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La chromatographie

IV.1. Généralités sur la chromatographie

Le concept de Chromatographie en phase gaz a été introduit par Archer Martin et Richard Synge en 1941. La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est comme toutes les techniques de chromatographie, une technique qui permet de séparer des molécules d'un mélange éventuellement très complexe de nature très diverses. Elle s'applique principalement aux composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition. Elle est de plus en plus utilisée dans les principaux domaines de la chimie. IV.1.1. Définition :

La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successive sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase.

On définit un coefficient de partition K :

=

C S : concentration dans la phase stationnaire. S : concentration dans la phase stationnaire.

C m : concentration dans la phase mobile. m : concentration dans la phase mobile.

IV.1.2. Classification des techniques chromatographiques Les techniques chromatographique peuvent reparties suivant plusieurs critères : en fonction de la nature des deux phases en présence, ou du procédé utilisé, ou du phénomène physico- chimique responsable du coefficient de distribution k. Classification selon la nature physique des phases :

La phase mobile : fluide (liquide ou gaz).

La phase stationnaire : solide ou liquide.

La combinaison de ces différentes possibilités permet de distinguer :

Chromatographie liquide-liquide.

Chromatographie liquide-solide.

Chromatographie gaz-liquide.

Chromatographie gaz-solide.

Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Chromatographie en phase gazeuse ( CPG) Figure : appareil de CPG IV .2. Définition de la

Figure : appareil de CPG

IV .2. Définition de la CPG :

Technique de séparation applicable aux composés gazeux ou susceptibles d’être volatilisés par élévation de chauffage sans décomposition. Elle permet l’analyse de mélange éventuellement très complexe de nature et de volatilité

très diverses.

Manuel pratique de la CPG –P.ARPINO, A.VEROGNOL,P.WITIER /4eme

édition PARIS MILAN 1995

IV .2.1. Principe :

La chromatographie gaz-liquide (partage). La phase stationnaire est un liquide non volatil fixé par imbibition d'un support inerte. Le soluté se partage entre le gaz vecteur et le liquide stationnaire.

La chromatographie gaz-solide (adsorption). La phase stationnaire est un solide adsorbant (gel de silice, alumine…). Plus l'adsorption d'un soluté sur la phase stationnaire est élevée.

IV .3. Matériels

Description d'un chromatographe

IV .3. Matériels Description d'un chromatographe Figure : schéma d’un chromatographe en phase gazeuse Le

Figure : schéma d’un chromatographe en phase gazeuse

Le chromatographe comprend schématiquement 5 parties : une source de gaz, une chambre d’injection, un four dans lequel se trouve placé une colonne, un détecteur couplé à un enregistreur.

IV .3.1. Source de gaz La source de gaz (gaz porteur ou vecteur) constitue la phase mobile. Conservé sous pression

dans des « bonbonnes » métalliques, le gaz passe dans des détendeurs permettant d’obtenir des pressions allant de 0.2 à 4 bars. Ils existent des régulateurs permettent de choisir et de contrôler la vitesse de passage désirée de cette phase mobile. Elle variera selon les dimensions de la colonne. Les principaux gaz utilisés sont : N 2 , Ar, He, H 2 . Ils doivent répondre à un certain nombre de critères :

très grande pureté.

inertie vis-à-vis des substances à chromatographie.

très faible viscosité.

compatibles avec le système de détection.

05 chromato gaz

IV

.3.2. Injecteur :

Il permet d'introduire un liquide qui doit être vaporisé instantanément avant d'être transféré dans la colonne. Sa température doit être supérieure d'environ 20°C à la température du produit le moins volatil. Le gaz porteur est de préférence préchauffé, entre dans une chambre chauffée, obturée par une pastille d’élastomère, le septum, qui assure l’étanchéité à travers lequel Les gaz sont introduits soit par une seringue soit par un système de vanne et de boucles. La boucle est un tube qui est alternativement balayé par le mélange à analyser, ou par le gaz vecteur. Ce système permet l'injection de volumes constants pour des analyses multiples reproductibles.

