Escuela de Ingeniera en

Biotecnologa Facultad de
Ciencias Biolgicas Ingeniera
en Gentica y Biotecnologa
Acucola BIT 220-2
Jorge Aedo Abadie
Cristina Navarro Valenzuela

Practico de patologa en peces:

Deteccin de Piscirickettsia
salmonis a travs de un Ensayo
inmunolgico en Fase Slida
(ELISA)

Integrantes:
Villalobos

Fernanda

Arredondo

Mariajesus Nazal
Valdebenito
Francisco Gonzlez
Wistuba
Felipe Sez Cortez

Introduccin
La industria acucola salmonera chilena es el segundo sector exportador
del pas, y tambin es el segundo productor ms grande de salmones a
nivel mundial, despus de Noruega hasta el 2013 segn la Asociacin de
la Industria de Salmn de Chile A.G. 1. Las tres especies ms cultivadas
fueron introducidas al mar chileno en el siglo XX, siendo estas el Salmn
Atlntico (Salmo salar), el Salmn del pacfico o Coho (Oncorhynchus
kisutch) y la Trucha Arcoris (Oncorhynchus mykiss). El ao 1989 en
Latino Amrica se report una prdida en un rango del 30 al 90% de
Salmn Coho2 debido a una infeccin sistmica caracterizada por la
colonizacin de varios rganos, incluyendo rin, hgado, bazos,
intestinos, cerebro, ovarios y branquias 3. Inicialmente se crea que la
patologa estaba limitada solo a esta especie, ms aun posteriormente
se report mortalidad por esta enfermedad en Salmon Atlntico, Salmn
Salar, Salmn Chinook y Trucha Arcoris4.
Piscirickettsia salmonis es el agente etiolgico de la Septicemia
Rickettsial Salmondea (SRS) o Piscirickettsiosis. Esta bacteria es
caracterizada por ser un patgeno intracelular no mvil, no encapsulado,
pleomorfo, generalmente cocodea con un dimetro variable de 0.5 a 1.5
m5. Tiene una alta tasa de mortalidad en peces juveniles por lo que es
de suma importancia el desarrollo de tecnologas para la deteccin
rpida y oportuna del patgeno debido al alto impacto de la Industria
acucola salmonera en la economa del Pas.
Para ello se han desarrollado tcnicas de inmunoensayos para la
deteccin oportuna, estas se basan en la interaccin especfica
antgeno-anticuerpo. ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay) es
un mtodo inmunoenzimtico empleado para la deteccin de antgenos
o anticuerpos. Se fundamenta en dos principios: 1) En que los antgenos
y anticuerpos pueden ser absorbidos a una fase solida sin perder su
reactividad inmunolgica, y 2) que tanto a los antgenos como
anticuerpos se les puede ligar una enzima, formando un conjugado con
actividad inmunolgica y enzimtica simultnea, facilitando la
interpretacin de los resultados6. Especficamente, para la deteccin de
P. salmonis en muestras de tejido se utiliza ELISA SRS, donde los
anticuerpos monoclonales utilizados son especficos para P. salmonis
ATCC y para 14 aislados obtenidos de diferentes centros de cultivo del
sur de Chile.
Objetivos

Determinar la presencia de Piscirickettsia salmonis en una muestra

problema a travs de un inmunoensayo ELISA SRS

Materiales y mtodos

En este practico se realiza un ensayo inmunoenzimtico en fase solida

con el kit ELISA SRS del grupo BIOS S.A. el cual contiene los anticuerpos
Anti- Piscirickettsia salmonis Policlonal y Anti- Piscirickettsia salmonis
clon 7G4/D9, adems de un moderno sistema de un adhesivo biolgico
para la fijacin de los anticuerpos a la placa.
Para esto se agrega a cada pocillo de la placa 100 ul de cada muestra,
las cuales consisten en 4 muestras problemas, un control positivo de p.
salmonis y un control negativo. Luego la placa se sella y se lleva a
incubar por 1 hora a 37C. En esa hora se prepara la solucin de lavado
y se diluye 1:25.
A continuacin se elimina el contenido de los pocillos y cada uno se lava
con 350 ul de la solucin preparada anteriormente, luego el contenido se
elimina nuevamente, esto se repite 4 veces para asegurar un buen
lavado.
Una vez que los pocillos fueron meticulosamente lavados se agrega a
cada uno 50 ul de una solucin de anticuerpo y 50 ul de una solucin de
conjugado, se vuelve a sellar y se lleva a incubar por 30 minutos a 37C
y luego se vuelve a repetir el lavado, nuevamente 4 veces para asegurar
un buen lavado.
Luego se mezclan los sustratos A (Tetrametil-benzidina) y B (Perxido de
Hidrogeno) en partes iguales y de esta mezcla a cada pocillo se le
agregan 100 ul, esto se realiza para luego poder revelar los resultados.
Se agregan 100 ul de H2SO4 3N para detener la reaccin.
Finalmente se realiza la lectura.

