PCR

Fundamentos, variantes y aplicaciones

MSc. Edgar Neyra Valdez

Unidad de Genomica
Universidad Peruana Cayetano Heredia

Sntesis de cidos nucleicos: generalidades

La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en direccin
5 3
Las DNA polimerasas pueden iniciar la sntesis de una
cadena nueva utilizando una hebra molde
Las DNA polimerasas adems de la hebra molde,
necesitan un iniciador (primer o cebador de extensin)
Se requieren adicionalmente los dNTP y el cofactor Mg

Reaccin en cadena de la polimerasa PCR

PCR es bsicamente una tcnica de
amplificacin del DNA.

DNA

PCR

(molecula sencilla) amplificacin

Muchas
moleculas

Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa

5

-T A C G T
-A T G C A T G C A T G C * *

Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa

5

-T A C G T A
-A T G C A T G C A T G C * *

Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa

5

-T A C G T A C
-A T G C A T G C A T G C * *

Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa

5

-T A C G T A C G
-A T G C A T G C A T G C * *

Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa

5

-T A C G T A C G T
-A T G C A T G C A T G C * *

Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa

5

-T A C G T A C G T A
-A T G C A T G C A T G C * *

Reaccin en cadena de la polimerasa PCR

Despues del primer periodo de sintesis de

DNA, tenemos copiada una cadena de
DNA
Primer 1

Extensin de la cadena

Cadena original de DNA

Cmo produce este proceso una AMPLIFICACIN?

Reaccin en cadena de la polimerasa PCR

Primero, la separacin de las dos cadenas de DNA a alta

temperatura (94C)

Reaccin en cadena de la polimerasa PCR

Primero, la separacin de las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (94C)

Reaccin en cadena de la polimerasa PCR

Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva
cadena con la DNA polimerasa
2
1

Al mismo tiempo, la cadena original se copia

nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1
Ahora tenemos dos copias de la molcula original

Reaccin en cadena de la polimerasa PCR

Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Fusin
94C

Hibridizacin
50-60C

Extensin de
La cadena
72C

Primer Ciclo
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias

2do Ciclo
94C
50 - 60C
72C

Mltiples ciclos darn un incremento exponencial en el

nmero de copias

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Temperatura

100

Melting
94 oC

PCR

50

Tiempo

DNA de
cadena doble

Temperatura

100

Melting
94 oC

PCR

50

Tiempo
3

DNA de
cadena simple

Calor

Temperatura

100

Melting
94 oC

50

PCR

Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC

Tiempo
3

5
5

Hibridacin
de primers

5
5

Temperatura

PCR
100

Melting
94 oC

50

Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC

Tiempo
3

Calor
5

Calor
5
5

30 ciclos

Temperatura

PCR
100

Melting
94 oC

50

Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC

Tiempo
3

5
5

30ciclos

Temperatura

PCR
100

50

Melting
94 oC

Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC

0
3

Tiempo
5

5
5

Calor
5

Calor
5

30ciclos

Temperatura

100

50

Melting
94 oC

PCR

Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC

0
3

5
5

Tiempo
5

30ciclos

Temperatura

PCR
100

Melting
94 oC

50

Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC

0
3

5
5

Tiempo
5

Fragmentos de
tamao definido

30ciclos

El numero de copias del DNA delimitado por los primers se

duplica en cada ciclo de PCR.
Numero de copias
1
2
4

0
1
# ciclos

16

32

64

Termociclador

Electroforesis en agarosa

Electroforesis en agarosa

VENTAJAS DE PCR SOBRE

OTRAS TECNICAS
ALTA SENSIBILIDAD
ALTA ESPECIFICIDAD
RAPIDEZ

DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA
templado especfico o productos amplificados previamente)

TECNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN PCR

PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultnea
PCR Nested: amplificacin de una secuencia dentro de otra
previamente amplificada

RT-PCR

: deteccin de mRNA

IC-PCR

: inmunocaptura previa a PCR

Real Time PCR : cuantificacin de copias iniciales en tiempo real

PCR-Diagnstico Molecular
Un aproximacin ha sido encontrar secuencias
genmicas especficas de gnero o especie:
protenas de choque trmico 90 (Hsp 90),
lanosterol demetilasa, proteinasa aspartica,
quitina sintasa, y actina son algunos ejemplos.
Estas secuencias se encuentran casi
exclusivamente en copias simples en el genma,
hacindolas altamente especficas.

PCR-Diagnstico Molecular
Otra aproximacin es la de amplificar
secuencias genmicas altamente conservadas
que se encuentran en copias mltiples
(generalmente unidades transcripcionales de
50-100 copias) presentes en las especies
fngicas: tenemos el gen 18S rRNA, 5S, 28S
rRNA mitocondrial, regiones ITS.

PCR Multiplex

- Varias secuencias target en forma simultnea.

- La eficiencia de amplificacin de ambos targets no es
necesariamente la misma:
- Secuencia de DNA de los diferentes targets
(%GC)
- Temperatura de hibridacin de los diferentes
primers
- Tamao de las diferentes secuencias target
- Artefactos / dmeros entre diferentes primers.