Il existe deux types d'injecteurs. Ceux pour les colonnes remplies (peu nombreux actuellement) et

ceux pour les colonnes capillaires (le plus fréquent

)

Dans le cas des colonnes capillaires, 3 modes d'injections peuvent se présenter :

injection avec division (split) : le mélange est divisé en deux parties. La plus petite partie arrive sur la colonne alors que la plus importante est évacuée.

injection sans division (splitless) : le mélange n'est pas divisé en deux parties.

injection dans la colonne (on-column) : il n'y a pas d'étape de vaporisation l'échantillon .

a pas d'étape de vaporisation l'échantillon . Figure injecteur programmable split/splitless Figure : vue
a pas d'étape de vaporisation l'échantillon . Figure injecteur programmable split/splitless Figure : vue

Figure injecteur programmable split/splitless

Figure : vue en détail d’un PSS et on colonne

IV .3.3. Colonne :

C'est l'organe principal. Elle est constituée d'un tube généralement métallique de diamètre intérieur de l'ordre du millimètre. Ce tube contient la phase stationnaire constituée par un substance active ; solide, liquide .la colonne est balayée en permanence par un gaz appelé gaz vecteur (porteur). Les constituants de l’échantillon partis en même tempe de l’injection vont se détache les uns

des autres a traverse la colonne, selon leur affinité pour la phase stationnaire.

Manuel pratique

Il existe deux types de colonnes avec des variantes :

colonnes remplies ou à garnissage (packed)

colonnes capillaires (open tubular).

Les grains jouent le rôle du support de la phase stationnaire, elles sont à base de diatomite qui

peut être selon la phase stationnaire :

des grains macroporeux pour si la phase est liquide.

des grains de petits taille si la phase est solide.

A. Caractéristiques des colonnes remplies ou à garnissage

diamètre interne : 3,2 mm ou 6,4 mm

longueur : 0,5 à 3 mètres

tube :

acier inoxydable : inerte et bon conducteur de chaleur.

Verre : inerte mais mauvais conducteur de chaleur.

 Verre : inerte mais mauvais conducteur de chaleur. Figure : colonnes remplies B-Caractéristiques des colonnes

Figure : colonnes remplies

B-Caractéristiques des colonnes capillaires

diamètre interne

des colonnes capillaires  diamètre interne Figure : schéma d’une colonne remplies  longueur : 15

Figure : schéma d’une colonne remplies

longueur : 15 à 100 mètres

tube : silice fondue recouvert d’une mince couche de polyimide.

Figure : colonnes capillaires
Figure : colonnes capillaires
Figure : schéma d’une colonne capillaire
Figure : schéma d’une colonne capillaire

IV

.3.4. Le four

IV .3.4. Le four Figure : four de CPG C’est un four à bain d’air, pourvu

Figure : four de CPG

C’est un four à bain d’air, pourvu de résistances chauffantes et d’un système de ventilation et de brassage pour l’homogénéisation de la température. La régulation est assurée par un thermocouple, grâce auquel la variation n’excède pas ± 0,2°C, pour un intervalle de fonctionnement allant de la température ambiante jusqu’à 400°C. Sa température est en général de 20°C inférieure à celle du soluté de plus bas point d’ébullition.

Cette partie de l'équipement doit pouvoir fonctionner suivant deux modes :

isotherme entre 20 et 400°C

en programmation de température avec des séquences plus ou moins complexes.

IV .3.5. Détecteur :

Les détecteurs décèlent la présence des substances chromatographies dans le gaz vecteur au fur et à mesure de leur élution. Ils sont toujours placés en sortie de colonne. Ces substances modifient une propriété chimique ou physique du gaz et ces variations sont transformées par

le détecteur en signaux électrique qui sont amplifies et transcrit sous forme d’un graphique. A- Un Détecteur à conductibilité thermique (TCD) ou catharomètre :

Il est fondé sur une comparaison continuelle entre le flux de chaleur emporté par le gaz vecteur pur et le flux de chaleur emporté par le gaz vecteur chargé des molécules de soluté. Nous obtiendrons un signal chaque fois que l'un des constituants se présentera dans la cellule car la

conductibilité thermique du gaz vecteur (qui traverse le détecteur) varie quand le constituant X traverse le détecteur. B- Un détecteur à ionisation de flamme (FID) :

Figure : Détecteur TCD
Figure : Détecteur TCD
à ionisation de flamme ( FID) : Figure : Détecteur TCD Une tension de l'ordre de

Une tension de l'ordre de la centaine de volts est maintenue entre la buse de la flamme et une électrode entourant cette dernière. Lorsque les molécules traversent la flamme, elles sont ionisées ce qui provoque entre les électrodes un courant électrique qui est ensuite amplifié. Il a aussi l’inconvénient, contrairement au catharomètre, de détruire le soluté qui le traverse, car son principe est de brûler, dans une flamme d’hydrogène.

