 4 types de bases dans l’ADN. Si le code est formé de deux
bases, il y aurait 16 codons (42), alors que si le code est formé de 3 bases, on aurait
64 codons (43). Comme on trouve 20 acides aminés dans la nature, il est évident
que le code doit être formé de trois bases ou plus. Les expériences de génétique ont
montré ensuite que le code est en fait formé de 3 bases.
2). Est-ce que le code est chevauchant ou non ? Dans un code non-chevauchant,
chaque groupe de 3 bases dans une séquence ABCDEF spécifie seulement un
acide aminé. ABC spécifie un acide aminé et DEF spécifie un autre, alors que dans
le code chevauchant, ABC spécifie le premier acide aminé BCD spécifie un autre et
CDE spécifie un autre.
Ces alternatives ont été étudiées par des mutations. Supposons que la base C est
mutée en C’. Les études ont montré qu’un seul acide aminé est altéré ce qui veut
dire que le code est non-chevauchant. Si le code était chevauchant, les acides
aminés 1, 2 et 3 seraient altérés.
3). Le code doit être dégénéré car quelques acides aminés sont codés par plus d’un
triplet.

162
La dégénérescence du code est résumée par l’hypothèse de wobble:
1). Les deux premières bases du codon s’apparient de façon précise. Si deux
codons diffèrent dans les deux premières bases, ils sont reconnus par des ARNt
différents. Par exemple, UUA et CUA codent pour la leucine mais sont lus par des
ARNt différents.
2). La première base de l’anticodon détermine si une molécule d’ARNt particulière
va lire un, deux ou trois types de codons. Le tableau ci-dessous résume
l’appariement de chaque base. Donc, une partie de la dégénérescence du code
vient de l’imprécision ou wobble dans l’appariement de la troisième base du codon.
Tableau : Le code génétique.

U C A G
U Phe Ser Tyr Cys U
Phe Ser Tyr Cys C
Leu Ser Stop Stop A
Leu Ser Stop Trp G

C Leu Pro His Arg U

Leu Pro His Arg C
Leu Pro Gln Arg A
Leu Pro Gln Arg G

A Ile Thr Asn Ser U

Ile Thr Asn Ser C
Ile Thr Lys Arg A
Met Thr Lys Arg G

G Val Ala Asp Gly U

Val Ala Asp Gly C
Val Ala Glu Gly A
Val Ala Glu Gly G

V.1.1. L’élucidation du code génétique

Cela a été l’œuvre de Nirenberg qui a découvert que l’addition de poly-U à un système
acellulaire a mené à la synthèse de la polyphénylalanine. Poly-U a probablement servi
comme ARNm. Le système acellulaire a été obtenu de la façon suivante : les cellules
bactériennes ont été broyées délicatement. Les débris cellulaires (les membranes
cellulaires et les parois) sont ensuite enlevés par centrifugation.

163
L’extrait acellulaire résultant contient de l’ADN, de l’ARNm, de l’ARNt, des ribosomes, des
enzymes et des constituents cellulaires. Les protéines ont été synthétisées par cet extrait
acellulaire quand on ajoute de l’ATP, du GTP et des acides aminés. Au moins l’un des
acides aminés est marqué radioactivement de façon à le détecter lors de son
incorporation dans une protéine. Ce mélange a été incubé à 37° pour une heure. On
ajoute ensuite de la TCA pour arrêter les réactions et précipiter les protéines, laissant les
acides aminés libres dans le surnageant. Le précipité a été lavé et sa radioactivité
mesurée. Une caractéristique importante de ce système est que la synthèse des
protéines peut être arrêtée par l’addition d’une désoxyribonucléase, qui détruit la matrice
pour la synthèse d’ARNm. Cette synthèse recommencera par l’addition d’une fraction
crue d’ARNm. Un autre composé critique de cette expérience est la présence d’un
polyribonucléotide synthétique, qui a été synthétisé par la poly-nucléotide phosphorylase,
une enzyme découverte en 1955 par Manago et Ochoa. La réaction de synthèse est la
suivante :
(ARN)n + ribonucléoside diphosphate (ARN)n+1 +Pi
Une différence critique entre cette enzyme et l’ARN polymérase est qu’elle n’a pas besoin
d’une matrice et qu’elle utilise des ribonucléosides diphosphates au lieu de triphosphates.
L’ARN synthétisée par cette enzyme aura une composition dictée seulement par les
rapports des ribonucléotides dans le milieu d’incubation. Par exemple, des copolymères
de deux ribonucléotides , U et A auraient des séquences arbitraires en incubant l’enzyme
avec ADP et UDP. Les séquences peuvent être les suivantes : AAA, AAU, AUA, UAA ,
AUU, UAU, UUA, UUU.
Les expériences de Khorana ont complété celles de Nirenberg pour déchiffrer le code
génétique. Il a réussi à synthétiser par une combinaison de techniques organo-chimiques
et enzymatiques une variété de copolymères de deux, trois et quatre types de bases.
Considérons par exemple la stratégie de synthèse de poly(GUA). Ce copolymère a la
séquence suivante :
GUAGUAGUAGUAGUAGUA….
En premier, Khorana a synthétisé par des méthodes organo-chimiques deux
désoxyribonucléotides complémentaires, chacun formé de neuf résidus : d(TAC)3 et
d(GTA)3. Des duplexes partiellement doubles sont ensuite formés en mélangeant ces
deux oligonucléotides et ensuite utilisés comme des matrices pour la synthèse de
longues chaînes d’ADN par des ADN polymérases.

164
Une des chaînes est ensuite sélectionnée pour la synthèse de polyribonucléotides par
l’ARN polymérase. La sélection se fait en ajoutant seulement les ribonucléotides
nécessaires pour la transcription d’une des deux chaînes. Par exemple, quand GTP, UTP
et ATP sont ajoutés au mélange d’incubation, le polyribonucléotide poly(GUA) est
synthétisé de la matrice poly d(TAC). L’autre brin n’est pas synthétisé car un des
substrats nécessaires, CTP, était absent.

V.2. La molécule d’ARNt

La première séquence de bases d’un ARNt, celle de l’ARNt de l’alanine de levure a été
déterminée par Holley en 1965. Plus tard, les séquences d’une centaine d’autres
molécules d’ARNt ont été trouvées. La caractéristique commune des ARNt est qu’ils
peuvent tous avoir une structure en trèfle dans laquelle la moitié des résidus sont
appariés. En fait, tous les ARNt connus ont plusieurs caractéristiques communes du fait
qu’ils doivent tous interagir avec le ribosome et l’ARNm:
1). Ce sont des chaînes simple brin contenant 73-93 ribonucléotides.
2). Ils contiennent plusieurs bases étranges, typiquement entre 7-15 par molécule.
Plusieurs sont méthylées, ce qui les rend hydrophobes, une caractéristique très
importante pour leur interaction avec les protéines ribosomales et les synthétases.
La méthylation empêche aussi leur appariement à d’autres bases pour qu’ils restent
disponibles à d’autres interactions.
3). L’extrémité 5’ de l’ARNt est phosphorylée, en général un pG.
4). L’extrémité 3’ est CCA auquel l’acide aminé activé est attaché.
5). Presque 50% des nucléotides de l’ARNt sont en forme double-brin. 5 groupes de
bases ne sont pas appariés : la région terminale 3’CCA , la boucle TΨC qui a acquis
son nom de la séquence ribothymine-pseudouracil-cytosine ; le bras extra, qui
contient un nombre variable de résidus ; la boucle DHU, qui contient plusieurs résidus
de dihydrouracil ; et la boucle anticodon.
6). La boucle anticodon contient 7 bases avec la séquence suivante: 5’ Pyrimidine-
Pyrimidine-X-Y-Z- purine modifiée-base variable-3’.

V.3. Le ribosome
Un ribosome d’E. coli est une particule de ribonucléoprotéine qui a un coefficient de
sédimentation de 70S. Il peut être dissocié en deux sous-unités : une large de 50S et une

165
petite de 30S. Ces sous-unités sont formées de protéines et d’ARN. La sous-unité 30S
contient 21 protéines (appelées S1 à S21) et une molécule d’ARN de 16S.
La sous-unité 50S contient 34 protéines (L1-L34) et deux molécules d’ARN, une de 23S
et une de 5S
Une protéine est synthétisée dans la direction amine à carboxyle par l’addition
séquentielle des acides aminés au terminal carboxyle.
La synthèse des protéines se fait en trois étapes: l’initiation, l’élongation et la terminaison.
L’initiation : implique l’association de l’ARNt au signal d’initiation de l’ARNm et au
ribosome. Les acides aminés sont activés par des synthétases spécifiques, appelées
aminoacyl-ARNt synthétases par les deux chercheurs qui les ont découvertes en 1957,
Zamecnik et Hoagland. La première étape de cette activation est la formation d’un
aminoacyl-adénylate (ou aminoacyl-AMP) d’un acide aminé et d’un ATP.
H H O
+ +
H3N-C-C + ATP H3N-C-C-O-P-O-Ribose-Adénine +PPi
R R O-
La deuxième étape est le transfert du groupe aminoacyl à l’ARNt pour former l’aminoacyl-
ARNt. Pour quelques ARNt, ce groupe est transféré au 2’-OH du ribose et pour d’autres
au 3’-OH du ribose. La réaction est la suivante :
Aminoacyl-AMP +ARNt aminoacyl-ARNt +AMP
La réaction totale de l’activation et de transfert se résume à :
Acide aminé + ATP +ARNt synthétase aminoacyl-ARNt +AMP +PPi
Les deux réactions sont catalysées par la même synthétase. Au moins une synthétase
existe pour chaque acide aminé. Ces enzymes diffèrent l’une de l’autre par leur taille et
leur structure.