PCR-Diagnstico Molecular

Diagnstico Molecular

Diagnstico Molecular

PCR-Diagnstico Molecular
NESTED PCR o PCR anidado

Se realiza una segunda reaccin de PCR a partir del amplicn , usando

primers internos a la primera amplificacin

Aumenta la sensibilidad , ya que se realizan dos reacciones de PCR

consecutivas
Aumenta la especificidad, ya que se utilizan otros primers internos
especificos

Diagnstico Molecular

Levaduras

Nuclear rDNA 18S

ITS I

ITS II

5.8S

Its-1
PCR

Nuclear rDNA 26S

Its-4

Sequencing

Its-1
Its-4

Base de Datos ITS, ID y GeneBank

PCR-Diagnstico Molecular

Base de
Datos

Consiste en dos pasos:

Transcripcin reversa

RT-PCR

PCR
mRNA

OBJETIVO:
Deteccin de la expresin de
un gen por presencia de
mRNA

cDNA (simple cadena)

cDNA (doble cadena)

PCR

Transcripcin Reversa
1. Purificacin de RNA mensajero
2. Transcripcin reversa a cDNA (DNA copia)

RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

RNAc DNA

Prueba cuantitativa para determinar la carga

viral del VIH
Carga Viral = Viremia, virus en sangre
HIV es un retrovirus, se obtiene RNA y se
realiza el RT-PCR
Seguimiento de la terapia del paciente
infectado
Limite de deteccin de 40 Copias virales/mL
(ultrasensible)

Inmuno PCR-Diagnstico Molecular

Se emplean dos tecnologas, la deteccin basada en
anticuerpos y PCR, La deteccin del antgeno por el
anticuerpo se ve enormemente potenciada por la
conjugacin del sistema de deteccin del anticuerpo con
un fragmento de ADN que posteriormente es amplificado
mediante PCR.
Esta tcnica recuerda a ELISA (anlisis inmuno
absorbente ligado a enzima) y permite detectar incluso 10
femtogramos de protena.

Immuno-PCR vs ELISA

St

antibody with B
linked DNA

antibody with
linked enzyme

protein

Immuno-PCR

protein

ELISA

El Producto de PCR puede ser detectado por

electroforesis o por ELISA

REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL

Cuantificacin del nmero de copias de DNA
presentes en la muestra (diagnstico, monitoreo de
carga viral, comparacin entre nmero de copias en
diferentes subespecies, etc.)
Cuantificacin del mRNA por RT-PCR en tiempo real
(anlisis de la expresin de genes en diferentes
tejidos o en diferentes condiciones normales vs
patolgicas, efecto de drogas, etc)

Anlisis de la cintica de la reaccin

PCR en tiempo real

Deteccin y cuantificacin de reporteros fluorescentes.
La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de
producto formado en cada ciclo de PCR.
Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons moleculares,
SYBR Green

PCR en tiempo Real sondas de hidrolisis

Sonda especfica

PCR en Tiempo Real: deteccin mediante sondas de

hidrlisis.

Se lleva a cabo mediante la

hibridacin con una sonda
complementaria a una regin
interna de la secuencia blanco,
previamente a la amplificacin. Tm
sonda debe ser 10C > que el de los
cebadores, de modo que hibride
antes que los mismos.

PCR en Tiempo Real: deteccin mediante sondas de

hidrlisis.

SYBR Green
Agente que se intercala
en DNA de doble
cadena.

Desventaja: se une a
CUALQUIER DNA de
doble cadena (dmeros
de primers y productos
inespecficos).

DNA copy number

Copies of DNA=2N
1.8E+09
1.6E+09
1.4E+09
1.2E+09
1.0E+09
8.0E+08
6.0E+08
4.0E+08
2.0E+08
0.0E+00
0

10

15

20

25

30

35

PCR cycle
10
9
8
DNA copy number (log)

1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1,024
2,048
4,096
8,192
16,384
32,768
65,536
131,072
262,144
524,288
1,048,576
2,097,152
4,194,304
8,388,608
16,777,216
33,554,432
67,108,864
134,217,728
268,435,456
536,870,912
1,073,741,824
1,400,000,000
1,500,000,000
1,550,000,000
1,580,000,000

DNA copy number

CYCLE NUMBER
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34

7
6
5
4
3
2
1
0
0

10

15

20

25

30

35

PCR cycle

PCR reagent is the limiting factor!!

CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS

Se observa diferencias en los ciclos iniciales. Relacin como lnea recta
al utilizar logaritmos, porque la amplificacin por PCR es una reaccin
logartmica.

Real Time PCR

3. intensifier
1. halogen
tungsten lamp

2b. emission
filters

2a. excitation
filters

4. sample plate

5. ccd
detector
350,000
pixels

Amplification Plot of real-time PCR

DNA copy number (log)

Log phase

PCR cycle (Ct)

Level off/ plateau

PROBLEMAS
PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que
pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida
durante la reaccin. Esto es mas frecuente cuando se utiliza
SYBR-green.
ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:
Unin inespecfica de primers (mispriming): por unin de los
primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en
el DNA o cDNAs de la muestra
Dmeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando
productos pequeos

DISEO EN PLACA

Ventajas del PCR en tiempo real

Simple y rpida (semi-automatizada).

No hay manipulacin post-PCR.
Eliminacin de contaminacin por amplicones.
Cuantificacin del DNA o RNA molde inicial.
Muy sensible.
Deteccin de productos inespecficos con la opcin curva
de desnaturalizacin (Melt-Curve).
Deteccin de ms de un producto especfico en una
misma reaccin.
Extraordinariamente especfico.

Journal of Virological Methods 102:119-128, 2002

Journal of Clinical Virology 28:233-238, 2003

Polymerase chain reaction (PCR)

DNA polimerasas para PCR :Termoestables

Polymerase chain reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (PCR)

APLICACIONES DE PCR

MUTAGENESIS
RT-PCR
PRODUCCION DE SONDAS
DETECCIN DE INFECCIONES BACTERIANAS Y VIRALES
DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS
ESTUDIOS DE EVOLUCIN MOLECULAR
ESTUDIOS DE MEDICINA FORENSE
ESTUDIOS DE FILIACIN