OBJETIVO

Utilizar una tcnica sencilla de extraccin de cidos nucleicos de clulas

eucariotas
Justificar la tcnica en base a las caractersticas de las estructuras celulares
Separar los cidos nucleicos del resto de estructuras
Observar al microscopio la estructura de los cidos nucleicos
Evidenciar el carcter cido de los cidos nucleicos
Demostrar el nivel de empaquetamiento de los cidos nucleicos
INTRODUCION
La tcnica de extraccin de cidos nucleicos en eucariotas, est relacionada con
su ubicacin en el ncleo celular y las propiedades fsicas y qumicas de todas las
biomolculas celulares.
Es preciso desorganizar la estructura de paredes y membranas para liberar los
cidos nucleicos.
Por mecanismos mecnicos y posteriormente qumicos a travs de la solucin de
lisis, se acta sobre las paredes y las
estructuras lipoprotenas de las
membranas.
Se extraen de la mezcla de fragmentos celulares con alcoholes especficos, en los
que los cidos nucleicos no son solubles.

MATERIALES
Tubos de ensayo
Vasos de precipitado
Probeta
Varilla de vidrio
Portaobjetos
Cubreobjetos
Embudo para filtrar
Mano de mortero
Tubos de ensayo para centrfuga
Pipetas Pasteur
Papel de filtro
Gradilla para tubos
Colador metlico
Tijeras
Pinzas

EQUIPOS
Balanza
Batidora de cocina
Bao termosttico
Centrfuga 15.0000rpm
Cmara frigorfica
Nevera-congelador
Microscopio ptico 1000x

REACTIVOS
Disolucin de homogenizacin o solucin salina al 0,9% de NaCl, mantener a 4C:
Agua des ionizada 150mL
NaCl 1,5g
NaHCO3 bicarbonato de sdio 5g
Disolucin de lisis o Buffer de lisis mantener a 4C:
Agua desionizada 250mL
NaCl 1,5g
NaHCO3 bicarbonato de sdio 5g
SDS dodecilsulfato sdico 5mL
Proteinasa K 10mg/mL (zumo de pia)
Alcohol enfriado mantener a 0C
Isopropanol 80mL de o bien
Etanol 70% 150mL de
Azul de metileno, colorante bsico

5.3 PROCEDIMIENTO
PREPARACIN DE LA MUESTRA - HOMOGENIZACIN
El procedimiento se inicia homogenizando, disgregando y triturando la muestra
mediante una licuadora o batidora con una solucin de homogenizacin o solucin
salina enfriada a 4C.
La trituracin mecnica produce la rotura de las clulas de los tejidos u rganos de
la muestra escogida y la liberacin del contenido celular, donde se encuentran los
cidos nucleicos.

FILTRACIN
A continuacin se realiza una filtracin para separar y eliminar las estructuras
celulares de mayor tamao.
La solucin filtrada contiene los cidos nucleicos, pero todava confinados en los
ncleos.

LISIS Y SEPARACIN
Se aade solucin de lisis a 4C, que solubiliza las membranas nucleares y facilita
la liberacin de los cidos nucleicos.
Esta solucin de lisis contiene el detergente inico dodecil sulfato de sodio, SDS,
que dispersa las lipoprotenas de las membranas y desnaturaliza complejos
protenicos.
Las sales de la solucin de lisis, neutralizan las cargas negativas que inician la
precipitacin de los cidos nucleicos
La proteinasa K es una enzima proteoltica que acta sobre las protenas. Nuestro
mtodo aade zumo de pia que contiene esta enzima.
Generalmente las soluciones de lisis contienen una sustancia que protege los
cidos nucleicos de la accin de las enzimas. Se trata de EDTA, sustancia

inhibidora de la accin de las ADNasas. Nuestro mtodo no incluye EDTA en la

solucin de lisis.
Se centrifuga la muestra obtenida, as se consigue separar una fase slida, pellet
(restos de clulas, protenas, lpidos) de una fase acuosa, sobrenadante, que
contiene cidos nucleicos, hidrfilos y solubles en agua debido a sus grupos
fosfato.

PRECIPITACIN
Este sobrenadante se dosifica en un tubo de ensayo al que se aade isopropanol
o etanol muy fro, produciendo la deshidratacin y total precipitacin de los cidos
nucleicos insolubles en alcohol.
Los cidos nucleicos se sitan y visualizan en la interfase agua-alcohol.

RECUPERACIN Y ALMACENAMIENTO
Se recuperan los cidos nucleicos de la interfase y por centrifugacin y posterior
deshidratacin se liberan del agua y del alcohol.
La extraccin se guarda hidratada a -20C
Observacin al microscopio ptico
Se prepara una muestra al portaobjetos de los cidos nucleicos extrados. Se
realiza una tincin para su visualizacin.

PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE HOMOGENIZACIN O SOLUCIN

SALINA AL 0,9% NaCl
Mezclar:
150mL de agua desionizada
1,5g de NaCl cloruro de sodio
5g de NaHCO3 bicarbonato de sodio
Se agita la mezcla hasta que se disuelva bien. Mantener a 4C

PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE LISIS, BUFFER O TAMPN DE LISIS

(neutraliza el pH del medio)
Mezclar:
250mL de agua desionizada
1,5g de NaCl
5g de NaHCO3 bicarbonato de sodio
5mL de SDS, dodecilsulfato sdico
1mL de proteinasa K (zumo de pia)
Se agita la mezcla hasta que se disuelva bien. Mantener a 4C

PREPARACIN DE LA MUESTRA HOMOGENIZACIN

Cortar la muestra escogida a trocitos (250mg): tomate, cebolla, espinacas, hgado,
etc.
Introducir los trocitos de muestra en la batidora.
Aadir 20mL de solucin de homogenizacin enfriada a 4C y triturar hasta que
quede una masa homognea y semilquida.
Triturar con la batidora a intervalos de 5-10

FILTRACIN
Filtrar la muestra triturada con papel de filtro, casi mejor con un colador, ayudado
con una mano de mortero. Aadir 10mL de solucin de homogenizacin para
acabar de filtrar
Dosificar 15mL de la solucin filtrada en tubo de ensayo
Calentar al bao mara a 60C durante 10
Enfriar en hielo durante 10
Filtrar de nuevo y dosificar 10mL de la solucin filtrada en una probeta

LISIS Y SEPARACIN
Aadir 20mL de solucin de lisis fra, agitar suavemente durante 2 minutos. El
detergente captura las protenas y fragmentos de membranas, dejando los cidos
nucleicos libres
Llenar un tubo de centrfuga con esta mezcla
Centrifugar a 10.000 rpm durante 10 minutos
Se observa una fase acuosa sobrenadante en donde se encuentran los cidos
nucleicos.
En la base del tubo se han compactado los restos de las estructuras celulares, el
pellet.
Con una micropipeta, pipetear el sobrenadante, es la fase acuosa que queda en la
parte superior en donde se encuentran los cidos nucleicos.

PRECIPITACIN
Dosificar 5mL del sobrenadante en un tubo de ensayo y aadir 15 mL de
isopropanol a 0C o 30mL de etanol 70% a 0C
El alcohol se vierte cuidadosamente con pipeta Pasteur, hacindolo resbalar por
las paredes del tubo, mientras ste se mantiene inclinado.
Se observa la formacin de dos fases. El alcohol quedar sobre la fase acuosa.
Los cidos nucleicos al no ser solubles en alcohol, precipitan en direccin a la
capa de alcohol. No agitar el tubo.
Dejar reposar unos 10 minutos.
En contacto con alcohol los cidos nucleicos se desenrollan y se hacen visibles y
precipitan en la interfase agua-alcohol. Se trata de unas fibras blanquecinas, a
modo de telaraa, visibles a simple vista.

RECUPERACIN Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA

Llenar un tubo de centrfuga con 10mL de los cidos nucleicos precipitados con
isopropanol a 0C.
Agitar lentamente en principio, acabar agitando vigorosamente al final.
Centrifugar a 10.000 rpm durante 10
Descartar el sobrenadante
Reservar el pellet
Lavar cuidadosamente con etanol 70 procurando no disgregar ni perder el pellet
Descartar el alcohol. Deshidratar al aire o en estufa de 37C
Resuspender el precipitado en agua ultra pura para hidratar y conservar los cidos
nucleicos obtenidos
Guardar a -20C para posteriores usos

OBSERVACIN AL MICROSCOPIO PTICO

Preparar una muestra de los cidos nucleicos
Extraer con una pipeta Pasteur
Situar en un portaobjetos
Hacer una tincin especfica con un colorante bsico, azul de metileno.
Cubrir con el cubreobjetos
Observar al microscopio ptico

6. TRATAMIENTO DE DATOS
Sin tratamiento de datos.

7. NOTAS DE SEGURIDAD Y MEDIOAMBIENTE

Usar bata, guantes y gafas de seguridad apropiados en todo momento. No es
necesario trabajar en vitrina.

Lavarse las manos con jabn y agua despus de manipular los reactivos y
material biolgico.
Seguir las instrucciones de las etiquetas y FDS de los productos manipulados.
Las muestras utilizadas no son peligrosas ni txicas.
Los colorantes no son txicos y son productos biodegradables
El isopropanol i el etanol son sustancias fcilmente inflamables. Se deben
mantener los recipientes bien cerrados.
Son productos poco contaminantes.