V.4. La synthèse de la protéine

V.4.1. L’initiation
La traduction ne commence pas immédiatement à l’extrémité 5’ de l’ARNm. En fait, le
premier codon traduit est d’à peu près plus de 25 nucléotides de l’extrémité 5’ de l’ARNm.
En plus, plusieurs ARNm sont polycistroniques. Chacune des protéines codées par
l’ARNm polycistronique a un signal d’initiation et un signal de terminaison sur l’ARNm. La
première indication du fait que l’ARNm contient des signaux d’initiation est le fait que la
moitié des protéines chez E. coli ont un terminal amine qui commence par la méthionine,
qui n’est pas commun dans le reste de la protéine.

166
En plus, le terminal amine des protéines de E. coli est normalement modifié, ce qui
suggère qu’un dérivé de la méthionine participe dans l’initiation. Il a été constaté que la
synthèse des protéines chez les bactéries commence par la formylméthionine (fMet). Un
ARNt spécifique ramène la formylméthionine au ribosome pour initier la synthèse des
protéines. Cet ARNt est différent de celui qui place la méthionine interne. Une enzyme
spécifique met un groupe formyl au groupe amine de la méthionine attaché à l’ARNt.
Le codon d’initiation de l’ARNm est AUG ou GUG. Comment cette région est–elle
distinguée d’une région intérieure qui contient un AUG? L’isolement des séquences
d’initiation d’un certain nombre d’ARNm a pu répondre à cette question. Ceci a été fait
par la digestion de complexes ribosome-ARNm par une ribonucléase pancréatique. Dans
chaque cas, une séquence de 30 nucléotides a été protégée de la digestion. Cette
séquence contient en plus du codon AUG ou GUG, une séquence appelée Shine-
Dalgarno, riche en purine et centrée sur 10 nucléotides à l’extrémité 5’ du codon
d’initiation. Elle est complémentaire à l’extrémité 3’ de l’ARNr 16S du ribosome. Ceci a
été démontré par l’isolement d’un complexe de l’extrémité 3’ de 16S et du ribosome après
la digestion avec une ribonucléase. L’appariement entre l’ARNm et 16S ARNr implique 3
à 9 nucléotides suivant la protéine.

Figure 55: Initiation de la synthèse des protéines chez les procaryotes.

167
L’initiation se fait en trois étapes: 1). La sous-unité 30S s’associe à deux facteurs
d’initiation IF1 et IF3. Ce dernier a pour rôle d’empêcher l’association entre 30S et 50S
avant l’association de l’ARNm à la sous-unité 30S. Les ribosomes bactériens contiennent
trois sites, le site A ou aminoacyl, le site P ou peptidyl, et le site E ou exit. L’ARNt-fmet
est le seul amino-acyl ARNt qui s’attache au site P.Tous les autres ARNt se lient au site
A. Le site E est celui sur lequel s’attachent des ARNt non chargés. Le facteur d’initiation
IF-1 s’attache au site A et empêche l’attachement d’un ARNt à ce site pendant la phase
d’initiation. 2). Le complexe qui consiste en la sous-unité 30S, IF-3 et l’ARNm est joint par
fmet.
IF-2 GTP et fmet-ARNt 3). Ce large complexe se combine avec la sous- unité 50S et
simultanément, le GTP attaché à l’IF-2 est hydrolysé en GDP et Pi, qui sont libérés du
complexe. Tous les facteurs d’initiation sont ensuite libérés du ribosome. L’achèvement
de ces étapes nous donne un complexe appelé le complexe d’initiation.
Initiation chez les cellules eucaryotes: La traduction chez les eucaryotes est en général
similaire à celle des procaryotes mais avec la plupart des différences significatives dans
l’initiation. L’ARNm eukaryotique forme un complexe avec le ribosome et un certain
nombre de protéines spécifiques. Plusieurs de ces protéines sont supposées lier les deux
extrémités du message. A l’extrémité 3’, l’ARNm est lié par une protéine appelée PAB ou
poly A binding protein. Les cellules eucaryotes contiennent au moins neuf facteurs
d’initiation.

V.4.2. L’élongation
Dans le premier stade de l’élongation, l’aminoacyl-ARNt approprié est lié à un complexe
de EF-Tu et GTP. Le complexe formé se lie au site A du complexe d’initiation 70S. Le
GTP est hydrolysé et un complexe EF-Tu-GDP est libéré du ribosome 70S.
Dans le deuxième stade de l’élongation, une liaison peptidique, catalysée par la peptidyl-
transférase se forme entre les deux acides aminés liés par leur ARNt au site A et au site
P du ribosome. Cette dernière activité enzymatique peut faire partie de l’ARNr 23S du
ribosome. Cette réaction produit un dipeptidyl-ARNt dans le site A, laissant le site P avec
un ARNtmet non chargé.
Dans le troisième stade de l’élongation, le ribosome se déplace d’un codon vers
l’extrémité 3’ de l’ARNm. L’ARNt chargé par le dipeptidyl se retrouve donc dans le site P.
L’ARNt non chargé se déplace vers le site E et ensuite dans le cytosol.

168
Le mouvement du ribosome est appelé une translocation et requiert une translocase (EF-
G) qui est aussi une GTPase. Le mouvement est rendu possible par un changement de la
conformation tri-dimensionnelle du ribosome entier.

Figure 56: Les étapes de l’élongation de la synthèse des protéines chez les procaryotes.

169
La structure de EF-G est similaire à celle du complexe EF-Tu/ARNt, suggérant que EF-G
peut s’associer au site A et déplacer l’ARNt-peptidyl. L’élongation chez les eucaryotes est
très similaire à celle des procaryotes. Cependant, les ribosomes eucaryotes ne
possèdent pas de site E. Les ARNt non chargés quittent directement le site P.

V.4.3. Terminaison
C’est le dernier stade de la synthèse des protéines. Le signal pour la terminaison est l’un
des codons de terminaison dans l’ARNm : UAA, UAG et UGA. Chez les bactéries, trois
facteurs de libération, RF1, RF2 et RF3 contribuent à 1) l’hydrolyse de la liaison
terminale entre le peptidyl et l’ARNt, 2) la libération du polypeptide libre et le dernier
ARNt non chargé du site P et 3) la dissociation du ribosome70S en 50S et 30S. RF1
reconnaît les codons de terminaison UAG et UAA, et le RF2 reconnaît les codons UGA
et UAA. Ces deux facteurs de terminaison se lient au codon de terminaison et induit la
peptidyl transférase à transférer le polypeptide à une molécule d’eau au lieu d’un autre
acide aminé. Ces facteurs de terminaison ont une structure qui est semblable à celle de
l’ARNt. La fonction spécifique du facteur de terminaison RF-3 n’est pas encore bien
établie, mais on croît qu’il libère la sous-unité ribosomale. Chez les eukaryotes, un seul
facteur de terminaison appelé eRF reconnaît tous les codons de terminaison.

Figure 57: Terminaison de la traduction. Le ribosome reconnait un codon de terminaison avec l’aide de
facteurs de libération (terminaison).

170
La traduction comparée
1. Les ribosomes : Ils sont plus larges. Ils consistent d’une large sous-unité 60S et
une petite sous-unité 40S, pour former une particule de 80S. La sous-unité 40S
contient une ARN 18S homologue à l’ARNr procaryotique 16S. La sous-unité 60S
contient 3 ARNs : les ARNs 5S et 28S sont homologues à ceux des prokaryotes
mais l’ARN 5,8S est propre aux eukaryotes.
2. L’ARNt initiateur. Chez les eukaryotes, l’acide aminé initiateur est la méthionine au
lieu de la N-formyl méthionine. Cependant un ARNt spécifique participe dans
l’initiation. Celui-ci est appelé Met-ARNtf ou Met-ARNti (formylé in vitro ou
initiation).
3. Le signal d’initiation. Le codon d’initiation chez les eukaryotes est toujours AUG.
Cependant, les eukaryotes ne possèdent pas une séquence riche en purine à
l’extrémité 5’ comme chez les prokaryotes. Au lieu de cela, les ribosomes 40S
s’attachent au cap 5’ de l’ARNm et cherche le AUG initiateur en se déplaçant vers
l’extrémité 3’. Ceci est accompagné par l’hydrolyse de l’ATP. L’ARNm
eukaryotique a un seul signal d’initiation (monocistronique) alors que l’ARNm
prokaryotique peut en avoir plusieurs.
4. Les complexes d’initiation. Les eukaryotes contiennent plus de facteurs d’initiation
que les prokaryotes (au nombre de neuf).
5. Les facteurs d’élongation et de terminaison : les facteurs d’élongation
eucaryotiques EF1α, et EF1βγ remplacent les facteurs procaryotiques EF-Tu et
EF-Ts. EF2 est l’analoque eucaryotique de EF-G qui catalyse la translocation . La
terminaison chez les eucaryotes est faite par un seul facteur de libération, eRF,
une GTP-ase.