Figure : Détecteur FID
Figure : Détecteur FID

C-Un détecteur à absorption électronique (ECD) : des électrons sont émis que le tritium (H 3 ) ou le (Ni 63 ), en général par une source radioactive (rayonnement bêta), et traversent le gaz, lorsqu'un électron rencontre une molécule de gaz, il peut être capturé, ce qui fait varier l'intensité du courant d'électrons, cette intensité étant mesurée en continu. D- Un détecteur thermoïonique (NPD).

E- Un spectromètre de masse (MS) : utilisant principalement l'impact électronique ou l'ionisation chimique comme modes d'ionisation.

IV .3.6. Le chromatogramme :

comme modes d'ionisation. IV .3.6. Le chromatogramme : figure : représentation d’un chromatogramme C'est la
figure : représentation d’un chromatogramme
figure : représentation d’un chromatogramme

C'est la courbe donnant la concentration des produits sortant de la colonne (effluents) en fonction du temps ou du volume de gaz vecteur débité. Généralement cette courbe est une courbe de type gaussien (pic). Le premier pic est, uniquement avec un détecteur à catharomètre, le pic de l'air, inévitablement injecté avec le mélange inconnu. Il correspond au volume de gaz de la colonne car l'air n'est pas retenu par la phase stationnaire.

Le pic d'un composé quelconque se caractérise par :

t 0 : début de l'injection

tr : Le temps de rétention.

tr' : temps de rétention réduit.

h : La hauteur.

tm : temps mort.

Wb : largeur du pic à la base (ω).

Wh : largeur du pic à mi-hauteur (δ).

Vm : volume mort de la colonne.

base ( ω) .  Wh : largeur du pic à mi- hauteur (δ) . 

Figure : CHROMATOGRAMME

Le temps de rétention réduit est égal à la différence d'abscisses entre le composé et l'air, il est directement lié au cœfficient de partage du composé entre les phases mobile et stationnaire.

partage du composé entre les phases mobile et stationnaire. IV .4. Optimisation de la séparation :

IV .4. Optimisation de la séparation :

L’objectif du chromatographie est triple : obtenir des pics chromatographiques les plus fins

possibles (grande efficacité), les mieux séparés possible (bonne résolution), en un temps

d’analyse minimum. Dans cet but La plupart des utilisateurs travaillent en "programmation ",

ses méthodes dits les méthodes d’optimisation par les plans d’expériences (PE) .

IV .4.1. Paramètres influençant les séparations :

Sur quels paramètres peut-on jouer en GC ?

choix de la température de séparation :

choix de type de colonne :

choix de la phase stationnaire :

choix de Débit du gaz vecteur :

choix de système(s) d’injection :

A-Choix de Température :

de système(s) d’injection : A-Choix de Température : Figure :Paramètres influençant les séparations 
Figure :Paramètres influençant les séparations
Figure :Paramètres influençant les séparations

L'ensemble des organes décrits ci-dessus sont placés dans des enceintes thermostatées

à des températures programmées selon la disposition des organes et la nature de

l'échantillon à analyser.

L’injecteur : à une température de 20 à 30 °C au-dessus de celle de la colonne.

la colonne : La température de la colonne est en général inférieure de 20° C à celle du

point d'ébullition du soluté le plus volatil. Plus la température de colonne est basse,

meilleure est la séparation, mais cela risque d'allonger le temps d'analyse.

Le four : la température doit être légèrement supérieure à la température d'ébullition

des composés de manière à ce que les composés ne sortent pas trop tôt. On peut

travailler en isotherme, c’est-à-dire avec une température fixe durant toute l'analyse ou

avec un programme de température qui varie.

détecteurs : Il est également nécessaire que ces détecteurs puissent être portés à des

températures aussi élevées que les colonnes pour éviter qu’à leur contact les vapeurs

se condensent.

Le facteur de capacité dépend de la température.

RM : Souvent, on trouve dans un mélange complexe des espèces à bas et haut point

d’ébullition. Si la température est réglée de manière à obtenir une bonne résolution pour le

composé à bas PE, il faudra un temps relativement long pour éluer celui à haut PE. Au

contraire, si les conditions sont fixées pour le composé à haut PE, les espèces à bas PE

apparaîtront pour ainsi dire spontanément et leur séparation sera mauvaise. On propose,

alors, une programmation de la température régulièrement tout au long du processus de la

séparation.

