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Laurenti Pauline, Dedreuil-Monet Thibaut

Master 2 Professionnel "Chimie Analytique et Instrumentation"

514.2

S1

Promotion 2006

Rayleigh (345 nm)

400

Raman
300

hvAbsorption

Hfluo

(excitation)

Em = 454 nm

(mission)

200

Harmoniques

100

0.0
200.0

Schma de Jablonski (1)

Spectre dabsorption UV visible de la quinine


dans H2SO4 0.05 M, [quinine] = 8 ppm

300

400

500

600

700

800

900.5

nm

Schma de Jablonski (2)

Spectre dmission 345 nm de la quinine


dans H2SO4 0.05 M, [quinine] = 0.04 ppm

Principe:

Lexcitation de certains composs par une source lumineuse, provoque un rayonnement de la molcule excite. Dans le cas de la fluorescence, ce rayonnement correspond la rmission partielle ou
totale de lnergie absorbe: passage dun tat singulet S1 un tat fondamental S0, (fluorescence est toujours suprieur absorption). La phosphorescence diffre par le fait que lmission est plus lente, et que le retour
ltat fondamental se fait partir dun tat triplet.

Lorsque les longueurs dondes dexcitation et dmission sont proches il ne faut pas confondre la fluorescence de lchantillon avec deux missions parasites :

Diffusion Rayleigh: rmission dune petite fraction de la lumire excitatrice dans toutes les directions, par les molcules du solvant avec la mme longueur donde.
Diffusion Raman: de 100 1000 fois plus faible que la diffusion Rayleigh, provient du transfert dune partie de lnergie de la radiation excitatrice aux molcules de solvant sous forme dnergie de vibration. Les
molcules de solvant rmettent des photons de moindre nergie que ceux ayant servi les exciter.

Appareillage

Relation
Ifluo = f([Quinine])
Ifluo = f.I0.( 1-10-.l.[C] )

Extraite de lcorce du quinquina, un arbre dAmrique


du sud, la quinine est aujourdhui utilise dans de
nombreux
mdicaments
contre
le
paludisme
(Quinimax) et dans diverses boissons pour son
principe amer (Schweppes).

1015.6

800

600

400

200

-0.3
200.0

300

400

500

600

700

800

Cet alcalode est un compos hautement fluorescent


(rendement quantique f = 54 % ).
Excit sa max(Absorption) = 347 nm, il met une intensit
de fluorescence max(Emission) = 454 nm.

900.5

nm

Spectres dmissions de fluorescence de 17


solutions de quinine dans H2SO4 (0,05M)

I fluo

Limite de linarit de la courbe talon

Cuves en quartz
Manipulez moi
avec prcaution

300 !!!

Spectrofluorimtre Perkin Elmer LS 55

Auto-quenching

900
800
700
600
500
400
300
200
100
0

environ
30 000
!!!

La quinine

600.28nm

Limite la linarit

20

40

60

80

100

120

Formule chimique : C20H24N2O2


(324, 41 g/ mol)

[quinine] ppm

Ifluo = 2,3.I0 ..l.f.[C]


= K.[C] (si Abs < 0.04)
Droite d' talonnage de la Quinine (zone de linarit)

Schma dun spectrofluorimtre

I fluo

700
600
500
400

511nm

300
200
100
0

Remarques avant utilisation


Rglage de certains paramtres:

y = 359,64x
2

R = 0,9992

0,5

1
[quinine] ppm

1,5

9 Fentrages (Ex / Em)


9 Longueur donde dexcitation
9 Filtres

Quinine: zone de linarit 0,004-1,5ppm

Pour le dosage de la quinine:

Limitation
Pour les solutions concentres
absence de relation linaire: phnomne
(diminution
de
dauto-quenching
lintensit de fluorescence).

Shampoing Klorane

Mdicament Quinimax
(en ampoule 250mg/2mL)

Boisson
tonic

9 Fentrages (Ex: 5 / Em : 5)
9 Longueur donde dexcitation: 345 nm
9Filtres:pas de filtres

Autres.

Avantages/inconvnients

La spectrofluorimtrie prsente de nombreux avantages:


sensibilit (100 1000 fois suprieure quen UV visible),
prix, acquisitions rapides des spectres, simplicit
dutilisation, possibilit de travailler avec microplaque....

Phnomne de quenching
Lenvironnement peut entraner un
phnomne de quenching ou
extinction de fluorescence dun
fluorophore.

Effet de quenching
2

Ifluo0/Ifluo

1,5
y = 164,55x + 1,0014
R2 = 0,9996

1
0,5
0
0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

[NaCl] mmol/L

Ci-contre, mise en vidence du


phnomne par les ions chlorures.

La loi de Stern-Volmer rgit ce phnomne : F(o)/ F = 1 + Ksv [Q]


Quencher
[NaCl] mmol/L

[quinine] ppm

Ifluo

Ifluo(0) / Ifluo

0,4

159,72

1,00E-03

0,4

136,24

1,17234292

3,00E-03

0,4

107,51

1,48562924

5,00E-03

0,4

87,35

1,82850601

Remarque: loxygne dissout est aussi un quencher (dgazage).

Rsultats
chantillons
Quinimax
(en ampoule)

Dilution
Dans H2SO4
(0.05 M)

Intensit de
fluorescence
u.a
(551nm)

Quantit
dans
linjectable
en mg/ mL

1/500 000

93,12

129.46

1/500 000

95.48

132.74

1/200 000

219.18

121.88

1/200 000

221.04

122.92

chantillons (Schweppes)
Dilution au 1/200me dans H2SO4
(0.05 M)

Oprateurs

Intensit de
fluorescence u.a
(551nm)

Quantit dans la
boisson (ppm)

122.40

68

2
3

129.6

72

119.43

66

128.30

71

les quantits de
quinine obtenues
exprimentalement peuvent
tre considres comme
justes et rptables.
En ce qui concerne le
shampoing Klorane, leffet de
matrice semble trop important
(dtergents), pour une tude en
spectrofluorimtrie.

Mais ltude de matrices complexes est difficile cause des


effets de quenching.

Autres spectres

Le spectre dmission de la drive


premire est gnralement utilis
pour doser un compos prsent dans
un mlange.
le spectre dexcitation obtenu avec
un spectrofluorimtre permet de
confirmer le choix de la longueur
donde dexcitation.

83.8
60

420.10
682.84

40

823.56
781.67

20

D1

0
-20

244.70

805.19

-40

478.52

716.01

877.44

-60
-80.8
200.0

400

600

800

900.5

nm

Bande dexcitation
Rayleigh