V.5. Les inhibiteurs de la synthèse des protéines

Les antibiotiques sont des inhibiteurs hautement spécifiques de la synthèse des
protéines. La streptomycine, la tetracycline, le chloramphenicol et l’érythromycine sont
des agents antibactériens qui agissent en bloquant des phases différentes de la synthèse
des protéines. La streptomycine, un trisaccharide hautement basique interfère avec
l’association de l’ARNt-formylmethionine aux ribosomes et empêche l’initiation de la
synthèse des protéines. La streptomycine provoque la mauvaise lecture de l’ARNm. Un
polyU est lu par exemple comme l’isoleucine en plus de la phenylalanine.

171
La puromycine est l’analogue de la portion terminale aminoacyl-adénosine de
l’aminoacyl-ARNt. Il s’associe au site A du ribosome et inhibe l’entrée de l’aminoacyl-
ARNt. En plus, la puromycine contient un α amino groupe, qui, comme celui qui de trouve
sur l’aminoacyl-ARNt forme une liaison peptide avec le groupe carboxyl de la chaine
peptidique croissante dans une réaction catalysée par la peptidyl transférase. Ce peptidyl
puromycine se détache ensuite du ribosome.

172
 VI. REGULATION DE LA SNTHESE DES PROTEINES

Le contrôle de l’expression des gènes est crucial pour tous les organismes. Chez les
procaryotes, la régulation de l’expression des gènes permet aux cellules bactériennes de
répondre rapidement à ses besoins nutritifs. Chez les cellules supérieures, il y a une
différentiation de cellules telle que seulement certains gènes sont exprimés et d’autres
sont réprimés de façon permanente.

VI.1. Chez les procaryotes

VI.1.1. L’opéron lactose
E. coli peut utiliser le lactose comme seule source de carbone. Une enzyme essentielle
pour le métabolisme du lactose est la β galactosidase, qui hydrolyse le lactose en
glucose et galactose. Une cellule de E. coli qui croît sur un milieu qui contient le lactose
contient plusieurs milliers de molécules de β galactosidase. D’autre part, si les cellules de
E. coli sont cultivées sur un milieu qui contient une autre source de carbone que le
lactose, comme le glucose ou le glycérol, le nombre de molécules de β galactosidase par
cellule est moins que 10. Cela veut dire que la présence du lactose dans le milieu induit
l’expression du gène de la β galactosidase pour produire un grand nombre de molécules
de cette enzyme. Deux autres enzymes sont synthétisées en même temps et dans les
mêmes proportions que la β galactosidase : la galactoside perméase et la thiogalactoside
transacétylase. La perméase a pour rôle le transport du lactose à travers la membrane
bactérienne. La transacétylase n’est pas essentielle pour le métabolisme du lactose ; son
rôle physiologique n’est pas certain. In vitro, elle catalyse le transfert d’un groupe acétyl
d’un acétyl-CoA à un groupe hydroxyl C-6 d’un thiogalactoside. Chez E. coli, l’inducteur
physiologique est l’allolactose.
Les études de mutants ont montré que la β galactosidase, la perméase et la
transacétylase sont codés par trois gènes contigus, z, y et a respectivement. Les mutants
défectueux dans l’une de ces protéines ont été isolés. Le plus intéressant est un mutant
où les trois protéines sont affectées. Ce mutant constitutif synthétise de larges quantités
de β-galactosidase, de perméase et de transacétylase en la présence ou en l’absence de
l’inducteur. François Jacob et Jacques Monod ont déduit que le taux de synthèse de ces
trois protéines est gouverné par un élément commun. Le gène pour cet élément
régulateur commun est appelé i.

173
La bactérie sauvage inductible a le génotype i+z+y+a+, alors que les mutants constitutifs
ont le génotype i-z+y+a+. Pour expliquer cela, les deux chercheurs ont énoncé l’hypothèse
que le gène i+ détermine la synthèse d’une substance cytoplasmique appelé un
répresseur, qui n’existe pas chez les mutants i-. Cette idée a été testée sur des
mérozygotes ou des diploides partiels. Un groupe de mérozygotes était i+z-/Fi-z+ où F’ est
le facteur sexuel introduit par conjugaison qui contient les deux gènes i- et z+ alors qu’un
autre groupe était i-z+/Fi+z-.
Ces mérozygotes sont-ils inductibles ou constitutifs ?
Les résultats expérimentaux étaient clairs. Ils sont inductibles, signifiant que le répresseur
est diffusible et spécifié par le gène i. Ce répresseur diffusible est un exemple d’un
facteur trans , codé par un locus sur l’ADN différent de celui qui contient la cible.

Gène sites gènes structuraux

Régulateur de contrôle

i p O z y a
Figure 58: Carte de l’opéron lactose et son gène régulateur.

Le répresseur de l’opéron lac a été purifié. C’est un tétramère de sous-unités identiques

de 47 Kd, chacune contenant un site d’attachement à l’inducteur. Il s’associe très
rapidement et fortement à l’opérateur. L’opérateur a été isolé par Gilbert et ses associés
qui ont fait subir à l’ADN d’un phage contenant l’opéron lac une sonication qui a coupé
l’ADN en des fragments de 1000 paires de bases de longueur. Le représseur a été
ensuite ajouté au mélange et filtré sur des membranes de nitrocellulose. Les complexes
ADN-répresseur se sont attachés au filtre alors que le reste a passé à travers. L’ADN a té
ensuite libéré en ajoutant IPTG. Ces fragments libérés ont été digérés avec l’ADNase
pancréatique en présence du répresseur, qui a protégé l’opérateur de la digestion.
La séquence de base de l’opérateur a été analysée ; elle est constituée de 28 pairs de
bases avec une symétrie rotationnelle (fig). Donc, la symétrie du répresseur correspond à
celle de l’opérateur.

5’TGTGTGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACA3’
3’ACACACTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT5’
Figure 59: séquence de l’opéron lactose.

174
La synthèse ou non des enzymes du catabolisme du lactose est finement régulée. Pour
cela deux cas sont considérés : en absence ou en présence du lactose.

B
Figure 60 : Régulation de l’expression de l’opéron lactose en absence (A) et en présence (B) du lactose.

175
E. coli qui est cultivée dans un milieu ne contenant que le glucose comme source
d’énergie, a des niveaux très bas d’enzymes cataboliques comme la β galactosidase, la
galactokinase, l’arabinose isomérase, et la tryptophanase. La base moléculaire de
l’inhibition de ces enzymes par le glucose a été élucidée. L’observation que le glucose
baisse la concentration de l’AMP cyclique chez E. coli a été révélatrice. On a trouvé alors
que l’AMP cyclique exogène peut lever la répression exercée par le glucose. Les études
biochimiques et génétiques qui ont suivi ont montré que l’AMP cyclique stimule l’initiation
de la transcription de plusieurs opérons inductibles.
Dans les cellules bactériennes, l’AMPc s’associe à une protéine appelée CAP (catabolite
gene activating protein). Cette protéine est un dimère de deux sous-unités identiques,
chacune d’elles contient deux domaines, un domaine d’attachement à l’ADN et un
domaine d’attachement à l’AMPc. Le complexe CAP-AMPc stimule la transcription en
s’attachant à certains sites promoteurs. Dans l’opéron lac, le CAP s’attache à côté du
site d’attachement de l’ARN polymérase. Plus spécifiquement, le CAP protège les
nucléotides de –87 à –49 de la digestion, alors que l’ARN polymérase protège –48 à +5,
deux sites non-chevauchants. Le CAP exhibe une symétrie rotationnelle qui correspond à
celle de son site d’attachement à l’ADN.
Le CAP stimule l’initiation de la synthèse du lac ARNm par un facteur de 50.
L’arrangement contigu et non-chevauchant des sites d’attachement de l’ARN polymérase
et de celui de CAP a suggéré que l’attachement de CAP crée un site d’attachement
additionnel de l’ARN polymérase. En fait, l’attachement de l’ARN polymérase au
promoteur est favorisé par son contact énergétique avec le CAP. En contraste, le
répresseur du lac s’attache aux nucléotides –3 à +21, qui chevauche significativement au
site de l’ARN polymérase. Donc, le répresseur inhibe de façon stérique l’attachement de
l’ARN polymérase. Tous les opérons inductibles par le complexe CAP-AMPc contiennent
la séquence TGTGA en amont du site promoteur. Une autre caractéristique commune est
que les séquences –10 et –35 sont très différentes des séquences consensus des
promoteurs forts. L’évolution a probablement affaibli ces promoteurs pour rendre leur
opéron dépendant sur une protéine qui facilite l’initiation efficace de la transcription.
Donc, les opérons cataboliques inductibles sont sous un contrôle double. Une expression
élevée de la transcription requiert la présence simultanée de l’AMPc et l’inducteur.

