TRINGULO

DEL DIAGNSTICO
PACIENTE

MDICO

MDICO

PATLOGO

CLNICO

MTODOS DIAGNOSTICOS ESPECIALES EN PATOLOGA
Avances mdicos en el rea de patologa
Inmunofluorescencia directa
Inmunohistoqumica
Citometra de flujo
Patologa molecular

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
Anticuerpo primario marcado con fluorescena (C3, C4, C1q, IgM, IgG, IgA)
Antgeno celular
Microscopio de fluorescencia.

INMUNOHISTOQUMICA
La inmunohistoqumica es un mtodo que utiliza anticuerpos seleccionados para
identificar antgenos especficos
En el laboratorio se unen el anticuerpo con el antgeno en combinacin con un
marcador visual.
En las tcnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas capaces de
hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas ms
frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos
diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio

(color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamente al anticuerpo

primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos (secundarios) o sustancias
como biotina o protena A.

FUNDAMENTOS DE LA INMUNOHISTOQUMICA
UTILIDAD
PASOS BSICOS
Desparafinar
Hidratar
Bloquear la actividad de peroxidasa endgena
Protena bloqueadora
Reaccin con anticuerpo primario
Poner a reaccionar con anticuerpo secundario biotilinado
Colocar complejo estreptavidinaperoxidasa
Colocacin del cromgeno
Tincin de contraste
Deshidratar, aclarar y montar
La disponibilidad de anticuerpos monoclonales ha facilitado enormemente la
identificacin de productos celulares y de marcadores superficie.

DIAGNSTICO
DIFERENCIAL EN
PATOLOGA
ONCOLGICA
TIPIFICACIN DE
AGENTES
INFECCIOSOS

FACTORES
PRONOSTICOS Y
PREDICTIVOS

INMUNOHISTO-
QUIMICA
APLICACIONES

TOXOPLASMOSIS
HELICOBACTER PYLORI

TIPIFICACIN DE
AGENTES INFECCIOSOS

PNEUMOCYSTIS CARINII
CITOMEGALOVIRUS
HERPES
VIRUS DE EPSTEIN-BARR
HEPATITIS B

CLASIFICACIN DE
NEOPLASIAS
INDIFERENCIADAS
METASTASIS DE ORIGEN
DESCONOCIDO
CLASIFICACIN DE
TUMORES DE TEJIDOS
BLANDOS
INMUNOFENOTIPO DE
LINFOMAS ETC.

DIAGNOSTICO
DIFERENCIAL EN
PATOLOGA
ONCOLGICA

FACTORES
PRONSTICOS Y
PREDICTIVOS

CARCINOMA DE MAMA
CARCINOMA DE COLON
CARCINOMA DE VEJIGA
URINARIA
CARCINOMA DE PROSTATA
GIST

CITOMETRIA DE FLUJO

Se utiliza para medir:

Tamao de la clula
Complejidad de la membrana
Cantidad de DNA de la clula
Ploidia y aneuploidia
Proliferacin celular
Clasificacin de Leucemias y Linfomas

PATOLOGA MOLECULAR
Se utiliza:
Dx de neoplasias malignas.
Neoplasias hematotopoyticas asociadas a translocaciones especficas.
Pronostico de neoplasias malignas
Deteccin de enfermedad mnima residual.

Dx de la predisposicin hereditaria de cncer

Anlisis de micromatrices de DNA y protemica.

TCNICAS DE ANLISIS DE DNA DIAGNOSTICAS
1. Southern Blott (SBH)
2. Northern Blott
3. Hibridizacin in situ (FISH)
4. PCR (reaccin en cadena de polimerasa) o Amplificacin
5. Secuencia

SOUTHERN BLOTT
Para la deteccin de genes especficos en el ADN celular.
El ADN problema es digerido por una endonucleasa de restriccin
Los fragmentos obtenidos se separan por electroforesis
Se transfieren los fragmentos de ADN a un gel
Se incuba posteriormente con una sonda marcada que hibrida los fragmentos de ADN
que contiene la secuencia complementaria.
Los fragmentos se visualizan tras la exposicin del filtro a una pelcula radiogrfica.