Pocillo
C+
CM1
M2
M3
M4

Absorbancia
0,966
0,021
0,486
0,105
0,291
0,027

Resultados:
Se utiliz una placa de ELISA pequea con 8 pocillos, sin embargo, solo
se utilizaron 6 pocillos (Figura 1). A cada pocillo de la placa de ELISA se
le midi la absorbancia (tabla 1). Estos resultados son consistentes con
lo esperado, puesto que se obtuvo una mayor absorbancia en el control
positivo, el cual consiste de una muestra en una suspensin pura de
Piscirickettsia salmonis (P. salmonis) que se encuentra inactiva, mientras
que el pocillo con menor absorbancia corresponde al control negativo
(agua destilada).

Figura 1: Esquema representativo de la placa de ELISA de 8 pocillos

utilizada, donde C+ corresponde al pocillo de control positivo
(muestra pura de P. salmonis), C- al pocillo de control negativo (agua
destilada), M1, M2, M3 y M4 corresponden a pocillos de muestra, X1 y
X2 corresponden a pocillos extras que no se utilizaron, por lo que se
Tabla 1: Valores de absorbancia obtenidos en la placa de ELISA. En la
columna izquierda se observa el pocillo al cual se le midi la
absorbancia, donde C+ corresponde al control positivo de P. salmonis,
C- corresponde a agua destilada, M1, M2, M3 y M4 corresponden a

Para determinar que muestra efectivamente corresponde a un resultado

positivo, es necesario calcular el Cut off. Para esto, es necesario
conocer el promedio de los valores de los controles negativos obtenidos
por los otros investigadores (tabla 2).
Tabla 2: Valores de absorbancia de los
distintos
Muestragrupos de investigadores.
Grupo
Grupo
1
2
C0,038
0,021

controles
Grupo
3
0,087

negativos obtenidos por los

Grupo
Grupo
Promedi
4
5
o
0,025
0,036
0,0414

El clculo del Cut off se determina con la siguiente frmula:

Cut off =control negativo+0.260

Cut off =0.414+ 0.260

Cut off =0.314

El Cut off en este caso corresponde a 0.314, por lo que todos los valores
de absorbancia por sobre 0.314 corresponden a un resultado positivo.
Por consiguiente, se determina que slo la muestra 1 contienen
antgenos que son reconocidos por los anticuerpos del Kit, por lo que se
sugiere fuertemente que la muestra 1 (M1) contienen Piscirickettsia
salmonis.

Discusin:
La tcnica ELISA corresponde a un mtodo ampliamente usado como
tcnica de deteccin de txicos o bacterias mediante el uso de
anticuerpos especficos conjugados a enzimas, y se caracteriza por
presentar varias ventajas en comparacin a otras tcnicas, tales como
su alta sensibilidad, deteccin de sustancias a concentraciones bajas, o
por su rapidez, aunque como inconveniente es posible que ocurran
reacciones cruzadas que entreguen falsos resultados positivos 7.
Para obtener buenos resultados y asegurar que sean confiables y
reproducibles adems de las ventajas y desventajas antes mencionadas,
es importante considerar distintos elementos entre los cuales estn: La
eleccin de la fase slida, de los conjugados, de los sustratos, y la
cuantificacin del producto coloreado. Por lo que la disminucin en la
especificidad de la tcnica o errores presentados en esta se podran
deber a una mala determinacin de estos factores8.
En resumidas cuentas se tiene lo siguiente:

La eleccin de la fase slida es uno de los elementos ms

importantes ya que consiste en el soporte de la reaccin, por lo
que la adsorcin a esta depende de factores como el pH,
caractersticas fsicas de su superficie y el tipo de protena.
Elementos que deben ser estandarizados para cada procedimiento
en especfico8.
Los conjugados elegidos dependen del tipo de ensayo, en ELISA se
utilizan anticuerpos unidos a enzimas (tal como se hizo en este
experimento) o unido a antgenos. Se consideran distintos tipos de

anticuerpos, ya sean policlonales o monoclonales de acuerdo a la

especificidad, y la eleccin de la enzima depende de su
estabilidad, bajo costo, alta velocidad de recambio, fcil deteccin,
entre otros7.
Como sustrato ptimo se tiene que elegir alguno que genere un
producto soluble cuantificable, teniendo en cuenta su estabilidad,
toxicidad y costo. En general se utiliza como primer sustrato
perxido de hidrgeno (como en este experimento) y un segundo
sustrato (Cromgeno) que cambia de color al oxidarse por el O2
liberado, que en este prctico fue Tetrametil-benzidina8.
Y finamente el anlisis de producto coloreado se logra mediante la
medicin de intensidad de color por espectrofotometra, para cada
color se debe determinar la longitud de onda a la cual se da la
mxima absorcin, para nuestro caso en Tetrametil-benzidina se
lee a 450 nm8.