176
VI.1.2. L’opéron tryptophane
L’opéron tryptophane (trp) est constitué de cinq gènes qui codent pour les enzymes qui
convertissent le chorismate en tryptophane (fig). Un ARNm polycistronique est produit en
quatre minutes et ensuite dégradé rapidement. Cette durée de vie courte permet à la
bactérie de répondre rapidement à ses besoins en tryptophane. La traduction de cet
ARNm qui suit la transcription va produire de façon séquentielle et en quantités
équimolaires les cinq enzymes. En fait, quand la quantité de tryptophane diminue dans la
cellule, la synthèse de ces cinq enzymes peut augmenter de 700 fois.
D’un autre côté, quand le niveau de tryptophane est élevé, il s’attache à un répresseur
causant un changement de conformation de ce dernier, qui va lui permettre de s’associer
à l’opérateur et inhiber ainsi l’expression de cet opéron.

Figure 61: Organisation des sites de contrôle et des gènes de structure de l’opéron tryptophane chez E.
coli.

Le répresseur est un homodimère codé par le gène trpR, qui est loin de l’opéron trp. Le
répresseur seul ne peut pas s’attacher à l’opérateur. Seul le complexe répresseur-trp
peut s’attacher à ce site, montrant ainsi que le trp est un corépresseur. La cible du
complexe est un ADN possédant une symétrie rotationnelle. Ce site est chevauchant
avec celui du promoteur, pour empêcher l’association de l’ARN polymérase à ce dernier.

177
 -21 -10 +1
CGAACTAGTTAACTAGTACGCAAG
GCTTGATCAATTGATCATGCGTTC
Figure 62: séquence de bases de l’opérateur trp. La symétrie rotationnelle est montrée par la ligne
verticale. La paire de base marquée +1 est le début de la transcription de l’opéron.

Un autre processus, appelé atténuation, contrôle l’expression de l’opéron trp. En effet,

quand le trp est abondant dans le milieu, les transcrits d’ARN sont courts de 140p.b.
seulement qui se sont terminés au site d’atténuation a dans la région trpL ; cette dernière
contient une séquence de terminaison qui peut former une épingle à cheveux. Elle
contient aussi deux codons adjacents de trp qui jouent un rôle important dans
l’atténuation.
Quatre régions dans l’ARNm peuvent former des structures secondaires avec des
appariements complémentaires L’appariement des régions 1 et 2 peut donner un signal
de pause et l’appariement de 3 et 4 est un signal de terminaison de la transcription,
comme indiqué dans la figure suivante.

Figure 63: Modèle d’atténuation dans l’opéron tryptophane d’E. coli.

178
VI.1.3. L’opéron arabinose
C’est un mécanisme de régulation chez E. coli plus complexe que les autres. La protéine
Ara C exerce un contrôle à la fois positif et négatif. Elle possède deux conformations,
l’une répressive qui se transforme en la forme active après la liaison avec une molécule
signal, Chacune de ces deux formes possède un site d’attachement sur l’ADN. Cette
protéine réprime aussi la transcription de son gène, un mécanisme d’auto-régulation. Cet
opéron est aussi sous le contrôle de séquences régulatrices distantes de son promoteur.
Ce contrôle se fait par le pliement de l’ADN, sous l’effet d’interactions protéines–protéines
et protéines–ADN, semblables à certains mécanismes régulateurs chez les eucaryotes.
E. coli peut utiliser l’arabinose comme source de carbone en le convertissant d’abord en
xylulose 5-phosphate, un intermédiaire dans le cycle du pentose. Cette conversion
requiert la présence de trois enzymes, codés par trois gènes : araB, araA et araD. Ces
trois gènes se trouvent dans l’opéron arabinose , en plus d’un site régulateur avec deux
opérateurs, AraO1 et Ara O2, un autre site de liaison de la protéine AraC appelé ara I (I
pour inducteur) et un promoteur adjacent à ara I appelé PBAD. L’opérateur AraO2 a un
seul site de liaison à la protéine AraC. L’opérateur ara O1 et araI ont chacun deux sites
de liaison à cette protéine dans la même orientation. Le gène araC est transcrit sous le
contrôle de son propre promoteur mais dans l’orientation opposée que les gènes araB, A
et D. Un site de liaison de CRP est adjacent au promoteur PBAD, et a un mécanisme
d’action similaire au CRP de l’opéron lac.
Le rôle de la protéine AraC dans le contrôle de l’opéron arabinose est complexe.
Premièrement, quand sa concentration excède 40 copies par cellule, il réprime sa propre
synthèse en se liant à l’opérateur araO1.
Deuxièmement, elle exerce un contrôle positif et négatif sur les gènes araBAD, en se liant
à araO2 et araI.

Le mécanisme de régulation est résumé de la façon suivante :

a. Le glucose est abondant et l’arabinose est absent : Dans ces conditions, la protéine
dimérique s’attache à araO1 ainsi qu’à la moitié de araI, formant une boucle de 210 pb et
réprimant la transcription des gènes araBAD.
b. Le glucose est présent seulement à des niveaux très bas et l’arabinose est disponible :
Sous ces conditions, CRP-cAMP devient abondant, et occupe le site CRP adjacent à
araI. L’arabinose se lie aussi à AraC et change sa conformation.

179
La boucle d’ADN formée par l’homodimère araC s’ouvre. AraC s’associe aux deux demi-
sites de araI et devient un activateur, agissant en même temps que CRP-AMPc pour
activer les gènes araBAD.
c. Quand l’arabinose et le glucose sont tous les deux abondants, ou quand ils sont tous
les deux absents, l’opéron arabinose reste réprimé. Le mécanisme détaillé de cette
répression n’est pas encore bien connu. La réponse de cet opéron est très rapide.

VI.2. Le bactériophage lambda

Le premier système de recombinaison dirigée étudié in vitro est celui du bactériophage
lambda. Quand l’ADN du phage lambda entre une cellule d’E. coli, une série
d’évènements régulateurs dirigent la cellule vers un de deux destinées : ou bien l’ADN du
phage lambda se réplique pour produire plus de bactériophages (phase lytique), ou bien il
s’intègre dans le chromosome de l’hôte, se répliquant en même temps que le
chromosome de l’hôte pour plusieurs générations. L’intégration est accomplie par une
recombinase (intégrase) codée par le génome de lambda, qui agit à des sites de
recombinaison appelés attP et attB, respectivement.
La décision se fait par un « switch génétique » qui implique une compétition entre les
produits du gène Ci (répresseur) et le gène cro (protéine Cro). Si le répresseur domine,
la phase lysogène suivra. Si la protéine Cro domine, c’est la phase lytique suivra.
Différents gènes sont exprimés sont exprimés suivant à ce que la phase lysogène ou la
phase lytique est suivie. Premièrement, le chromosome linéaire devient circulaire avec
l’appariement de sites cos qui représentent des extrémités cohésives de 12 p.b. et
l’action de la ligase qui les lient de façon covalente ; puisqu’aucun répresseur n’a été
formé pour réprimer les gènes du cycle lytique, la transcription commence aux
promoteurs PL et PR PL étant le promoteur pour la transcription à gauche de l’opéron
précoce (early), et PR est le promoteur pour la transcription à droite de l’opéron early. Le
promoteur PR est sur un autre brin que PL, ainsi les deux promoteurs ont des
orientations opposées,
De PR, le premier gène à être transcrit est le cro, dont le produit est la protéine Cro. Cette
protéine joue un rôle dans le « switch génétique » vers la phase lytique. De PL, le premier
gène à être transcrit est le gène N. La protéine N est un anti-terminateur qui permet à la
synthèse de l’ARN à passer par certain sites de terminaisons. Ce phénomène est appelé
anti-terminaison ou transcription à travers. La protéine N va permettre à l’ARN
polymérase de passer à gauche du gène N et à droite du gène cro, incluant tous les

180
gènes précoces. Un des gènes transcrits sous l’influence de la protéine N est le gène cII.
La protéine cII active les gènes suivants: cI code le répresseur de lambda, O et P codent
deux protéines de réplication de l’ADN, et Q (qui code une protéine qui active les gènes
tardifs pour la lyse et les protéines du phage lambda). La protéine Q fonctionne comme
une protéine d’anti-terminaison, permettant aux gènes tardifs de se transcrire.
Cependant, seulement quand le switch est établi vers la phase lytique et que la
transcription continue de PR pour un temps suffisant que la protéine Q s’accumule pour
fonctionner efficacement.
La phase lysogène.
Après la transcription précoce, ou la phase lytique ou la phase lysogène est suivie. Le
switch pour la phase lysogène se fait de la façon suivante :
La protéine cII stabilisée par la protéine cIII active la transcription de du gène cI localisé
entre le promoteur PL et PR d’un promoteur appelé PRE (promoter for repressor
establishment), localisé à la droite de cI-cro région. Le produit du gène cI, le répresseur,
bloque l’expression des gènes nécessaires pour la réplication du chromosome,
l’assemblage de la progéniture du phage, et la lyse de la cellule, maintenant ainsi la
phase lysogène. Le répresseur de lambda consiste de deux domaines, le domaine amine
et le domaine carboxyle. Le répresseur est un dimère formé par le contact entre les deux
domaines carboxyles, quand il y a assez de répresseur dans la cellule, il s’associe à deux
régions opératrices, OL et OR, dont les séquences chevauchent avec celles des
promoteurs, ce qui empêche la transcription précoce contrôlée par PL et PR. La
transcription des gènes N et cro est bloquée et puisque les deux protéines codées par
ces deux gènes sont instables, les niveaux de ces deux protéines dans la cellule
diminuent dramatiquement. L’’association du répresseur bloque aussi la transcription des
gènes O, P et Q contrôlés par la protéine N. En plus, un répresseur attaché à O stimule la
synthèse de plus de répresseur d’un promoteur différent, le PRM, pour maintenir la
concentration du répresseur dans la cellule.
Les opérateurs OL et OR chacun a trois sites d’association au répresseur, désignés par
OL1, OL2 et OL3 et OR1, OR2 et OR3 respectivement. Le répresseur ne s’attache pas
de la même force à ces sites. La force d’association du répresseur à ces sites est dans
l’ordre suivant : OL1>OL2>OL3. Pour le site d’opérateur OR, la force relative
d’association est dans l’ordre suivant : OR1>OR2>OR3.