NORTHERN BLOTT
Variante de la tcnica de tranferencia de Southern.
Deteccin de ARN en vez de ADN.
La totalidad del ARN celular es extrada y fraccionada por electroforesis de gel.
Los ARN se transfieren a un filtro y se detectan por hibridacin con una sonda
radioactiva. (Similar al Southern)

HIBRIDACIN IN SITU (FISH)
El mtodo de hibridacin In Situ por fluorescencia se basa en la deteccin y
localizacin de secuencia especficas de ADN o ARN dentro de las clulas de los tejidos.
Consiste en colocar la sonda directamente sobre el espcimen que tiene la secuencia
del ADN inmovilizada.
El tejido es tratado con una enzima que permite el acceso de la sonda al ADN nuclear,
el que ha sido previamente desnaturalizado por calor.
La sonda se agrega para la hibridacin y esta ocurre si est presente el ADN blanco
complementario de la sonda.
La sonda viene ligada a una sustancia fluorescente, que es observada mediante
microscopio de fluorescencia.

HIBRIDIZACIN DEL ADN

la hibridizacin permite la localiacin de ciertas secuencias de ADN in situ (FISH)


PCR (REACCIN EN CADENA DE POLIMERASA)

Es un mtodo para conseguir un gran nmero de fragmentos de material gentico a
partir de una copia de ADN.
Una molcula de ADN sometida a 30 ciclos de amplificacin da mil millones de copias.
Esta tcnica consiste en crear copias adicionales de la secuencia deseada o segmento
especifico de ADN. Se realiza a travs de ciclos repetidos de desnaturalizacin, hibridacin
y extensin.
PASO 1
Desnaturalizacin con calor para abrir las hebras de ADN y permitir hibridizacin con
oligonultidos (primer) (secuencia corta de pares de bases) iniciadores especficos.
PASO 2
La temperatura controla la tasa de fijacin
A 55C, bajo la condiciones forman uniones de hidrgeno con el molde de ADN
PASO 3
Gracias a la estabilidad de la polimerasa aislada de bacterias que viven a altas temperaturas, la
extensin se hace a una temperatura mayor a la de la fijacin, asegurando especificidad.

RESULTADO
La secuencia entre los oligonuclotidos es copiada exponencialmente.


INMUNOHISTOQUIMICA EN NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADAS
Antgeno comn leucocitario (linfomas)
Melan A-HMB45 (melanoma)
Citoqueratinas (pancitoqueratinas) y antgeno de membrana epitelial (carcinomas)
CD99 (MYC2) (tumor neuroectodermico primitivo)
Cromogranina-sinaptofisina (tumores neuroendocrinos)
Vimentina (sarcomas)
Protena acido glial fibrilar (gliomas)

INMUNOHISTOQUIMICA EN NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADAS

Antgeno comn leucocitario CD45 (linfomas)
CD20 (clulas B)
CD3 (clulas T)
CD4
CD8
CD30 (HODGKIN)
CD15 (HODGKIN)
Otros CD

INMUNOHISTOQUIMICA E NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADAS
Melanoma
-HMB45
-MELAN A
-S 100
-VIMENTINA
Citoqueratinas (pancitoqueratinas) y antgeno de membrana epitelial (carcinomas)
-CITOQUERATINA 20
-CITOQUERATINA 7

*negativo para los dos anticuerpos (carcinoma renal)

*positivo para citoqueratina 20 (cncer de colon)

*positivo para citoqueratina 7 (cncer de pulmn)

* positivo para ambas (cncer de estomago)
CD99 (MYC2) (TUMOR NEUROECTODERMICO PRIMITIVO)
Cromogranina sinaptofisina (tumores neuroendcrinos).
-CARCINOIDES
-PARAGANGLIOMAS
-CARCINOMAS NEUROENDOCRINOS
Tumores del estroma gastrointestinal (GIST) CD117 (c-Kit)
Vimentina (sarcomas)
-TUMORES DE MUSCULO LISO

*DESMINA

*ACTINA DE MUSCULO LISO
-TUMORES DE MUSCULO ESTRIADO

*DESMINA

*MIOGENINA

*MYO D1