INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Ingeniera en Sistemas Ambientales

Prctica No. 9
Procesos microbianos del ciclo de nitrgeno

Grupo: 5AV1
Equipo No. 7 y 8

Integrantes del equipo:

Czares Ramos Jocelyn Mildred
Gutirrez Ruz Karen Lucero
Tinajero Domnguez Carmen Nayeli

Profesora: M. en C. Dotor Vzquez Claudia Paulina

Fecha de realizacin de la prctica: 12 de mayo del 2015

Fecha de la entrega de la prctica: 4 de junio del 2015

La tcnica al servicio de la patria

Objetivos.
1. Determinar experimentalmente los principales procesos metablicos involucrados
en el ciclo de nitrgeno.
2. Enumerar formas fisiolgicas de bacterias involucradas en estos procesos, en
diferentes muestras de suelo.

Resultados.
Protelisis
Los resultados obtenidos en la protelisis fueron colocados en la Tabla 1, donde se
muestra la cantidad de colonias con un halo trasparente que fueron contadas en el agar
leche despus del tiempo de incubacin (48hrs a 28C).
Para ello fue necesario aplicar las siguientes formulas:
FORMULA 1

UF C BH =( No. Colonias ) (

1
1
)(
)
Dilucin Alncuota

Mientras que para el clculo de UFC por gramo de suelo base seca se emple la
siguiente frmula:
FORMULA 2

UF C BS=

UF C BH x 100
100%H

Tomando en cuenta los resultados obtenidos por el equipo 8, donde se contabilizaron 5

colonias en la dilucin 10-3 empleando una alcuota de 0.1ml, sustituimos en la frmula 1
para obtener UFC Base hmeda:

UF C BH =( 5 )

1
103

1
(
( ) 0.1 )=5 x 1 0

Posteriormente para obtener UFC Base seca, sustituimos en la frmula 2, tomando en

cuenta que el %H=7.5:
4

UF C BS=

(5 x 1 0 )(100)
=5.4 x 1 0 4
1007.5

Tabla 1. Nmero de microorganismos representantes del proceso de protelisis

del Ciclo de Nitrgeno (Cuenta en placa).
Medio de
cultivo

Dilucin

Nmero de
colonias

Agar leche

Obtuvimos
muchos
organismos
proteolticos

No se
pudieron
contar

Agar leche

10-3

Equipo

UFC/g
(B.H.)

UFC/g
(B.S.)

5x104

5.4x104

Fijacin de Nitrgeno.
Los microorganismos fijadores de nitrgeno no constituyen un grupo taxonmico
homogneo, la nica caracterstica que comparten es la presencia de la enzima
nitrogenasa (Zehr J.P. y col., 1998). Dichas bacterias comprenden organismos fototrofos,
como bacterias pertenecientes a la familia Rhodospirillaceae, Clorobiaceae y
Cianobacteriae; organismos quimioautotrofos, como bacterias de los gneros Thiobacillus,
Xanthobacter y Desulfovibrio y organismos heterotrofos como las bacterias pertenecientes
a la familia Frankiaceae, al grupo Rhizobiaceae y a los gneros Azotobacter,
Enterobacter, Klebsiella y Clostridium (Sprent J. y Sprent P., 1990). Estos organismos
pueden realizar la fijacin biolgica de nitrgeno ya sea independientemente (a excepcin
de las rizobiceas) o estableciendo relaciones simbiticas (Imagen 1 y 2) con otros
organismos. Son estas formas simbiticas, concretamente las establecidas entre las
rizobiceas y las leguminosas.

Imagen 1. Ndulos de Rhizobium en

Vigna unguiculata. Fotografa: Stdout

Imagen 2. Bacterias Rhizobium en

ndulos de frijol. Fotografa: Philip
Poole

Amonificacin, Nitrificacin y Desnitrificacin.