181
Figure 64: Expression des gènes du bactériophage λ après infection d’E. coli et les événements
transcriptionnels qui se produisent dans les voies lytique et lysogénique.

182
VI.3. La régulation de l’expression des gènes chez les eucaryotes
Il existe plusieurs niveaux de contrôle chez les eucaryotes.
1. Le niveau des chromosomes
2. Le niveau transcriptionnel
3. Le niveau post-transcriptionnel
4. Le niveau traductionnel
5. le niveau post-traductionnel

VI.3.1. Le niveau chromosomique

L’ADN des chromosomes eucaryotes est associé intimement à des petites protéines
basiques appelées histones. En fait, les histones constituent à peu près la moitié de la
masse des chromosomes eucaryotes. Les 5 types d’histones sont appelés H1, H2A,
H2B, H3 et H4. Leurs charges positives viennent du fait qu’elles contiennent une quantité
élevée d’arginine et de lysine (1/4 résidus).
Les histones peuvent subir des modifications post-traductionnelles comme le fait que la
lysine 16 de H4 est souvent acétylée. Elles peuvent aussi être méthylées et
phosphorylées. Ces modifications qui donnent des changements de charge, des
capacités de liaison hydrogènes et la forme des histones peuvent être importantes dans
la condensation de l’ADN. Les régions qui sont activement transcrites sont plus sensibles
à la digestion par l’ADNase I, ce qui veut dire qu’elles sont moins condensées que les
régions qui sont inactives. Ces sites sont appelés des sites hypersensibles, qui consistent
en 100 à 200 pairs de bases dans la région de 1000 pairs de bases dans l’extrémité 5’
des gènes transcrits. Cependant, dans certains gènes, les sites hypersensibles se
trouvent à l’intérieur du gène ou vers l’extrémité 3’. Plusieurs sites hypersensibles
constituent des sites d’attachements de protéines régulatrices appelées HMG.
L’acétylation des histones est associée aux régions en état de transcription active.
Le degré de la méthylation des cytosines dans l’ADN est aussi corrélé avec l’activité du
gène. A peu près 70% des séquences GC de l’ADN des mammifères sont méthylées.
Cela peut être révélé sur une Southern après la digestion des enzymes de restriction
HpaII et MspI. HpaII clive CCGG mais pas CmCGG alors que le MspI clive les deux. En
général, les gènes des mammifères actifs sont moins méthylés que les gènes inactifs.
Cependant, il est à noter que la méthylation de l’ADN n’est pas un processus régulateur
universel chez les eucaryotes. Par exemple, l’ADN de Drosophila n’est pas méthylé.

183
H1 est phosphorylée juste avant la mitose, et déphosphorylée après la mitose suggérant
que cette modification covalente régule sa capacité à rendre l’ADN compacte.

VI.3.1.1. Les histones de l'hétérochromatine sont hypo-acétylées

Les histones peuvent subir des modifications post-traductionnelles, portant sur leurs
extrémités N-terminales et susceptibles d'influer sur l'activité génétique de la chromatine.
L'hypo-acétylation des histones, essentiellement sur les lysines, est associée à une
chromatine inactive. A l’opposé, des histones hyper-acétylées traduisent une chromatine
active. L'acétylation/désacétylation des histones est un mécanisme tout à fait essentiel de
la régulation de l'expression des gènes. De nombreux facteurs de transcription ont été
trouvés ayant une activité, soit d'Histone Acétyl Transférase (HAT), soit d'Histone De-
ACétylases (HDAC).

VI.3.1.2. Les histones de l'hétérochromatine sont méthylées sur la lysine 9

La méthylation de l'histone H3 au niveau de la lysine 9 (H3-K9) a récemment été impliquée
dans les processus d'hétérochromatinisation du génome, aussi bien de l'hétérochromatine
constitutive que l'hétérochromatine facultative.

a. L'hétérochromatine est transcriptionnellement inactive

Contrairement à la drosophile, l'hétérochromatine constitutive humaine ne contient pas de
gènes, et l'incorporation d'uridine tritiée dans une culture cellulaire ne montre aucun
marquage de l'hétérochromatine. L'hétérochromatine facultative est relativement pauvre en
gènes; en plus, ils ne sont généralement pas transcrits dans un contexte
hétérochromatique.

b. L'hétérochromatine ne participe pas à la recombinaison génétique

Il est admis qu'à la méiose, l'hétérochromatine constitutive ne participe pas à la
recombinaison génétique. Il n'y a pas d'appariement préalable entre les régions
hétérochromatiques homologues, probablement à cause du polymorphisme, caractérisant
les régions hétérochromatiques, qui rend difficile, voire impossible, un tel appariement.
L'hétérochromatine constitutive a de plus un effet répresseur sur la recombinaison des
régions euchromatiques adjacentes. Pour ce qui est de l'hétérochromatine facultative, elle
ne participe pas à la recombinaison méiotique quand elle est sous forme inactive.

184
c. Facteurs impliqués dans l'hétérochromatinisation
Certaines observations ont permis de mieux cerner les éléments ayant un rôle important
dans la formation d'hétérochromatine, qu'elle soit constitutive ou facultative.
.
c.1. La méthylation de l'ADN
Les larges répétitions de transgènes ne conduisent pas toutes à une inactivation
transcriptionnelle de celui-ci. Le silencing induit par les répétitions en tandem apparaît être
lié à la présence de séquences d'ADN procaryote, riches en CpG, susceptibles d'être
méthylées. Alors, la composition en bases des séquences répétées en tandem pourrait
donc jouer un rôle non négligeable dans la formation d'hétérochromatine.
De façon intéressante, il a récemment été montré que la methyl binding protein MeCP2, qui
normalement se fixe à l'ADN contenant des cytosines méthylées, est capable de recruter
des histones de-acétylases (Fig1). La méthylation de l'ADN pourrait ainsi induire une de-
acétylation des histones et favoriser l'hétérochromatinisation.
Néanmoins, la méthylation de l'ADN n'est pas un élément indispensable à la formation
d'hétérochromatine. Elle pourrait être un élément de stabilisation. Chez les marsupiaux, en
effet, l'X inactif n'est pas méthylé et il est beaucoup moins stable que chez les
mammifères.

Figure 65: La méthylation de l'ADN provoque une dé-acétylation des histones, modification qui caractérise
les histones à la fois dans l'hétérochromatine et dans l'euchromatine. MeCP2 se fixe à l'ADN méthylée et
recrute une HDAC qui dé-acétyle les histones.(Ac = Acetyl ; Me = Methyl ; MeCP2 = Methyl-CpG binding
Protein 2 ; HDAC = Histone De-Acetylase).

185
c.2. L'hypo-acétylation des Histones
Nous avons vu que l'hypo-acétylation des histones était une caractéristique de la
chromatine silencieuse qu'il s'agisse ou non d'hétérochromatine. Ainsi, un blocage de la
désacétylation des histones par adjonction de trichostatine A induit une hyper-acétylation
des histones, qui a pour conséquence une ouverture de la structure chromatinienne.
En fait, l'acétylation des lysines annule la charge positive des histones, diminuant ainsi les
forces d'attraction avec la charge négative du phosphate de l'ADN, et conduisant à une
ouverture plus large de la chromatine.
Au contraire, la de-acétylation des lysines libère les charges positives et favorise ainsi une
attraction étroite avec l'ADN, conduisant à la formation d'une chromatine condensée.

c.3. La méthylation de H3-K9

La méthylation de l'histone H3 sur la lysine 9 est une modification épigénétique, très
récemment démontrée comme étant impliquée dans les processus
d'hétérochromatinisation, aussi bien dans l'hétérochromatine constitutive que sur l'X inactif.
L'enzyme responsable de la méthylation est l'histone méthyltransférase SUV39H1. Sur la
lysine 9 de H3, acétylation et méthylation semblent être mutuellement exclusives. Ainsi,
chez la drosophile, l'histone H3 méthyltransférase Suv39h est associée à une histone de-
acétylase, ce qui suggère un mécanisme moléculaire unique, permettant de convertir
directement une lysine 9 acétylée en une lysine 9 méthylée. La méthylation de H3-K9 crée
en outre un site de haute affinité pour la protéine de l'hétérochromatine HP1. La co-
immunoprécipitation de Suvar39h avec HP1 permet de proposer un mécanisme
d'hétérochromatinisation qui serait basé sur l'interaction entre ces 2 protéines et la lysine 9.
Enfin, chez Neurospora crassa, il a récemment été montré que la méthylation de H3-K9
pouvait entraîner la méthylation de l'ADN.

