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dependen de la naturaleza de la
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Existen diferentes
en la
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protones acoplados. Cada seal o pico en el diagrama de contornos nos informa sobre los
desplazamientos qumicos de un ncleo de carbono y de los protones con los que est
directamente enlazado. Tal espectro permite una asignacin de las seales de
13
C si se
13
C, como es habitual,
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197
que el doble pulso simultneo de 900 transforma en coherencia en antifase de carbono por
transferencia de polarizacin desde los protones. Durante la segunda mitad del perodo de
mezcla se crea coherencia de 13C en fase, que es la que detectamos en la etapa final con
desacoplamiento protnico simultneo.
Analicemos, mediante el modelo vectorial de la magnetizacin, el desarrollo del
experimento para un grupo CH (13C-1H); que puede generalizarse a grupos CH 2 y CH 3 .
Preparacin: durante el periodo de preparacin la magnetizacin longitudinal de los
protones en equilibrio (1) se convierte en coherencia protnica cuyos dos componentes
correspondientes a las proyecciones de espn y del carbono inmediato comienzan el
periodo de evolucin (2).
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Mezcla (Puntos 5-9, Figura 5.124): El periodo de mezcla comienza con intervalo fijo 1
= 1/2J (J constante de acoplamiento heteronuclear directa C-H) para lograr poner en
antifase los componentes del doblete protnico debido al acoplamiento con el
0
13
C (6,
13
13
C genera entonces
C (9).
13
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La seal detectada (cada de induccin libre, FID) es funcin no slo del tiempo real de
adquisicin t 2 , sino tambin de la duracin del periodo de evolucin t 1 . Si
secuencialmente realizamos un tndem de experimentos con valores variables de t 1
tendremos una matriz bidimensional de datos S(t 1 ,t 2 ) correspondiente a la digitalizacin
de los FIDs (t 2 ) para diferentes valores de t 1 . Una primera transformacin de Fourier
sobre t 2 suministra un conjunto de espectros de 13C con seales cuya intensidad depende
de la duracin del intervalo t 1 . sto se debe a que la eficiencia de la transferencia de
polarizacin est modulada por la posicin que ocupe el doblete protnico en antifase (6)
lo que es funcin del desplazamiento qumico protnico, y la duracin del periodo de
evolucin t 1 . Una segunda transformacin de Fourier, ahora con respecto a t 1 , nos
revelar las frecuencias de las coherencias activas durante el perodo de evolucin, es
decir los desplazamientos qumicos de los protones acoplados directamente a cada ncleo
de carbono:
S(t 1 , t 2 ) TF(t 2 ) S(t 1 , C ) TF(t 1 ) S( H , C )
Existe una diferencia significativa entre los perodos
y 2 . El primero se introduce
para poner en antifase los componentes del doblete protnico y por lo tanto depender
slo de la magnitud de la constante de acoplamiento directa 13C-1H, que en la mayora de
los casos toma valores entre 125 y 160 Hz. Es usual adoptar un valor de compromiso de
135 Hz, que corresponde a un valor de 1/2J de 3.7ms. Durante el perodo
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deseamos
fase. Este proceso depende ahora fuertemente del nmero de protones unidos a dicho
carbono, como se ha visto anteriormente en la tcnica INEPT. En la Figura 5.125 se
muestra la situacin para grupos CH, CH 2 y CH 3 en funcin de la duracin del perodo
2 . Se adopta usualmente un valor de 1/4J (1.85ms), para el cual el nivel de reenfoque es
aceptablemente alto para todos los carbonos hidrogenados.
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forma anloga a un mapa de relieve con curvas de nivel. Se muestran los espectros
monodimensionales 1H y de
13
respectivamente.
El espectro HC COSY mostrado nos permite correlacionar las seales de los carbonos
con las de los protones directamente enlazados. La escala F 2 , que corresponde a las
frecuencias del perodo de deteccin, muestra los desplazamientos qumicos de
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C. La
escala F 1 , que corresponde a las frecuencias del perodo de evolucin muestra los
desplazamientos qumicos de los protones.