Entonces al tener en cuenta todo esto como posibles errores y

enfocndonos ahora al experimento en s, la enzima peroxidasa
conjugada con el anticuerpo (luego de la unin al antgeno) debiese
generar un producto coloreado al reaccionar con los sustratos. Esto sirve
como indicador ya que la concentracin de este producto se relaciona
directamente con la cantidad de antgeno presente en la muestra 9, por
lo que al medir mediante espectrofotometra es posible detectar si hay
o no presencia de Piscirickettsia salmonis. Los resultados vistos en la
tabla 1 revelan un valor de absorbancia bajo para M2, M3 y M4 al
compararlos con la muestra M1, adems como se mencion
anteriormente se considera que los valores menores al Cut off, cuyo
valor es 0.314 como se observa en la tabla 2, no indicaran presencia
del antgeno. Entonces se presume que slo en M1 podra haber
Piscirickettsia salmonis ya que concuerda con los resultados de los
controles al haber ms cercana al control positivo, aunque la cantidad
de antgeno presente en la muestra sera relativamente pequea. Cabe
destacar tambin que hay concordancia en los controles utilizados segn
lo esperado, es decir, en C+ donde se sabe que hay antgeno se ve una
alta absorbancia, mientras que para el agua destilada (C-) esta es
mnima.
Entonces los resultados fueron bastante satisfactorios ya que hay
concordancia respecto a los fundamentos de la tcnica y lo obtenido,
adems de que hay claras evidencias que sugieren que hubo deteccin
del antgeno en M1, donde est por ejemplo el uso de controles y
tambin el hecho de haber empleado anticuerpos monoclonales (que
resultan ser ms especficos para el antgeno a detectar ya que

presentan un mayor homogeneidad)10, que dan ms fiabilidad a la

tcnica.
Conclusin
Se concluye que hay indicios muy evidentes de que haya Piscirickettsia
salmonis en la muestra 1 y no en las otras, lo que da cuenta de la
utilidad, facilidad de uso y eficiencia del mtodo SRS ELISA para la
deteccin en este caso, de la bacteria antes mencionada.

Referencias
1. http://www.salmonchile.cl/es/historia-en-chile.php#2008-2013.
Visitado 06.09.2014 a las 11.25 am
2. Fryer, J. L., Lannan, C. N., Giovannoni, S. J., & Wood, N. D. (1992). Piscirickettsia salmonis
gen. nov., sp. nov., the Causative Agent of an Epizootic Disease in Salmonid
Fishes. International Journal of Systematic Bacteriology,42(1), 120-126.
3. Gomez, F. A., Tobar, J. A., Henrquez, V., Sola, M., Altamirano, C., & Marshall, S. H. (2013).
Evidence of the presence of a functional Dot/Icm type IV-B secretion system in the fish
bacterial pathogen Piscirickettsia salmonis. PloS one, 8(1), e54934.
4. Garcs, L. H., Larenas, J. J., Smith, P. A., Sandino, S., Lannan, C. N., & Fryer, J. L. (1991).
Infectivity of a rickettsia isolated from coho salmon Oncorhynchus kisutch.
5. Gmez, F., Henrquez, V., & Marshall, S. H. (2009). Additional evidence of the facultative
intracellular nature of the fish bacterial pathogen Piscirickettsia salmonis. Arch Med Vet, 41,
261-267.
6. Gmez, S. F., Ardila, N. S. R., & Gutirrez, M. F. (1994). La inmunologa en el diagnstico
clnico. Pontificia Universidad Javeriana. Pgina 80

7. Repetto, M. (1997). Toxicologa Fundamental. Ediciones Diaz de

Santos. 335-336.
8. Gmez, A. A., Agudelo, C. M., Snchez, S. B., Clavijo, M. C., vila,
A. C., Correa, C. D., ... & Isabel, S. Fundamentos de ciencias
bsicas aplicadas a la odontologa. Pontificia Universidad
Javeriana.158-159.
9. Devlin, T. M. (2004). Bioqumica: libro de texto con aplicaciones
clnicas. Revert. 456-457.
10.
lvarez-Vallina, L. (Ed.). (2004). Anticuerpos monoclonales:
realidades y perspectivas. Editorial Complutense.