186
Figure 66: La méthylation de l'histone H3-K9 provoque la méthylation de l'ADN

c.4. Les protéines HP1

Les protéines HP1 semblent jouer un rôle tout à fait particulier dans l'organisation de
l'hétérochromatine. C'est essentiellement l'étude de la variégation par effet de position (effet
PEV) chez la drosophile, puis l'étude des transgènes chez la drosophile et la souris qui ont
permis de mieux connaître le rôle joué par les protéines HP1.
Chez la drosophile, la protéine HP1 est codée par le gène Su(var)205, suppresseur de
variégation capable de modifier l'effet PEV. La variégation par effet de position peut être
décrite comme suit : des gènes, habituellement localisés dans l'euchromatine active sont, à
la suite d'un réarrangement chromosomique, placés à proximité d'une région
centromérique, donc hétérochromatique. La chromatine nouvellement réprimée devient
beaucoup plus compacte et commence à s'associer avec des protéines HP1,
habituellement confinées aux centromères. De plus, les gènes contenus dans cette
chromatine sont réprimés.
Chez la souris, l'insertion d'un transgène à proximité d'un centromère peut entraîner des
conséquences similaires.

187
Il est intéressant de noter que même dans les cas où un transgène est réprimé, non pas en
raison d'un effet centromérique, mais en raison de sa forte répétition, là encore on retrouve
des protéines HP1 associées à la chromatine réprimée.

Les protéines HP1 semblent constituer le maillon indispensable à la formation

d'hétérochromatine et pourraient jouer un rôle d'organisateur de domaine chromatinien. Ces
protéines HP1 seraient capables de reconnaître des structures particulières réalisées par
l'appariement et/ou l'association des séquences d'ADN répétées. De plus, grâce au
chromodomaine (CD) et au chromoshadow domaine (CSD), elles seraient capables
d'établir secondairement des liaisons avec un grand nombre d'autres protéines.

c.5. Les ARNs nucléaires

Il est déjà bien établi que certains ARN nucléaires sont capables d'intervenir dans la
formation de l'hétérochromatine facultative. Ainsi, les transcripts du gène XIST (Xinactif
Specific Transcripts) jouent un rôle essentiel dans l'initiation de l'inactivation facultative d'un
chromosome X, dans les cellules somatiques des mammifères femelles. Certains résultats
récents, obtenus chez la souris, suggèrent que des transcrits nucléaires pourraient aussi
être impliqués dans la formation d'hétérochromatine constitutive. Dans cette espèce, l'HC
centromérique est caractérisée par la présence d'une forte concentration d'histone H3-K9
méthylée et de protéines hétérochromatiques HP1, qui sont rapidement délocalisées après
incubation avec de la RNAse A. Ceci suggère donc qu'un ARN nucléaire pourrait être un
composant structural essentiel de l'hétérochromatine constitutive.

VI.3.1.3. Rôle de l'hétérochromatine dans la répression génique

L'expression génique peut être régulée à deux niveaux: Tout d'abord au niveau local et
c'est la régulation de la transcription, grâce à la formation de complexes locaux de
transcription. Ce niveau implique des séquences d'ADN relativement petites liées à des
gènes individuels. A un niveau plus global, et c'est alors plutôt la transcriptabilité qui est
contrôlée. Il implique des séquences beaucoup plus grandes, représentant un large
domaine chromatinien, qui peut être soit sous un état actif, soit sous un état inactif.
L'hétérochromatine serait impliquée dans le contrôle de la transcriptabilité du génome.
Ainsi, des gènes habituellement localisés dans l'euchromatine peuvent être réduits au
silence lorsqu'ils sont placés à proximité d'un domaine hétérochromatique.

188
a. Mécanisme d'inactivation en cis
A la suite d'un réarrangement chromosomique, une région euchromatique peut être
juxtaposée à une région hétérochromatique. Dans les cas où le réarrangement a enlevé
certaines barrières normales protégeant l'euchromatine, la structure hétérochromatique
devient capable de se propager en cis à l'euchromatine qui la jouxte, inactivant ainsi les
gènes qu'elle contient. Ce mécanisme a été observé dans la variégation par effet de
position (PEV) chez la Drosophile ou encore dans l'inactivation de certains transgènes chez
la souris.

b. Mécanisme d'inactivation en trans

Au cours de la différenciation cellulaire, certains gènes actifs sont susceptibles d'être
transposés dans un domaine nucléaire hétérochromatique, ce qui entraîne leur inactivation.
Un tel mécanisme a été proposé pour expliquer la co-localisation, dans les noyaux de
lymphocytes, de la protéine Ikaros et des gènes dont elle régule l'expression avec de
l'hétérochromatine centromérique.
Pseudogènes
Leurs séquences sont homologues à des gènes adjacents mais ils ne codent pas pour des
produits fonctionnels. Leur inactivité est structurale qui est le résultat de :
a). il lui manque l’extrémité consensus 5’ essentielle pour l’épissage
b). le signal de polyadénylation a muté de AATAAA à AATGAAA
c). le codon d’initiation ATG est remplacé par GTG
d). une délétion de 20 nucléotides commençant par le résidu amine 38 génère trois codons
stop qui empêche la terminaison de la chaîne polypeptidique

L’hypersensibilité à la digestion par l’ADNase I est corrélée avec l’expression active de

gènes spécifiques. Les extrémités 5’ de gamma, beta et delta gènes dans les cellules
érythroides fétales sont hypersensibles à l’ADNase I alors que seulement les delta et beta
sont hypersensibles chez les adultes.

VI.3.2. Contrôle transcriptionnel

L’ARN polymérase II requiert la présence de deux séquences de contrôle cis : les
promoteurs, les enhancers chez les mammifères et les UASs (upstream activating
sequences) chez la levure. Tous ces éléments sont reconnus par des facteurs trans, qui
servent comme des éléments de contrôle positifs.

189
Les promoteurs
La boîte TATA à –25. Cette boîte est plus efficace avec la présence de deux autres
séquences localisées à –40 et –110 : ce sont la séquence CCAAT et une séquence riche
en GC. Une mutation dans l’un de ces éléments baisse énormément le taux de
transcription. Elle a une séquence consensus 5’-GGCCAATCT-3’. La boîte GC a la
séquence consensus 5’ GGGCGG3’ qui peut exister en plusieurs copies dans un
promoteur et peut fonctionner dans les deux orientations. Cette boîte existe surtout dans
les gènes constitutifs et peut aider l’attachement de l’ARN polymérase à côté du point
d’initiation de la transcription.

Les enhancers
Sont des séquences cis qui augmentent considérablement les taux de transcription de
promoteurs sur la même molécule d’ADN. Un aspect unique de ces éléments est qu’ils
peuvent exercer leur effet à des distances qui peuvent aller jusqu’à plusieurs milliers de
pairs de bases. Ils peuvent aussi fonctionner dans les deux orientations, en amont ou en
aval du promoteur. Une autre caractéristique des enhancers est qu’ils sont spécifiques à
certains tissus, qui opèrent dans certains types de cellules mais pas dans d’autres. Par
exemple, les gènes des anticorps sont flanqués par des enhancers qui opèrent
seulement dans les cellules B du système immunitaire. D’autres enhancers répondent à
des signaux externes, comme les gènes de « heat-shock », qui sont exprimés après une
hausse de température, ou les gènes de la métallothionine, qui codent pour des protéines
de détoxification des métaux, comme le zinc ou le cadmium.

Les hormones stéroïdiennes

Leur effet est un exemple d’interaction directe. Ils interagissent avec des récepteurs
intracellulaires qui sont eux-mêmes des trans-activateurs. Le complexe récepteur-
hormone s’attache sur des séquences appelées HRE. Les HRE différents pour des
hormones différentes sont similaires en arrangement et longueur mais pas en séquence.
Ils ont deux domaines de zinc.
Les facteurs de transcription trans : trois classes de protéines sont impliquées dans
l’activation de la transcription. La première classe est celle des facteurs de transcription
basals. Ces protéines forment le complexe de pré-initiation mais sont insensibles à la
régulation.