As las seales A y B vinculan a los
protones
olefnicos
con los
carbonos
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C asociados dichos
acoplamientos
indirectos. Tomando un valor de compromiso para los acoplamientos a dos y tres enlaces
C-H de 7 Hz, el valor del intervalo 1 debe extenderse hasta unos 71ms. El experimento
muestra ahora picos cruzados entre protones y carbonos separados 2 o 3 enlaces adems
de la presencia eventual de los picos cruzados originalmente presentes en el experimento
HETCOR, que indican la conectividad a un enlace. Se ha utilizado esta tcnica en el
pasado para correlacionar protones de grupos metilos con carbonos cuaternarios vecinos.
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El incremento de los periodos de mezcla en el experimento LR-HETCOR (Long RangeHETCOR) alarga considerablemente la secuencia de pulsos reduciendo drsticamente la
sensibilidad por la accin de los procesos de relajacin. Se logra compensar parcialmente
esta prdida de sensibilidad haciendo el tiempo de evolucin constante (constant time
experiment) e incluyndolo dentro del perodo de polarizacin INEPT. El efecto neto es
que el pulso de 1800 es el que se desplaza en funcin del tiempo de evolucin, de forma
tal que al final de la etapa la coherencia
respecto al acoplamiento con el
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protnica
transferencia de polarizacin INEPT (doble pulso de 900 aplicado a ambos ncleos). Esta
modificacin denominada COLOC (Correlation Spectroscopy via Long Range
Couplings, Kessler, Griesinger 1984, 1987), mostrada en la Figura 5.127, reduce la
duracin de la secuencia de pulsos y el experimento es ms sensible por reduccin de
los efectos de la relajacin.
203
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experimentos de correlacin
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X se obtienen incrementos en
sensibilidad respecto a los valores de referencia, que son mostrados a la derecha de la Figura
5.126 ( 1H ~ 2.5 31P ~4 13C ~ 10 15N ).
Al esquema 4 le corresponden la mayores sensibilidades relativas. Aqu se excita inicialmente al
protn, se crea coherencia de X que evoluciona durante t 1 y finalmente durante la mezcla se
vuelve a coherencia protnica que es la detectada directamente. Estos experimentos de deteccin
inversa, que estudiaremos a continuacin, representan ganancias sustanciales de sensibilidad
respecto al HETCOR que para las correlaciones 1H-13C y 1H-15N son de 8 y 30 veces. Aunque
estos valores tericos de incremento de sensibilidad no sean alcanzados completamente en la
prctica, aun un incremento moderado, digamos slo un factor de 4 para las correlaciones 13C-1H
representan una reduccin del tiempo de adquisicin en 16 veces. As si un experimento
HETCOR requiere por las condiciones de la muestra de un tiempo de adquisicin del orden de
las horas, puede obtenerse la informacin equivalente por los mtodos inversos en cuestin de
minutos. Como ventaja adicional de los experimentos de correlacin inversa se tiene que en ellos
en F 1 , donde se tiene menor resolucin, se despliegan los desplazamientos del heteroncleo, que
normalmente estn mucho menos superpuestos que los protnicos. Los experimentos de
correlacin inversa se han impuesto y son los que se utilizan en la actualidad para las
correlaciones X-1H.
Existen 2 tcnicas ampliamente utilizadas para la correlacin heteronuclear inversa a un enlace,
que se conocen por sus siglas en ingls: la correlacin heteronuclear mltiple cuntica HMQC
(Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) y la correlacin heteronuclear a simple cuanto
HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation). La informacin que suministran ambas
tcnicas es esencialmente la misma, difiriendo slo en detalles. El experimento HMQC es menos
sensible a desajuste en los parmetros de registro, mientras que el HSQC presenta una mayor
resolucin, ventaja que es explotada particularmente en espectros muy cargados de seales como
son los de los biopolmeros. El experimento HSQC es ms verstil, existiendo numerosas
variantes del mismo, lo que lo ha popularizado en la comunidad qumica. Ambas tcnicas, como
mtodos inversos, requieren
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5.9.4 HMQC
Este experimento de correlacin heteronuclear inverso fue desarrollado por Bax en 1986. El
HMQC permite correlacionar protones y carbonos unidos directamente a travs de un enlace con
elevada sensibilidad. La secuencia del HMQC se muestra en la Figura 5.130. La programacin de
fases de pulsos y receptor mostrada es para eliminar las seales provenientes de los protones
unidos a 12C.
La secuencia bsica del HMQC es relativamente simple conteniendo slo 4 pulsos de RF.
Ilustraremos su funcionamiento para un grupo CH, tal como hicimos en el HETCOR.
