28

Bases bioqumicas de los mtodos para hemoglobina glicosilada

7 min.

Existen diferentes mtodos para

determinar hemoglobina glicosilada, en
esta nota la Lic. Irene Aranda de BG
ANALIZADORES S.A. describe cada uno de
ellos, su utilizacin y eficiencia destacando
un mtodo enzimtico llamado DIAZYME
que posee mayor precisin y exactitud,
adems es ms simple, ms rpido y tiene
gran correlacin con los mtodos de
referencia

Lic. Irene Aranda

BG ANALIZADORES S.A.

E-mail:
irenearanda@bganalizadores.com.ar

Los valores de Hb Glicosilada son

utilizados para evaluar por largos perodos
la glucosa en el control de la diabetes,
especialmente en diabticos insulinodependientes, pues los niveles de glucosa
en sangre y en orina poseen una variacin
diaria significativa.
La hemoglobina est compuesta
por varias fracciones. La Hb1 es la fraccin
de hemoglobina glicosilada total o general,
la Hb0 la no glicosilada y la HbA1c es la
glicosilada particular. Existen varias tcnicas
utilizadas para medir la fraccin de la
hemoglobina y los diferentes mtodos

Bioanlisis I Set Oct 12

analticos detectan diversas fracciones de

est.
En una electroforesis en resinas
de intercambio inico, la hemoglobina
glicosilada (Hb1) migra ms rpido que la
hemoglobina no glicosilada (Hb0),
permitiendo as separar las dos fracciones
de la hemoglobina.

las partculas de la fase fija va disminuyendo

hasta llegar al tamao de un micrn,
generando por ende la necesidad de utilizar
altas presiones para lograr que fluya la fase
mvil.
Si bien es un mtodo de referencia,
es tcnicamente complejo, consume ms
tiempo y es de mayor costo, por lo que no se
usa como rutina en la prctica clnica.

Cromatografa de columna
Mtodos inmunolgicos
Se ha ubicado como una prueba
obsoleta ya que presenta problemas de
calibracin, baja reproducibilidad y en
medicin de la HbA1c. Adems es
dependiente del pH y la temperatura a la
cual se realiza la prueba. Al principio se
utilizaba este mtodo por ser una prueba de
fcil acceso, pero hoy en da solo la utilizan
laboratorios clnicos de bajo volumen de
muestras.
Cromatografa liquida de alta eficiencia
HPLC
Utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en
diferentes tipos de interacciones qumicas
entre las sustancias analizadas y la columna
cromatogrfica.
Consiste en hacer pasar a la
hemoglobina glicosilada por la columna
cromatogrfica (de vidrio) a travs de la fase
estacionaria, mediante el bombeo de
lquido a alta presin a travs de la columna.
La muestra a analizar es introducida en
pequeas cantidades y sus componentes se
retrasan diferencialmente dependiendo de
las interacciones qumicas o fsicas con la
fase estacionaria a medida que adelantan
por la columna. Su objetivo es aumentar la
eficiencia en las separaciones, el tamao de

Los mtodos inmunolgicos utilizan

anticuerpos contra una secuencia de
aminocidos que varan de 3 a 8 de la
fraccin N-terminal de la hemoglobina
glicosilada. Tienen como ventaja el que son
especficos contra la HbA1c y pueden ser
incorporados a los autoanalizadores de
qumica clnica ya sea por mtodos de inmunoturbidimetra, como se esquematiza.
En la determinacin por esta
tcnica se cuantifican tanto la hemoglobina
total como la HbA1c. Para la cuantificacin
de la hemoglobina total se hemoliza la
muestra y la solucin se somete a un bfer
alcalino de un detergente no inico,
convirtiendo la hemoglobina en hematina y
estabilizando la molcula. La hematina
torna la solucin de un color verde, que es
cuantificado a una longitud de onda de 604
nanmetros (nm). Para la cuantificacin de
la HbA1c igualmente se debe hemolizar la
muestra y se procede con dos pasos
elementales:
1) la solucin es incubada con micropartculas cubiertas con anticuerpos especficos
dirigidos contra la HbA1c; en esta reaccin
se une un solo anticuerpo a cada sitio de
glicosilacin presente en la hemoglobina.
2) Una vez terminado este paso, se intro-