190
Trans-activateurs qui s’attachent à l’ADN. Ces protéines peuvent être spécifiques ou non
spécifiques à certains promoteurs. Par exemple, la protéine SpI reconnaît les boîtes GC
dans le promoteur de SV40. Son domaine d’attachement à l’ADN est à l’extrémité
carboxyl et contient 3 doigts de zinc. Les domaines d’activation sont riches en gln. Elles
peuvent aussi s’associer à des enhancers. Les protéines GCN4 et GAL4 s’associent aux
séquences UAS de la levure. GCN4 active la transcription de plusieurs gènes impliqués
dans les voies de biosynthèse des acides aminés. En réponse à la faim, le niveau de
GCN4 augmente qui stimule les gènes de la voie de biosynthèse des acides aminés.
L’UAS reconnu par GCN4 contient la séquence ATGACTCAT. Gal 4 active les gènes du
métabolisme du galactose.Gal4p est un doigt de zinc sur son domaine amine qui
s’attache à l’ADN. Il contient six résidus de cys et deux molécules de zinc. Son domaine
d’activation est acide qui est critique à sa fonction.
Quelques transactivateurs peuvent adopter des conformations multiples qui les rend
capables d’agir comme des activateurs ou des répresseurs. On donne comme exemple
les récepteurs des hormones stéroides. Cette répression se fait dans certains cas par
l’interaction avec des désacétylases qui rendent la chromatine inactive.
Complexes de co-activateurs protéiniques. Ces protéines agissent comme des
intermédiaires entre les trans-activateurs et l’ARN polymérase. Le co-activateur le plus
caractérisé est le facteur de transcription TFIID. C’est un large complexe qui inclut le TBP
et 10 ou plus de facteurs associés au TBP (TAF). Quelques TAFs ressemblent à des
histones et peuvent jouer un rôle dans le déplacement des nucléosomes pour l’activation
de la transcription.
Dans les gènes ribosomaux 5S et l’ARNt transcrits par l’ARN pol III contiennent une
séquence au centre appelée internal control region de 50 nucléotides critique pour une
transcription efficace. Cette séquence est reconnue par le facteur de transcription TFIIIA
qui une fois attaché va favoriser la formation d’un complexe avec TFIIIC et TFIIIB et
l’ARN pol III. Cette protéine contient 9 domaines similaires de 30 résidus Elle contient
aussi 9 molécules de zinc, qui en s’attachant avec l’ADN donne des doigtés de zinc.
On distingue plusieurs types de facteurs de transcription.
Les protéines contenant une hélice-tour-hélice similaire à celui qu’on trouve chez les
protéines bactériennes. Plusieurs de ces protéines sont impliquées dans le
développement de la drosophile, dans l’arrangement spatial des segments du corps. Les
gènes qui codent ces protéines, appelées des protéines homéotiques contiennent des
séquences appelées boîtes homéotiques.

191
Ces séquences codent spécifiquement le segment hélice tour hélice de ces protéines.
L’hélice 3 est l’hélice de reconnaissance de l’ADN alors que les hélices 1 et 2 établissent
des contacts avec d’autres protéines.
Les doigts de zinc qui s’attachent à des régions de l’ADN riches en histidine et cystéine.
Ces protéines contiennent du zinc et forment des protrusions qui ressemblent à des
doigts. Un exemple de ces protéines est illustré par les récepteurs des hormones
stéroïdes et d’autres facteurs de transcription qui s’attachent aux promoteurs.
Les protéines leucine zipper qui sont des dimères formant une face hydrophobique riche
en leucine 1/7 résidus. L’autre face contient le domaine d’attachement à l’ADN contenant
plusieurs résidus de lysine et arginine. La formation du dimère est importante pour
l’association à l’ADN. Un exemple de ces protéines sont les protéines codées par les
proto-oncogènes, c-jun et c-fos.
Les protéines hélice-boucle-hélice forment aussi des dimères. Ces protéines sont
représentées par les protéines de la différentiation et quelques proto-oncogènes (c-myc).
Les deux domaines, le domaine d’activation et le domaine d’attachement à l’ADN se
comportent de façon indépendante. Le domaine d’activation CTF1 riche en proline
‘contient de la pro à plus de 20%) est joint par génie génétique au domaine d’attachement
de l’ADN de sp1.

VI.3.3. Contrôle post-transcriptionnel

Il peut se faire par l’épissage différentiel. On prend comme exemple l’épissage du même
transcrit primaire ARNm qui est épissé différemment dans deux organes différents et
donnent donc deux protéines différentes.
Les lymphocytes B, se prolifèrent quand un antigène s’attache à un récepteur de l a
membrane cellulaire. Ces récepteurs sont des immunoglobulines qui traversent la
membrane cellulaire. Les immunoglobulines liés à la membrane et ceux qui sont solubles
ont la même spécificité. Si on considère IgM, le premier anticorps qui apparaît à la
surface de la membrane, les formes membranaires (μm) et la forme soluble μs diffèrent
seulement par la partie carboxyle de leur chaîne lourde. Celle de μm se trouve dans la
membrane pour servir à transmettre le signal. Celle de μs est soluble et ne contient pas
la queue carboxyle hydrophobe parce qu’elle doit être secrétée en dehors de la cellule.
Le reste des deux molécules sont similaires parce qu’elles ont la même spécificité
d’attachement à l’antigène.

192
Les deux molécules sont codées par le même gène qui contient 8 exons et deux sites de
polyadénylation AAUAAA potentiels. Le choix d’un de ces deux sites pendant l’épissage
déterminera la production de l’un des deux molécules. Si le premier site de
polyadénylation est choisi, qui est localisé à l’extrémité 5’ des deux derniers exons, c’est
l’ARNm primaire de μs qui sera produit et qui contient seulement les six premiers exons.
Si le deuxième site de polyadénylation est choisi, c’est l’ARNm primaire de μm qui sera
produit, et qui contient 8 exons et u epartie de l’exon 6 est excisée les deux derniers étant
ceux qui codent pour le terminal carboxyl hydrophobe qui traverse la membrane
cellulaire. Cet exemple est celui d’une différentiation cellulaire.
Dans l’hypothalamus, on obtient le CGRP (calcitonin gene-related peptide) et dans la
thyroide, on obtient la calcitonine.
Peptide calcitonine

ARNm B C D calcitonine

thyroide

Transcrit A B C D calcitonine CGRP

primaire
hypothalamus

B C D CGRP

Peptide CGRP

Figure 67: Synthèse différentielle de protéines.

Le contrôle de la dégradation de l’ARNm

Le contrôle de la stabilité de l’ARNm dépend de la queue polyA. Sans cette queue le
messager est dégradé rapidement. D’autres facteurs affectant la stabilité de l’ARNm sont
les hormones et certaines séquences comme AUUUA

193
VI.3.4. Contrôle traductionnel
Les ARNm présents dans le cytoplasme sont sélectionnés par le ribosome. Quand on a
besoin d’augmenter le niveau d’une protéine dans la cellule, une ARNm présente dans le
cytoplasme et réprimée peut être activée exemple certains gènes très longs chez les
réticulocytes des cellules anuclées, le contrôle transcriptionnel est totalement non-
disponible et dépend sur le contrôle traductionnel.
1. phosphorylation des facteurs d’initiation qui deviennent moins actifs et causent une
dépression générale de la traduction dans la cellule.
2. Quelques protéines s’attachent directement à l’ARNm et agissent comme des
répresseurs. Ils s’attachent à 3’ UTR
3. Des protéines qui s’associent interrompent les interactions entre Eif4e et Eif4G
4. La longueur de la queue poly-A peut contrôler l’initiation de la traduction. En
général, l’ARNm stoqué dans les ovocytes et inactif a une queue poly-A plus
courte que l’ARNm actif. En principe, la queue poly-A est courte pour deux
raisons : la polyadénylation initiale a ajouté un petit fragment de nucléotides A ou
une queue normale a été ajoutée qui a été ensuite réduite par une désadénylation.
Au moins pour certains ARNm stoqués dans les ovocytes de souris et de
grenouille, le dernier mécanisme rentre en jeu. Ce qui marque l’ARNm pour une
désasénylation rapide est un signal appelé élément de contrôle d’adénylation
(ACE) et a la séquence consensus suivante UUUUUAU. Il est placé à l’extrémité 3’
UTR en aval de la séquence d’adénylation AAUAAA. . Pour activer un ARNm
stocqué dans le cytoplasme, une enzyme cytoplasmique de polyadénylation
reconnaît le ACE et ajoute une queue de 150 nucléotides A.

La régulation traductionnelle a été particulièrement étudiée dans les réticulocytes. Un

mécanisme qui implique eIF2 le facteur d’initiation qui s’associe à l’ARNt initiateur et le
ramène vers le ribosome, quand le Met –ARNt est associé au site P, le facteur eIF2B
s’attache à eIF2 en le lecyclant avec l’aide de GTP. La maturation des réticulocytes inclut
la destruction du noyau cellulaire. Quand les cellules deviennent déficientes en fer ou
l’hème la traduction de l’ARNm de l’hémoglobine est réprimée. Une protéine kinase
appelée HCR (hemin-controlled repressor), est activée catalysant la phosphorylation de
eIF2. Cette forme de eIF2 forme un complexe stable avec
eIF2B et n’est plus disponible pour la traduction.