Preparacin.- la secuencia comienza con un pulso de 900(1H) que genera coherencia protnica
seguida de la evolucin de la magnetizacin protnica en un intervalo = 1/21J CH (~3.3ms) para
poner dicha coherencia en antifase con respecto al acoplamiento con el carbono vecino. Como en
el INEPT est magnetizacin en antifase puede transferirse a la pareja en acoplamiento mediante
un pulso. El pulso de 900(13C) transfiere coherencia al carbono-13 creando lo que se conoce
como coherencia a mltiple cuanto (MQC), donde hay magnetizacin transversal de ambos
ncleos.
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C con la estructura fina de los acoplamientos H-H, usualmente no resueltos, mientras que en F 2
tendremos los desplazamientos qumicos de los protones unidos a cada carbono con estructura
fina correspondiente a los acoplamientos interprotnicos.
En la parte inferior de la Figura 5.130 se muestran los llamados caminos de transferencia de
coherencia (CTC). Estos CTC permiten visualizar de forma simplificada la evolucin de las
coherencias durante una secuencia. Los rdenes de coherencia p para cada ncleo definen la
magnetizacin presente en las diferentes etapas del experimento. Slo los pulsos de RF pueden
modificar los rdenes de coherencia.
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globalmente coherencias a mltiple cuanto para el sistema CH. Estas coherencias son mezclas de
coherencias a cero y doble cuanto (p = 0, 2) de acuerdo con los signos relativos de las
coherencias protnicas y de
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evolucin, pero la evolucin con el desplazamiento qumico protnico es eliminada por el pulso
de 1800 que invierte la coherencia protnica en el medio del intervalo. El pulso final de
13
elimina la coherencia de este ncleo quedando solo la coherencia protnica que es detectada.
En la Figura 5.131 se muestra el espectro HMQC del mentol.
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5.9.5 HSQC
Este experimento (Bodenhausen y Ruben , 1980) tiene una secuencia con elementos
comunes con el HMQC y suministra espectros similares. La diferencia esencial es que en
el HSQC durante la evolucin hay coherencia a simple cuanto del heterotomo. La
secuencia de pulsos y los CTC del HSQC se muestran en la Figura 5.132.
Preparacin.- Este perodo es una secuencia INEPT con el objetivo de crear coherencias de X en
antifase con el protn ( = 1/2 1J XH ) a partir de la excitacin inicial protnica. El primer pulso de
900 de X (13C) que cierra el periodo de preparacin crea coherencia a simple cuanto en antifase
para este ncleo.
Evolucin.- Este perodo variable t 1 consta de un eco de espines donde las coherencias en
antifase de X evolucionan de acuerdo a sus desplazamientos qumicos. La evolucin del
acoplamiento heteronuclear es suprimida por el pulso protnico de 1800.
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5.9.6 HMBC
El experimento de correlacin heteronuclear a varios enlaces (HMBC, Heteronuclear Multiple
Bond Correlation), desarrollado por Bax (1986) establece la correlacin entre protones y un
heterotomo X separados por 2 o 3 enlaces y es el equivalente inverso del COLOC. A semejanza
del HMQC y el HSQC es un experimento muy sensible por resultar de excitacin y deteccin
protnica. El HMBC es esencialmente un experimento HMQC adecuado a la deteccin de
correlaciones a travs de acoplamientos dbiles. La secuencia del HMBC se muestra en la Figura
5.134.
Figura 5.134 Secuencia del HMBC con filtro de paso de banda inicial
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inicial adicional que acta como filtro para eliminar la seal proveniente de
acoplamiento directo ( 1 = 1/21J XH ~ 3.3 ms). Se debe esperar el tiempo suficiente para poner en
antifase la coherencia protnica ( = 1 + 2 = 1/nJ XH ~ 100 ms) optimizndose la creacin de
coherencia a mltiple cuanto para nJ XH mediante el segundo pulso de 900 (X).
Evolucin.- La MQC evoluciona durante t 1 .
Mezcla.- La MQC es reconvertida en coherencia protnica por el pulso final X. El intervalo de
reenfoque
ones de
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Figura 5.136.HMBC del -pineno en CDCl 3 a 500 MHz. Desacoplando durante de la deteccin
En el espectro HMBC de -pineno si buscamos las correlaciones de los protones de los grupos
metilos del puente (A y B) encontramos correlacin con todos los carbonos a 2 y 3 enlaces.