Para determinar si un tubo en amonificacin era positivo, el cambio de coloracin deba
ser a un tono rosa mexicano, es decir, un color rosado ms intenso al comparar con el
testigo. Por otra parte para determinar si un tubo en nitritacin resultaba positivo, era
cuando al adicionar las tres gotas de cada reactivo de Griess A y B, se obtena un cambio
de color a un tono rosado ms intenso que el testigo mientras que al resto de los tubos
negativos se les adicion granalla de Zinc y si se obtena una coloracin mayor a la del
testigo eran positivos para nitratacin. Por ltimo, en el caso de los tubos de
desnitrificacin un tubo positivo era aquel en el que haba produccin de gas y turbidez.
Para determinar el NMP/g base seca, fue necesario obtener el nmero caracterstico
correspondiente a cada prueba de acuerdo al nmero de tubos positivos identificados,
posteriormente se busc en las tablas de NMP el nmero correspondiente y con ello
encontrbamos el NMP base hmeda y se emple la frmula 2 nuevamente para obtener
el NMP base seca. Sin embargo si la tabla no manejaba las diluciones empleadas fue
necesario aplicar la siguiente frmula para corregir el nmero encontrado en tablas y
obtener el NMP base hmeda indicado:
FORMULA 3

NMP( B. H .)=

NMP
xFD
100

Donde:

FD=Factor de dilucin ( El valor medio de las diluciones , con signo positivo)

NMP=Nmero Ms Probable( De tabla)

Y al obtener el NMP (B.H) correcto, se emplea nuevamente la frmula 2 para obtener el
NMP base seca correspondiente.
Tomado en cuenta los datos obtenidos por el equipo 8 en amonificacin donde se obtuvo
el nmero caracterstico de 2-2-3 y al cual le corresponde un NMP= 42, sin embargo las
diluciones no coinciden con las de la tabla por ello se emple la frmula 3 para corregir el
nmero obtenido tomado en cuenta que el FD=103.
Sustituyendo en la frmula 3:

NMP ( B . H . ) =

42
x 1 03=420
100

Posteriormente se emple la frmula 2 modificada para obtener el NMP base seca

correspondiente, como se muestra a continuacin:

NM PBS=

NM PBH x 100
100%H

Sustituyendo en la formula anterior tomando en cuenta %H=7.5 tenemos que:

NM PBS=

420 x 100
2
=4.54 x 10
1007.5

Los resultados obtenidos en la amonificacin, nitrificacin y desnitrificacin fueron

colocados en las Tablas 2 y 3.
Tabla 2. Nmero de microorganismos representantes de los procesos del Ciclo de
Nitrgeno (Numero Ms Probable) Equipo 7.
Tubos positivos por
Medio
NMP en NMP/g
NMP/g
dilucin
Proceso
de
la tabla
(B.H.)
(B.S.)
cultivo
10-1
10-2
10-3
10-4
Amonificaci
4.48x
Stuart
-3
1
0
430
430
n
102
Nitritaci
1.1458x
3
3
3
->1100
>1100
n
103
Nitrificaci
n
Nitrataci
-------n
Con
Desnitrifica
1.1458x
asparagi
-3
3
3
>1100
>11000
cin
104
na
Tabla 3. Nmero de microorganismos representantes de los procesos del Ciclo de
Nitrgeno (Numero Ms Probable) Equipo 8.
Tubos positivos por
Medio
NMP en NMP/g
NMP/g
dilucin
Proceso
de
la
tabla
(B.H.)
(B.S.)
cultivo
10-1
10-2
10-3
10-4
Amonificaci
Stuart
-2
2
3
42
420
4.54x102
n
Nitritaci
0
1
1
-6.1
6.1
6.59
n
Nitrificaci
n
Nitrataci
0
0
0
-<3
<3
<3
n
Con
Desnitrifica
asparagi
-3
2
2
210
2100
2.27x103
cin
na
Por ltimo, se recab la informacin de todos los sitios de muestreo y se coloc en la
Tabla 4.
Tabla 4. Nmero de microorganismos representantes de los procesos del Ciclo de
nitrgeno en la zona de muestreo (NMP o UFC por gramo de base seca)

EQUIPO;ESTACIN
PROCESO

Amonificac
in

Nitrificaci
n

Desnitrifica
cin

Proteolsis

1;1

2;3

X102

383.3
3

TN

TN

--

1.7

8 X102

5.37
X104

1.8
X104

ND

3;
4

40

3.3
3
3.3
3

40

ND

4;5

122.03

5;1
2.89X1
032.89X
10^3

20.33

11.211.
2

5.08

7.4

1.86

5.54

X104

X103

ND

ND

6;3
1.5
7

7;4

8;5
4.5
4

X103
2.89
X10
^3

4.48x
102

31.
5
31.
5
2.4
2

1.1458x
103

6.5
9

--

<3

X102

X102
2.89
X10
^3

1.1458x
104

ND

ND

2.2
7
X103

5.4
0
X104

ND: No disponible para ser contado debido a un exceso de crecimiento.