B-Choix du gaz vecteur

long du processus de la séparation. B-Choix du gaz vecteur  Contrairement à l’HPLC, le Gaz
long du processus de la séparation. B-Choix du gaz vecteur  Contrairement à l’HPLC, le Gaz

Contrairement à l’HPLC, le Gaz Vecteur n’intervient pas dans le mécanisme de séparation.

Plus le gaz est pur, plus la durée de vie de la colonne est prolongée et plus la sensibilité s’en trouve augmentée.

Pratique : afin de garantir une excellente pureté, il est conseillé d’intercaler des filtres

(pièges) entre l’alimentation de gaz vecteur et le GC.

Des pièges et des filtres doivent être installés en amont du Chromatographe.

A- type de gaz vecteur (φ mobile) en fonction de :

Ses propriétés obligatoires : inertie, faible diffusion, pureté, peu coûteux, compatible avec le détecteur Example: N 2 , He, H 2 , Ar/CH4,

il est donc nécessaire qu’il y ait la plus grande différence possible entre la conductivité de ce

soluté et celle du gaz porteur. A cet effet, on utilise pratiquement toujours l’hydrogène

(danger d’explosion) ou l’hélium comme gaz vecteur.

B-le vitesse linéaire du gaz :

il faut un débit de gaz dans la colonne stable, reproductible et contrôlé

Débit recommandé pour le gaz vecteur :

Colonnes remplies 20-60 mL/min

Colonnes capillaires 0.5-2 mL/min

C-Système(s) d’injection :

Combien injecter ?

Comment injecter ?

A la main ?

autosampler

Gaz : Introduction à l’aide d’une chambre ou d’une seringue à gaz • Liquide : Introduction à l’aide de micro seringues • Solide : Introduction à l’aide de micro seringues après dissolution de l’échantillon dans un solvant approprié Volume d’Injection.

D-Choix de type de colonne :

Une augmentation de la longueur de la colonne augmente les temps de rétention mais s'accompagne souvent d'un élargissement des pics.

E-Choix de la phase stationnaire :

Le choix de la phase stationnaire conditionne la bonne séparation des constituants .Il faudra la choisir polaire ou apolaire en fonction de la nature des substances à séparer .On distingue :

les phases apolaires sont à base d’hydrocarbures aliphatiques saturés ou de silicones

(squalane, apiezon,

un rôle primordial, donc la différence dans ces forces reflétées dans les points d’ébullition

dans la phase apolaire la force de dispersion (interaction) joue

).

les phases polaires sont des polymères possédant des fonctions polaires : polyols, polyesters, polyamides. dans la phase polaire on trouve l’interaction dipôle-dipôle en plus des forces de dispersion

IV .4.2. Couplage de CPG :

IV .4.2. Couplage de CPG : Figure : schéma d’un appareil de couplage GC-MS L’identification de
Figure : schéma d’un appareil de couplage GC-MS
Figure : schéma d’un appareil de couplage GC-MS

L’identification de composants d’un mélange, nécessité ou non de “coupler” la chromatographie avec une méthode spectroscopique ou avec las pectrométrie de masse (CPG/SM ou GC/MS), contrôle de pureté, purification de produits (colonnes préparatives), suivi de réaction en continu pour optimiser des paramètres, dosages (quantification)… Les limites de la GC-MS sont celles de la chromatographie en phase gazeuse. Le facteur limitant étant la volatilité des solutés, cette technique est réservée à l’analyse de molécules aisément vaporisables et thermiquement stables, c’est à dire, en première approximation, de composés de poids moléculaire faible à moyen. Ces limites admises, la GC-MS est un formidable outil d’analyse. La diversité des modes d’injection et des colonnes capillaires (géométrie, nature de la phase stationnaire) autorise la séparation de mélanges extrêmement complexes (huiles essentielles, métabolites, hydrocarbures…). Contrairement aux autres détecteurs, Le spectromètre de masse fournit des informations structurales sur les analytes étudiés et peut permettre leur identification instantanée si ceux-ci sont répertoriés dans des bibliothèques de spectres. Le spectromètre de masse permet également de quantifier les analytes , même co- élués, à des concentrations inférieures au ng/L. C’est sa capacité à détecter spécifiquement une ou plusieurs molécules au sein d’un échantillon très complexe qui en fait un détecteur idéal pour l’analyse de traces en toxicologie, pharmacologie et médecine, environnement,

pétrochimie, et de synthèse organique.

Le couplage chromatographie en phasegazeuse-

spectrométrie de masse Stéphane Bouchonnet1, Danielle Libong