UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

Ing. Agroindustrial
Bioqumica Grupo B

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA DE LA ALFA AMILASA
VEGETAL
INTRODUCCIN
Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica cuya funcin es ascelerar las
reacciones qumicas llevndolas ms rpidamente a su posicin de equilibrio.
Pertenecen al grupo de las protenas globulares cuyos pesos moleculares oscilan entre
4

10 y 10

daltons; pueden consistir de una sola o de varias cadenas polipeptdicas,

y contener tambin partes no proteicas.

En la prctica se estudiar la actividad de una amilasa de origen vegetal , midiendo el
sustrato residual. Asimismo se medir su actividad especfica que viene a constituir un
criterio de pureza, y se define como el nmero de unidades de enzima por mg de
protena
AMILASA: Cataliza la hidrlisis al azar los enlaces -1,4 glucosidicos de la regin
central de la cadena de amilosa y amilopeptina, exceptuando las molculas cercanas a
la ramificacin, obteniendo como resultado maltosa y oligosacridos de varios
tamaos. La actividad de la enzima se determina cualitativamente mediante la
disminucin de la capacidad de la solucin de almidn para formar el color azul
caractersticos con el yodo o midiendo la disminucin de la viscosidad de la suspensin
de almidn.
La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada
(amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar
una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinognica (mezcla de
amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de
maltosa.

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Bioqumica Grupo B

I.

OBJETIVOS:
- Determinar l actividad enzimtica de una amilasa extrada de trigo germinado,
-

II.

usando almidn residual.

Determinar la actividad especfica de la amilasa vegetal.

MATERIALES:
Equipos:
- Estufa
- Espectrofotmetro
Materiales y reactivo:
-

III.

Semillas germinados: trigo y cebada

Solucin de almidn 0.1%
cido clorhdrico 0.5N
Lugol
Reactivo de Biuret
Tubos de ensayo
Embudos
Mortero
Pipetas de 1,5,10 ml

PROCEDIMIENTO:
-

Extraccin de la amilasa:
Germinamos 50 semillas de trigo y cebada por 3 dias.
Trituramos las semillas, adicionando 10 ml de buffer + cloruro de calcio.
Filtramos en gasa o algodn.

Demostracin de la actividad enzimtica: armar el siguiente sistema.

TUBOS (ml)

SUSTRATO
Incubar: 30C 5 min.
EXTRACTO DE ENZIMA
Incubar: 30C 15 min.
ACIDO CLORHIDRICO 0.5N
Reposar: T. ambiente 5 min.
AGUA DESTILADA
LUGOL

ALMIDON
INICIAL
I
1.0

ALMIDON RESIDUAL
II
1.0

III
1.0

IV
1.0

---

0.1

0.2

0.3

1.0

1.0

1.0

1.0

9.9
0.5

9.8
0.5

9.7
0.5

9.6
0.5

Mesclamos, y Medimos las absorbancias despus de 5 min a 6.20nm

Anotamos los datos obtenidos

Determinacin de la actividad especfica:

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Determinamos el contenido proteico del extracto crudo de la enzima con el

reactivo de Biuret de acuerdo al siguiente esquema:

TUBO (ml)
Preparado enzimtico
Agua destilada
Reactivo de Biuret

IV.

I
--1.0
4.0

II
0.2
0.8
4.0

III
0.1
0.9
4.0

IV
0.05
0.95
4.0

Mezclamos y lo llevamos a incubar por 30 min a 37C.

Realizamos las lecturas de absorbancia a 540 nm calibrando a cero con el
tubo N 1

RESULTADOS
ACTIVIDAD ENZIMATICA
N TUBO
I
II
III
IV

ABSORBANCIA
(nm)
0,309
0,186
0,189
0,226

ACTIVIDAD ESPECFICA
N TUBO
I
II
III
IV

ABSORBANCIA
(nm)
0,128
0,181
0,172
0,131

CALCULOS
-

Determine la concentracin del almidon (mg/ml), multiplicando,

absorbancia por factor de calibracin. obtener el promedio de los
tubos II, III Y IV.
FC = 0,698

C1 = (0,186) (0,698) = 0,129

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C2 = (0,189) (0,698) = 0,132