TN: Tubos negativos

Tabla 5. Logaritmos de NMP o UFC por gramo de base seca.

EQUIPO;ESTACIN
PROCESO
1;1
2;3
3;4
4;5
5;1
6;3
7;4
Amonificacin
2.23 2.58 1.60 2.08 3.46 3.19 2.65
-0.69 0.52 1.30 1.04 1.49 3.05
Nitrificacin
--0.52
0.7
0.86 1.49
-Desnitrificacin 2.90 4.25 1.60 4.26 3.74 2.38 4.05
Proteolsis
4.72
-------

8;5
2.65
0.81
< 0.47
3.35
4.73

Grfica 1. Log de UFC/g o NMP/g suelo en base seca

5
4.5
4
3.5
3
2.5

Log de UFC/g o NMP/g suelo en base seca

2
1.5
1
0.5
0

Amonificacin

Nitritacin

Nitratacin

Desnitrificacin

Proteolisis

Discusin.
a) Proteolsis.
Solo dos equipos pudieron cuantificar la protelisis, que fueron el equipo
uno y ocho, los otros equipos necesitaban realizar un dilucin mayor a 10 -3.
Las muestras que tuvieron mayor actividad se debe a la gran presencia de
hongos y bacterias en estas zonas, que producen proteasas extracelulares.
Los microorganismos participantes en la descomposicin son bacterias,
hongos y actinomicetos. Entre las bacterias tenemos: Bacillus, Bacterium,
Pseudomonas, Proteus. Los hongos ms frecuentes son: Trichoderma,
Penicillium, Mucor, Aspergillus, Alternaria y Cladosporium.
b) Produccin de amoniaco (Amonificacin).
Como se observa en la grfica 1, los equipos cinco y seis (estaciones uno y
tres, respectivamente) fueron la que presentaron mayor produccin de
amoniaco, esto quiere decir que el suelo en estas estaciones es rico en
materia orgnica y por lo tanto hay microorganismos, como hongos y
bacterias (Bacillus cereus, Proteus vulagaris y Pseudomonas sp.), que

participan en la descomposicin de protenas, llevando a cabo el proceso

de amonificacin. En las estaciones cuatro y cinco tambin se llev a cabo
este proceso, pero en menor medida a comparacin de las otras
estaciones, esto debido a que las muestras entre equipos fueron tomadas
de diferentes lugares o que la cantidad de materia orgnica o de
microorganismos es menor en el sitio de muestreo.
c) Fijacin de Nitrgeno.
La fijacin biolgica del nitrgeno atmosfrico, consistente en la reduccin
de N2 a NH4+ por la enzima nitrogenasa, es, despus de la fotosntesis, la
ruta metablica ms importante para el mantenimiento de la vida en la
Biosfera. Curiosamente, este proceso crucial slo puede ser llevado a cabo
por unos pocos grupos de seres vivos, todos ellos procariotas (Sprent J. y
Sprent P., 1990). La mayora de estos procariotas fijadores de nitrgeno
viven libremente en el suelo, sin embargo unos pocos forman asociaciones
simbiticas con plantas superiores, en la que el procariota aporta a la planta
hospedadora nitrgeno fijado y lo intercambia por otros nutrientes y
carbohidratos. Dichas simbiosis tienen lugar en ndulos que se forman en
las races de la planta y que contienen las bacterias fijadoras de nitrgeno,
los cuales se pudieron observar en las imgenes 1 y 2. Como el oxgeno
inactiva irreversiblemente a la nitrogenasa implicada en la fijacin del
nitrgeno, el proceso de fijacin del nitrgeno tiene lugar en condiciones
anaerbicas. Cada uno de los microorganismos fijadores de nitrgeno
funciona bien bajo condiciones anaerbicas o bien crean un entorno interno
anaerbico en presencia de oxgeno.
Cabe destacar que sta actividad no la realizamos en el laboratorio, debido
a la falta de material biolgico.

