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PCR

PCR
Tcnica inventada por Kary Mullis :1987
Premio Nobel 1993
Amplifica una NICA secuencia a partir de una
mezcla compleja de ADN

Aprovecha los requerimientos de la


replicacin

Templete ADN
Nucletidos
Primers (Imprimadores)
Polimerasa

Primers

Se debe tener informacin de la secuencia


que rodea el fragmento de inters

Primers dan especificidad a la reaccin,


delimitan regin a amplificar
6-40 nuclotidos
Usualmente 18-22
A no ms de 4 kb uno de otro

Primers

2 primers: complementarios a bandas opuestas


Deben estar en exceso

Para realizar la tcnica se necesitan:


dNTPs
Dos cebadores (o primers)
Iones divalentes. Se suele usar magnesio
(Mg2+), agregado comnmente como cloruro de
magnesio (MgCl2), Actan como cofactores de la
polimerasa.
Una solucin tampn o buffer que mantiene el
pH adecuado para el funcionamiento de la ADN
polimerasa.
ADN polimerasa (la ms comn es la Taq
polimerasa).
ADN molde
Termociclador

Ciclos
20 a 35 ciclos de:
1. Desnaturalizacin: 94-96
5

2. Annealing
50-65

3. Elongacin
72C
5

Ciclo completo de PCR

Tamao definido

Clave para facilidad proceso: polimerasa


Debe ser termoestable
Thermus aquaticus, una bacteria

Desventajas de la Taq
No corrige errores
1 error en 2 x 104 bases
Nuevas polimerasas cometen menos errores

Termociclador

Templete para PCR

Se pueden usar bajas cantidades


En teora: una sola molcula
No se debe aislar la secuencia de inters
No debe ser muy puro
ADN es una molcula muy estable en ausencia
de nucleasas

A partir de:

Sangre
Semen
Pelo
Mucosa bucal
Uas
Cepillo dientes

Cuidado con PCR


Es tan sensible que se debe evitar la
contaminacin

Resolucin de problemas de PCR


http://bitesizebio.com/articles/the-essential-pcrtroubleshooting-checklist/

Primers

Caractersticas importantes de un primer


Longitud
Tm

Tm
Temperatura de melting, separacin, fusin la
temperatura a la que la mitad de las hebras de ADN son
simple banda y la mitad son doble banda. Entre ms GC ms alta Tm.

Clculos:
Menos de 13: Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4
Ms largo de 13: Tm= 64.9 +41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)
Programas usan frmulas modificadas ms exactas. Consideran
concentracin de sales, de iones, etc

Caractersticas de un buen primer


Tm en el rango de 52C a 65C. Idealmente
ambos primers con Tm parecida.
Que no sean capaces de dimerizar
Ausencia de formacin de horquillas
Falta de sitios secundarios de unin

Unin nica
Secuencia debe ser nica en el ADN templete
No debe existir annealing en posibles fuentes
contaminantes (humano, rata, ratn). Se logra
haciendo BLAST o BLAT con el genoma
correspondiente
5...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3

CAGTCAACTGCTAC

TGCTAAGTT
G

Primer candidato 2 5-CAGTCAACTGCTAC-3

No nico!
nico!

A
TGCT
AGTTG

Primer candidato 1 5-TGCTAAGTTG-3

Longitud del primer


En trminos generales:

Entre ms largo ms especfico


Entre ms largo ms alta Tm y temp annealing
Por lo menos 15pb de longitud
Por lo general 17-28pb

Caso especial: mutagnesis dirigida. Longitud: 2545pb

Temperatura de Annealing
Temperatura de Annealing, Tanneal temperatura a
la que los primers se unen al molde de ADN. Se
puede calcular a partir de Tm .
Ta Opt = 0.3 x (Tm de primer) + 0.7 x (Tm del
producto) - 25
Tm del primer: es la Tm del primer que tenga la ms baja

Estructura Interna
Unin de primer con l mismo, o con el otro primer
antes que con el molde: disminuye eficiencia

Podra no ser tan importante si la temperatura de annealing no los


deja formarse. Algunos dmeros y horquillas se forman a 30C.

Pareja de primers debe calzar


Primers funcionan en parejas
Se usan en la misma reaccin de PCR: las
condiciones deben ser adecuadas para ambos
Mxima diferencia entre temperaturas de
annealing debera ser 3C

Especificidad del producto


Tanneal es el factor principal en determinar especificidad
del annealing y que se obtenga el producto deseado

Tanneal : muy baja menos especfico unin de


primers en otro lado bandas
inespecficas
muy alta primers pueden no unirse

Estabilidad 3 y 5
Elongacin de primer empieza en extremo 3.
Mientras el extremo 3 se una al molde, la elongacin
empieza. 5 menos importante
Problema: Si 3 tiene 3 o ms C/G, se puede unir
establemente a casi cualquier secuencia con tres C/G
Situacin Ideal:
Extremo 5 estable + extremo 3menos estable, elimina
unin incorrecta debida a unin de slo extremo 3.
Preferiblemente: extremo 5 con 1 o 2 bases G/C.
Extremo 3 no tiene ms de una base G/C.

Resumen criterios para diseo


1. Unin nica
2. Longitud: 17-28 bases. Podra variar
3. Composicin: contenido promedio de (G+C) alrededor 5060%; evitar secuencia larga de (A+T) y regin rica en (G+C)
4. Optimizar apareamiento: estabilidad en extremo 5 debe ser
alta y relativamente baja en 3, para evitar unin equivocada
de los primers
5. Tm preferiblemente entre 55-65 C
6. Primers en un juego con diferencia de t. de annealing entre
2-3C
7. Minimizar estructura secundaria interna: horquillas y dmeros
se deben evitar

Diseo de primers con computadora


Mucho mejores resultados que a mano
Algunos programas:
- Primer3: MIT
http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi
-Oligo
-GCG
-BioTools
- Otros: GeneFisher, Primer!, Web Primer
Software para calcular Tm:
- BioMath: http://www.promega.com/biomath/calc11.htm

PCR Multiplex
Varias parejas de primers en mismo tubo al hacer PCR
Bueno para amplificar sitios mltiples
Ej: microsatlites
Dificultad de diseo
Tm deberan ser parecidas
Evitar dmeros

Primers universales

Basados en alineamiento de secuencias


Ejemplo:
todos los genes de una familia
el mismo gen en diferentes organismos
Estrategia
1. Alinear secuencias a amplificar.
2. Buscar regiones ms conservadas en extremos 5 y 3.
3. Diseo de primer F en la regin conservada 5.
4. Diseo de primer R en la regin conservada 3.
5. Buscar la mejor pareja en cuanto a Tm etc
6. Asegurarse de amplificacin nica en todas secuencias
7. Asegurar que no amplifique posibles contaminantes