29

duce en la solucin un hapteno aglutinante

que posee varios sitios inmunoreactivos
que unir las micropartculas con anticuerpos que han quedado libres. En este
paso se pueden unir varios anticuerpos a
una sola molcula de haptenos y darse el
fenmeno de aglutinacin. La determinacin requiere de la cuantificacin de la
turbidez de la suspensin a una longitud de
onda de 700 nm. En este sentido a mayor
a g l u t i n a c i n , m ay o r c a n t i d a d d e
anticuerpos libres y menor concentracin
de HbA1c disponible para unir las
micropartculas a los anticuerpos, lo
anterior como consecuencia de que la
HbA1c compite con el hapteno por la unin
del anticuerpo.
Otro mtodo es el de inmunoanlisis enzimtico en donde se utiliza una
proteasa para digerir la hemoglobina y
producir fructosil-aminocido que por la
accin de una oxidasa produce perxido de
hidrgeno.
El principio de la prueba se puede
resumir en cuatro pasos bsicos:
1) Hemlisis: se emplea una solucin que

30

permite la lisis de los eritrocitos y la

reduccin con agentes oxidantes de
molculas interferentes
2) Protelisis: se somete la muestra a una
digestin proteoltica donde las protenas
presentes en la solucin, incluida la
hemoglobina, liberan aminocidos y
pptidos;
3) Reaccin enzimtica 1: la valina de la
hemoglobina que est glicosilada, es el
sustrato de la enzima especfica fructosilvalina-oxidasa. En esta reaccin se produce
perxido de hidrgeno (H2 O2 )
4) Reaccin enzimtica 2: empleando la
enzima peroxidasa de rbano se promueve
la produccin a partir del H2O 2 de un
cromgeno. La seal emitida por el cromgeno es cuantificada y es proporcional a
la concentracin de aminocidos de valina
glicosilados presentes en la muestra. La
determinacin del porcentaje de HbA1c con
esta tcnica es directa y requiere de una
curva estndar. Esta tcnica no requiere la
determinacin de la concentracin de la Hb
total.
DIAZYME, una Empresa de EE.UU
ha desarrollado este ltimo mtodo
enzimtico ofrecindolo en dos presentaciones:
1-Kit completo para su adaptacin a
autoanalizadores de qumica clnica.

ESPECIFICACIONES DEL TEST:

Ensayo enzimtico

2-A travs de un novedoso instrumento, el

SMART 700, un analizador libre de
mantenimiento, fcil de usar, con una
velocidad de menos de 8 minutos por test y
certificado por la NGSP.

Valores expresados por IFCC/NGSP

Precisin: CV < 4% (a 5% HbA1c)

Es un instrumento portable, con un

peso de apenas 3.4 Kgs, se puede conectar a
una pc y transmitir datos a una interface,
imprime resultados y guarda hasta 250
determinaciones.
El kit para la determinacin de la
HbA1c posee todos los elementos
necesarios para la ejecucin de la prueba,
trae una tarjeta con la curva de calibracin
especfica para cada lote, se ofrecen
adems controles normales y patolgicos.
Este mtodo posee mayor precisin
y exactitud que la columna de intercambio
inico, es ms simple, ms rpido y tiene
gran correlacin con los mtodos de
referencia.

Bioanlisis I Set Oct 12

Linealidad4 12% (NGSP/DCCT)

ESPECIFICACIONES DEL INSTRUMENTO:
Medidas:
24 x 14.5 x 14 cm
9.4 x 5.7 x 5.5 in
Peso: 3.4 kgs
100 240V (50 -60 Hz)
IVD CE
Computadora/Host Interface (RS 232 or
USB)
Impresora opcional disponible