C3 = (0,226) (0,698) = 0,158
Promedio o mg de almidon hidrolizado:
(0,129+0,132+0,158)
3

= 0,42

Calcular las unidades de enzima (u) de la siguiente forma:

U=

U=

mg de almidon hidrolizado
15 minutos

0,42
15
U = 0,028
-

Determinar mg de proteina/ ml = absorbancia

factor

FC = 0,698
C1 = (0,181) (0,698) = 0,126
C2 = (0,172) (0,698) = 0,120
C3 = (0,131) (0,698) = 0,091
Promedio o mg de proteina:

=
=
-

(0,126+0,120+ 0,091)
3
0,11

Obtener el promedio de los tubos ii, iii, iv, y determinar la

actividad especifica (ae) de la siguiente manera:

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AE=

unidades de enzima
mg de proteina

U=

0, 028
0,11

U= 0,25
CUESTIONARIO
1.- En la sntesis de arginina a partir de acido glutmico se observaron las siguientes
reacciones
3
2
4
1
Glu ------ N ac. Glu ------ Orn ------ Cit ------ Arg
Siendo 1, 2, 3,4 enzimas
Indica cuales son los sustratos y productos correspondientes para estas enzimas
mediante un cuadro.

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2.-Por que se sometieron las raicillas del cereal a un proceso fsico y qumico en el
proceso de extraccin?
El proceso de extraccin se basa en la obtencin de amilasa, por lo que es necesario
que las raicillas de los cereales sufran un proceso fsico donde se van a fragmentar en
pedazos ms pequeos con la ayuda de un mortero pero aun as siguen conservando
su naturaleza, luego se da el proceso qumico donde se va a filtrar la parte liquida que
seria la amilasa de las semillas con la ayuda de una gasa ,luego a este extracto se le
van agregando una seria de reactivos lo cual permitirn transformarla en un preparado
enzimtico para posteriormente utilizarla en diferentes pruebas.
3.- Si se te da una solucin que supuestamente contiene una enzima, Cmo
determinaras en la solucin la presencia de una enzima que cataliza la hidrolisis de
almidn?
Para determinar la presencia de una enzima en una solucin y a la vez observar que
cataliza la hidrolisis de almidn solo se podra lograr a travs de una va ,la cual
consiste en agregar reactivos que permitan evidenciar tal presencia como es el caso
del lugol , adems porque mientras el color de la mezcla sea mas intenso significa que
la actividad enzimtica que ejerce la amilasa sobre el almidn ser un poco mas baja ,
adems tambin la podemos notar ya que en la solucin se va a observar la formacin
de anillos en la parte superior de dicho liquido o sustancia.
4.- Represente mediante un flujograma el proceso de extraccin de una amilasa
una fuente diferente a la utilizada en prctica.

de

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5.- Cmo se puede incrementar la actividad especfica de una enzima?

La actividad especfica de las enzimas se calcula dividiendo la actividad enzimtica
(por ejemplo; U/mL) entre la concentracin de protenas (mg/mL). El resultado final
indica la cantidad de enzima por milgramos de protenas presente. Se supone que si
purificas la enzima normalmente la actividad especfica de la misma debe aumentar, ya
que la proporcin de enzima del total de las protenas presentes debe tambin irse
incrementando. A veces esto no ocurre. En ese caso debe revisar el procedimiento otra
vez ya que algo puede estar saliendo mal. Por ejemplo que se desnaturalice la enzima
en el proceso de purificacin por empleo de algn solvente o pH o fuerza inica
inadecuada. Tambin debe tener en cuenta si la protena en milimtrica, ya que la
prdida de una subunidad puede reducir significativamente su actividad.

BIBLIOGRAFIA:

Foster, N; Burchett, L and Paulsen, Bioquimica,Editorial Reverte, Espana,G. 1998.

Benech-Arnold, R. and Sanchez,Biologia de las Plantas,Primera Edicion,Editorial
Bermejo . 2004.
Almonte.Carlos,Manual de Quimica Organica,Quinta Edicion, 2010.
Barabado.Oscar,Microbiologia Alimentaria,Tercera Edicion,2001.