194
VI.3.5. Contrôle post-traductionnel
Un ARNm produit de façon constitutive peut être continuellement traduit avec le niveau
de protéine produite contrôlé par la dégradation de cette protéine. La protéine peut être
très stable comme ceux de la lentille des yeux des vertébrés supérieurs qui persistent
pour toute une vie. La protéine ubiquitine est un marqueur pour la dégradation. Cette
protéine hautement conservée est essentiellement identique chez des organismes très
différents comme la levure et les humainsLe mécanisme n’est pas connu mais il implique
un complexe de trois enzymes appelé protéasome qui est ATP dépendant. La demi-vie
des protéines eucaryotiques varie entre 30s et plusieurs jours. Le signal est le terminal
amine de la protéine qui est la clé Si c’est une arginine lys phe leu et trp, ils spécifient une
demi-vie de 3 min. La régulation de la cycline pendant le cycle cellulaire est très
important.

Exemple
Développement et segmentation
Le développement requiert une transition dans la morphologie et la composition des
protéines après une expression différente des gènes.
Exemple Drosophila
La polarité de l’organisme et son métamérisme. Pendant le développement, ces
segments deviennent différenciés en tête, thorax et abdomen. L’œuf avec 15 cellules
nourrices, est entouré par une couche de cellules folliculaires. L’ARNm et les protéines
sont déposés dans l’œuf avant la fertilisation. Ils jouent un rôle pendant le
développement. Une fois que l’œuf est fécondé, le noyau se divise sans produire une
réplication de la cellule ce qui crée un synthicium. Les noyaux migrent ensuite vers le
couche externe de l’œuf et forment une couche qui entoure le cytoplasme riche en
matière vitelline. C’est le blastoderme syncytial. Après d’autres divisions nucléaires, les
invaginations de la membrane entourent le noyau pour créer une couche de cellules qui
forme le blastoderme cellulaire. La mitose des cellules différentes n’est plus en
synchronisation. La destinée des cellules est déterminée par les ARNm et les protéines
déposées originalement dans l’œuf par les cellules nourricières et les cellules folliculaires.
Les morphogènes sont des protéines dont la concentration locale et l’activité cause la
cellule à prendre une certaine morphologie. Ils sont les produits de gènes appelés
« pattern regulating genes ».

195
On distingue 3 classes chez Drosophila : maternels, de segmentation et homéotiques ;
les gènes maternels sont exprimés dans l’œuf non fécondé. L’ARNm résultant reste
dormant jusqu’à la fécondation qui assure toutes les protéines nécessaires dans le dévpt
précoce jusqu’à la formation du blastoderme. Ces protéines déterminent la polarité de
l’œuf. Les gènes de segmentation sont transcrits après la fécondation et dirige la
formation de segments du corps. Au moins trois sous-classes de gènes de segmentation
agissent en stades successifs : les gènes gap divisent l’embryon en développement en
trois régions larges, et les gènes « pair-rule » avec les gènes de polarité de segmentation
définissent 14 rayures qui deviendraient les 14 segments d’un embryon normal. Les
gènes homéotiques sont exprimés plus tard. Ils spécifient quels organes et quels
appendices se développeront dans les segments particuliers.
Tous ces gènes sont activés dans les premières quatre heures alors que l’embryogenèse
prend presque un jour pour se compléter. Quelques ARNm et protéines sont présents
seulement pour quelques min à certains points durant cette période. Certains gènes
codent pour des protéines de transcription qui affectent l’expression d’autres gènes dans
une cascade de développement. Regulation au niveau de la traduction a lieu aussi, et
beaucoup de ces gènes régulateurs codent des répresseurs de la traduction, la plupart
d’entre eux s’attachent à la région UTR de l’ARNm. Cela assure la répression des ARNm
qui sont déposés dans l’œuf.

Les gènes maternels

Quelques uns sont exprimés dans les cellules nourrices ou folliculaires mais d’autres
dans l’œuf lui-même. Dans l’oeuf de Drosophila non fécondé, les produits de ces gènes
établissent deux axes : antéro-postérieur et dorso-ventral. L’évènement clé est le
développement précoce très tôt dans le développement de gradients d’ARNm et de
protéines. Quelques ARNm maternels ont des produits protéiniques qui diffusent dans le
cytoplasme pour être distribués de façon asymétriques dans l’œuf. Les cellules
différentes dans le blastoderme cellulaire hérite des quantités différentes de ces protéines
les mettant sur des voies différentes de développement. Les produits des gènes
maternels incluent les activateurs et les répresseurs transcriptionnels aussi bien que des
répresseurs traductionnels, qui régulent d’autres gènes de régulation de plan de
morphologie. Les gènes bicoides et nanos définissent au moins en partie l’axe antéro-
postérieur.

196
Le gène bicoide est un morphogène antérieur majeur et le gène nanos est le morphogène
majeur postérieur. L’ARNm du gène bicoide est synthétisé par les cellules nourrices et
déposé dans l’œuf non fécondé à côté de son pôle antérieur. Cet ARNm est traduit juste
après la fécondation et la protéine bicoide et diffuse en créant un gradient de
concentration qui sort du pôle antérieur par la septième division nucléaire. Cette protéine
est un facteur de transcription qui active l’expression de plusieurs gènes de
segmentation. Elle contient un homéodomaine ; c’est aussi un répresseur de traduction
de certains ARNm. Les quantités de cette protéine dans les parties variables de
l’embryon affectent l’expression subséquente d’un nombre d’autres gènes dépendant sur
un maximum. L’absence de cette protéine ou le changement de ses concentrations peut
donner des embryons anormaux .Dans le premier cas, on a un embryon avec deux
abdomens mais sans tête ni thorax. Ces embryons peuvent devenir normaux si on injecte
une quantité suffisante de l’ARNm de la protéine bicoide au pôle approprié. Le gène
nanos a un rôle similaire sauf que son effet est dans le pôle postérieur. La protéine
Nanos est répresseur traductionnel. D’autres gènes maternels ont leurs ARNm déposé
uniformément dans tout l’œuf. Trois de ces ARNm codent les protéines Pumilio,
Hunchback et Caudal. Caudal et Pumilio sont impliqués dans le développement de
l’extrémité postérieure de la mouche. Caudal est un facteur de transcription avec un
homéodomaine. Pumilio est un répresseur traductionnel. Hunchback joue un rôle
important dans le développement de l’extrémité antérieure de la mouche et est aussi un
régulateur transcriptionnel d’une variété de gènes, dans certains cas positif et dans
d’autres cas négatif. Bicoide réprime la traduction de caudal dans l’antérieur mais aussi
active la transcription de hunchback dans le blastoderme cellulaire. Hunchback est
considéré comme étant en même temps un gène maternel et un gène de segmentation.
Bicoide agit en augmentant la concentration de Hunchback dans l’antérieur de l’œuf. Les
protéines Nanos et Pumilio sont des répresseurs traductionnels de hunchback, en
réprimant la synthèse de sa protéine dans la partie postérieure de l’œuf. Pumilio ne
fonctionne pas en l’absence de la protéine Nanos. Le résultat est la dégradation de
l’ARNm de huchback dans la partie postérieure de l’œuf. L e manque de Bicoide dans le
postérieur mène à l’expression de caudal ; Donc, les deux protéines Hunchback et
Caudal sont exprimées avec des gradients de concentration (distribution asymétriques
dans l’œuf).

197
Les gènes de segmentation
L’expression des gènes gap est généralement régulée par des gènes maternels. Au
moins quelque uns des gènes gap codent pour des facteurs de transcription qui affecte la
transcription d’autres gènes de segmentation ou des gènes homéotiques. Un gène de
segmentation bien caractérisé est le « Fushi tarazu » de la sous-classe de « pair-rule ».
Si ce gène est délété, l’embryon développe sept segments au lieu de 14, chacun d’eux
ayant le double de la largeur d’un segment normal. La protéine « Fushi tarazu » est un
activateur transcriptionnel avec un domaine homéo. L’ARNm et les produits de ce gène
s’accumulent en sept rayures qui encerclent le deux tiers du postérieur de l’embryon. Ces
rayures démarquent la position des segments qui vont se développer plus tard. Ils
disparaissent si ce gène perd sa fonction. Ce gène et d’autres qui lui sont similaires
dirigent l’expression directement ou indirectement d’autres gènes dans la cascade du
développement.

Les gènes homéotiques

La perte d’un de ces gènes par délétion ou mutation cause l’apparence d’un appendice
normal à une position inappropriée du corps de la mouche. Un exemple est le gène
ultrabithorax. Quand sa fonction est perdue, le premier segment abdominal se développe
de façon incorrecte en ayant la structure du troisième segment thoracique. D’autres
mutations de ces gènes peuvent causer la formation d’une paire d’ailes supplémentaire,
ou des pattes à la place des antennes. Les gènes homéotiques sont distribués sur une
longue distance de l’ADN, le « ubx » ayant 77000 p.b. de longueur et contient des introns
jusqu’à 55000 p.b. la transcription de ce gène dure une heure. Ceci fait partie d’un
mécanisme temporel important de régulation des gènes du développement. La protéine
« Ubx » est un facteur transcriptionnel important qui contient un homéodomaine.

198