Obsrvese adems la presencia de la correlacin a un enlace 0.84/20.9 ppm y 1.27/26.4 ppm. El
grupo metilo en 1.67 ppm es el nico con picos de cruce con los tomos de carbonos olefnicos
(116.1/144.5 ppm) y adems con el CH en 47.2ppm.
En la Figura 5.137 se muestran las secuencias de pulsos de los experimentos de deteccin inversa
con fines de comparacin. La segunda dimensin temporal se genera por incrementos sucesivos
de tiempo de evolucin t 1 .
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B . La
A,
La informacin en un espectro COSY est en los picos de cruce fuera de la diagonal. Estos picos
indican el acoplamiento escalar entre dos espines y por lo tanto que un reducido nmero de
enlaces separan a los ncleos correspondientes. La eficiencia del pulso de mezcla en transferir
coherencia depende, como hemos visto, de la presencia de componentes en antifase en el
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En este espectro COSY detectamos 2 sistemas de espines casi independientes. Los protones 2, 3
y 4 muestran picos de cruce intensos entre ellos correspondientes a los acoplamientos orto y meta
presentes en aromticos (sealados en la parte inferior del COSY). Los protones 5-8 forma por su
parte un sistema ms complejo debido a la pequea diferencia de desplazamientos qumicos entre
H 5 y H 6 . El pico de cruce entre estos protones est tan cercano a la diagonal que es difcil de
detectar. Este es un problema comn en la interpretacin de los espectros COSY. La conexin
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Experimento
de
correlacin
homonuclear
de
espines
diluidos
(13C-13C
INADEQUATE)
En la determinacin de estructuras orgnicas uno de los objetivos centrales es la identificacin del
esqueleto carbonado. Por lo comn, las conectividades C-C no se determinan directamente sino
se hace uso de las conectividades homonucleares (COSY) o heteronucleares a mas de un enlace
(COLOC, HMBC). En ocasiones este procedimiento indirecto no es funcional, sobe todo cuando
en la cadena carbonada abundan los carbonos cuaternarios. Esta estrategia indirecta se justifica
por las dificultades asociadas con la deteccin de conectividad directa C-C: la baja abundancia
natural del
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13
molculas. Se trata en este caso de buscar dbiles satlites de 13C en el ya poco sensible espectro
de RMN-13C. La estrategia directa, por su bajsima sensibilidad, requiere muestras muy
concentradas y perodos de adquisicin muy prolongados.
A pesar de los problemas de sensibilidad, la informacin tan valiosa que puede obtenerse de las
conectividades C-C (conocimiento inmediato del esqueleto carbonado) ha
estimulado el
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La secuencia del NOESY est relacionada estrechamente con la del COSY. La diferencia
mas significativa est en el tiempo de mezcla durante el cual se desarrolla el efecto NOE.
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Las
m,
anulndose
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+ 2 6c
1 + 0 c
rIS
IS 4
[5.104]
ISNOE = ISROE
5 4 c
rIS6
[5.105]
ISNOE
4 c
rIS6
ISROE
2 4 c
rIS6
[5.106]
As para grandes molculas el ROE crece dos veces mas rpido que el NOE.
Mientras el desarrollo del
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1 c << 1 se cumple para todos los valores accesibles de c y las molculas, independientemente
de su tamao, se comportan como si estuvieran en el rgimen de agudeza extrema. Los ROE son
pues siempre positivos. Por lo tanto en el espectro ROESY los picos de cruce originados por
contactos ROE siempre tienen signo opuesto a la diagonal. Aparte de los signos de las seales, la
apariencia e interpretacin de los espectros ROESY es semejante a los obtenidos por el
experimento NOESY.
Los espectros ROESY tienden a presentar ms artefactos que los espectros NOESY, lo que
puede conducir a interpretaciones errneas. Como se seal antes, la secuencia de pulsos del
ROESY es muy similar a la del TOCSY aunque en el ROESY el bloqueo de espines se emplea
para optimizar la transferencia de magnetizacin por interacciones dipolares en lugar de la
transferencia coherente de magnetizacin a travs de los acoplamientos escalares que caracteriza
al TOCSY. As como en el NOESY se pueden presentar artefactos tipo COSY, en el ROESY los
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en condiciones
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