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Microbiologie Biologie des organismes

Physiologie bactrienne
applique
lidentification

!bactries
procaryotes
2 groupes taxonomiques
eubactries
arches

!levures, moisissures, champignons


(myctes)
!algues
!protozoaires (amibes, parasites)
eucaryotes infrieurs (protistes)

Sophie Bleves
bleves@imm.cnrs.fr

Comment observer les bactries?

Microscopie optique
Etat frais

c pithliales (35!m) GR (8!m) Bactries (1!m) Virus (10-100nm)


1 000 b sur 1 mm

Fixation + Coloration

Bleu de mthylne

- microscopie optique (G 1 000-1 500 fois)

bactries dun frottis


de yaourt

- microscopie lectronique (G >10 000 fois)


Contraste de phase
Encre de chine!

Acinetobacter

(cocci isols ou en chane


entours dune capsule)

E. coli

Formes diffrentes selon les espces

coques

bacilles

Coloration de Gram

sprirales

paisse couche de PG

Peptidoglycane:
rseau
de
longues chanes polysaccharides
pontes par peptides

sphriques
btonnets

fine couche relche de PG (7 8 nm) dans le


priplasme + membrane externe

fuseau

incurves

Coloration de Gram

paisse couche de PG

fine couche dans le priplasme relche+ membrane externe

Gram Mb externe

(bicouche asymtrique
phospholipides et LPS)

Peptidoglycane
Membrane plasmique
(bicouche symtrique de
phospholipides)

Priplasme
ou Mb interne

Gram +

Autres colorations

Coloration spores
(vert de malachite, contre
coloration fushine)
Bacillus thuringiensis

Microscopie lectronique

Coloration flagellaire
(Leifson, fuschine basique)
Vibrio

Microscopie lectronique balayage


E. coli x30 000
Microscopie lectronique transmission
E. coli

Identification de bactries

Identification de bactries

Echantillon

Echantillon -------------------------> Identification

- biologique (sang, urines...)


- eaux
- aliments
- environnement
-

Enrichissement
Isolement

Identification
(culture pure)

Il existe de nombreuses espces bactriennes, quon peut classer daprs


quelques critres fondamentaux :
- morphologie des colonies
-

forme & taille des cellules


coloration GRAM
quelques caractres biochimiques simples dorientation
mode respiratoire
mobilit

Les milieux de culture


Croissance et maintien des organismes en laboratoire
- aliments essentiels (acides amins, peptides, bases nucliques, sucres),
- lments minraux : fer, phosphore, soufre, magnsium,....
-facteurs de croissance (sang, protines, vitamines)
Systme tampon pour viter les variations importantes du pH
Milieu liquide ou semi-solide ou solide (agar)
1-milieux complexes (ou riches) : composition chimique inconnue (croissance de
la plupart des organismes)
peptones (hydrolysats de protines partir digestion viande, casine, soja,
glatine....) = source C et nergie
ex LB (Luria Broth), bouillon au soja
2-milieux synthtiques (ou minimums)
composs chimiques purs (phosphate, azote, soufre....) en solution dans leau
ex milieu M9

Une espce dans lchantillon


1- Enrichir

Plusieurs espces dans lchantillon


1- Isoler la bactrie dintrt
2-Enrichir

Morphologie des colonies


Couleur
Aspect (sec, gras, transparent)

--> Morphologie des colonies

Les types de milieux de culture

La temprature peut tre slective

Milieux solides pour lisolement


liquides pour culture de bactries pures ou lors dinfection monobienne
!: bactries incultivables (Mycobacterium leprae: intracellulaire obligatoire)

4C

37C

1- milieux slectifs empchent la croissance de certaines bactries et favorisent


la croissance de celles dintrt = SELECTION
ex
Antibiotique
Drigalski (cristal violet) : croissance GSS (sels biliaires) : croissance Salmonella, Shigella
Chapman (75% NaCl) : croissance Staphylococcus

60C

Serratia marcescens
E. coli
Bacillus stearothermophilus

Thermophiles
Msophiles

Extrmophiles

Pshycrophiles

E. coli et Proteus mirabilis


(Drigalski)

S. aureus
(Chapman)

Antibiogramme
(inhibition croissance)

test catalase (addition H2O2 )


+: dgagement H2

Les types de milieux de culture


2- milieux diffrentiels: distinction de diffrents groupes de bactries
(caractristiques biologiques) = IDENTIFICATION
Mee proprits biochimiques d'une bactrie pour commencer l'identifier: tude
du mtabolisme respiratoire, des glucides, des protines, des lipides....

test urase!:
Production NH3 --> "pH (indicateur
color, rouge de phnol)

milieu jaune doeuf!: hydrolyse des lipides


E. coli -

Utilisation du Lactose
MacConkey utilisation --> "pH
(indicateur color, rouge neutre)

E. coli -

Caractre fermentaire (2 &3) ou oxydatif (1)


Dgradation Glu -->dchets acides (indicateur de pH, rouge de phnol)
Production soit de CO2 soit de CO2 et H2 (insoluble)
Lac+ (colonies rouges)

Bacillus +

glose au sang!: bactries hmolytiques ou


non
mobilit (0,5% agar)

Alcaligenes -

E. coli -

Lac- (colonies incolores)

Fermentation Production H2 -

+-

Proteus vulgaris +

S. aureus +

Effet de loxygne

Tests didentification en micromthode


Galerie API20-E (Biomrieux)
- activit fermentaire est rvle avec un milieu type contenant un sucre, un
indicateur color des changements de pH (fermentation sucre " pH)

+ O2

+ O2

Effet de lO2

Exemples

Arobie strict
(1)

Accepteur final dlectrons lors


respiration arobie (rduit en eau)

Pseudomonas, Acinetobacter,
Neisseria

Microarophile
(3)
Aro-anarobie
facultatif (2)

+-

Ncessaire < 0,2 atm (PP < celle air)

Campylobacter, Mycobacteriaceae

Pas ncessaire, mais utilis (switch)

Entrobactries (Escherichia,
Salmonella), streptocoques,

Pas ncessaire, non utilis (fermentation)

Anarobie
arotolrant

Anarobie
strict (4)

(oxydation des substrats et fermentation)

Toxique (fermentation, respiration


anarobie, photosynthse)
Culture sous atmosphre rductrice

- milieux de culture dont la composition permet de mee une activit enzymatique: -

galactosidase (ONPG), lysine dcarboxylase (LDC), ornithine dcarboxylase (ODC), urase


(URE)

staphylocoques

Bactries intestinales (Bacteroides,


Fusobacterium, Clostridium) et flore
commensale

Systmes automatiss
plus sensibles
mesures photomtriques en continu
--> identification des principales bactries isoles en pratique mdicale en moins de 5 h

Identification de bactries
Echantillon

- biologique (sang, urines...)


- eaux
- aliments
--environnement

Enrichissement
Isolement

caractres morphologiques
caractres physiologiques et mtaboliques

caractristiques molculaires :
- composition en bases des AN (GC%)
- amplification-squenage gne codant ARN16S
(phylognie molculaire : appareils de traduction sont
trs conservs, non changs par transferts
horizontaux)
- comparaison de protines (squenage, Ac)

Identification
sur culture pure

Caractres biochimiques simples


Catalase (+ ou -)

GG+

Oxydase (+ ou -)
Coagulase (+ ou -)

12 groupes de bactries

Indole (+ ou -)
Utilisation des sucres (fermentation on non)

Thiobacillus
Agrobacterium

Desulfovibrio

Enterobacteria
Pseudomonads

Helicobacter

Activit enzymatique ou non (urase, glatinase, nitrate rductase)


Production dH2S ..
Tous ces caractres permettent dobtenir une identification de plus en plus
prcise, et finalement exacte de la bactrie

Gram +
GramProteobacteria

En amas : Staphylocoques
(grappe de raisins)

Gram +

Coques Gram +
Commensaux (peau, muqueuses, tube digestif)
En chanettes: Streptocoques, entrocoques

Staphylococcus aureus
(supuration, septicmie)

En diplocoques: Pneumocoques

Streptococcus pyogenes
(angine, scarlatine)

Streptococcus pneumoniae
(otite, pneumonie, mningite)

Bacilles Gram +

Listeria monocytogenes

Gram -

(mningite, avortement)

Clostridium difficile
(diarre post antibiotique)

Bacillus anthracis

(maladie du charbon,
herbivores transmissible
lhomme)

Coques Gram -

Neisseria meningitidis (mningocoque: mningite, septicmie)


Neisseria gonorrhoe (gonocoque, MST)

Gram -

Entrobactries

Autres genres importants en pathologie humaine

Bacilles Gram -

2 familles importantes en pathologie humaine :


Les entrobactries (Enterobacteriacae)
Les Pseudomonas (Pseudomonacae)

E. coli - commensal (infection urinaire)


- ETEC, EHEC, EIEC (gastro, speticmie)
Salmonella (infection digestive simple fivre thyphode)
Shigella dysenteriae (infection digestive mineure graveYersinia pestis

Pseudomonas aeruginosa
Burkholderia
Pathognes opportunistes
(infections nosocomiales et
mucoviscidose)

Mycobactries
Bacilles acido-alcoolo rsistants ou BAAR
Gram impossible --> coloration : Ziehl Nielsen

Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch)


Mycobacterium leprae

Spirochtes
Treponema pallidum (syphilis)

Vibrio cholerae (eau, pidmie Cholra)


Bordetella pertussis (coqueluche)

Germes intracellulaires : exemples

Mycoplasma pneumoniae
Chlamydia pneumoniae
Chlamydia trachomatis (MST)
Rickettsia conorii (fivre boutonneuse-tiques-)
Rickettsia typhi (typhus -puces et poux)
Bartonella henselae: maladie des griffes du chat

Borrelia burgdorferi (maladie de Lyme, morsure tique)