d) Nitrificacin.
a. Nitritacin.
En este caso, las estaciones tres y cuatro obtuvieron los valores ms
altos, lo que indica la presencia de bacterias como Nitrosomas,
Nitrosolobus, Nitrosococcus y Nitrospira llevaron a cabo el proceso
de oxidacin del in amonio a nitritos, sin embargo en las dems
estaciones tambin se llev a cabo este proceso pero en menor
cantidad, excepto en la muestra obtenida por el equipo uno (estacin
uno), donde los tubos salieron negativos para este proceso.
b. Nitratacin.
Esta se forma a partir de la oxidacin de los nitritos. Los nitratos son
una parte esencial de los abonos de las plantas, ya que la gran
mayora obtiene el Nitrgeno que necesitan para su desarrollo de los
nitratos. Este proceso se realiza por bacterias Nitrobacter, en los
equipos uno, dos y siete no presentaron este proceso, esto debido a
que haya faltado ms tiempo para que se llevara a cabo la
nitratacin, los equipos tres, cuatro, cinco, seis y ocho obtuvieron
resultados en la nitratacin, aqu fue ms rpido este proceso.
e) Desnitrificacin.

Conclusin.
Se simularon los diferentes procesos del ciclo del nitrgeno, para saber cmo se
lleva a cabo el ciclo del nitrgeno en el suelo muestreado de las cascadas de
Tlaxcala, y los microorganismos que estn presentes para poder llevar acabo cada
proceso del ciclo. Como en la proteolsis se puede a precisar que hubo una gran
cantidad de bacterias y hongos que producan proteasas extracelulares. En
algunos suelos muestreados se obtuvo gran cantidad de materia orgnica y los
microorganismos descomponen a las protenas, por lo cual hubo una buena
amonificacin. El ciclo del nitrgeno es de suma importancia para tener un
equilibrio ecolgico, ya que los microorganismos juegan un papel muy importante
en la transformacin de diferentes compuestos que pueden ser benficos o
perjudiciales dependiendo la cantidad del compuesto, como lo es el amoniaco.

Cuestionario.
1.- Qu factores pueden alterar el nmero de microorganismos involucrados en el
ciclo de nitrgeno?
Hay muchos factores limitantes de la simbiosis para la fijacin del nitrgeno, pero
presumiblemente las ms importantes son las clases de terreno, la luz, la temperatura, el
agua, los elementos minerales, etc.
Elementos minerales. Deficiencias o excesos en determinados elementos minerales
afectan directamente o indirectamente en la nodulacin. Por ejemplo el molibdeno es un
constituyente de la nitrogenasa, as que un defecto de Mo en el medio causa un efecto
directo y negativo en la fijacin del nitrgeno. Sin embargo el Fe (que tambin es un
elemento constituyente de la nitrogenasa) no tiene un efecto directo sobre la fijacin del
nitrgeno cuando este escasea en el medio. Tambin son importantes otros elementos
como calcio, fsforo, azufre, cobre o zinc ya que originan cambios en el pH que si que va
a afectar directamente a la fijacin. Los fertilizantes qumicos utilizados tratan de
influenciar un mayor crecimiento de la planta y una mayor con fijacin del nitrgeno.
Temperatura. Que la temperatura afecta a la simbiosis esta claro, pero esta interaccin es
de modo indirecto aparece de un modo no especifico a travs de los procesos
metablicos de la planta como respiracin, fotosntesis, transporte y transpiracin. En las
leguminosas estudiadas, que tienen un ciclo de Calvin normal, su temperatura ptima es
de 15 a 20 C. No se han encontrado leguminosas tropicales con metabolismo C4. La
respiracin se incrementa con las altas temperaturas, esto hace que haya una menor
disponibilidad de carbono para la simbiosis. Con menos de 7 C la nodulacin se hace
muy poco probable. En el caso extremo de altas temperaturas, se reduce el nmero de
races laterales y pelos radicales, haciendo que la probabilidad de nodulacin sea menor.
A temperatura extremas tiene lugar una degradacin de los ndulos.
Luz. La luz afecta a la simbiosis a travs de la fotosntesis, controlando la cantidad de
carbohidratos para el desarrollo y funcionamiento del modulo. Existen evidencias de
algunos efectos directos de la luz sobre la nodulacin, as es por ejemplo que la
nodulacin es pobre bajo luz azul y mxima bajo efecto de la luz roja - esto implica una
evidencia de la implicacin del fitocromo reversible en el proceso de nodulacin). Se han
hecho experimento con la defoliacin gradual de las plantas y se ve claramente como hay
una reduccin en la fijacin del nitrgeno.
Agua Las deficiencias en la disponibilidad de agua causan un bajada en la fijacin del
nitrgeno en leguminosas de todo el mundo, de todos modos hay diferentes adaptaciones
de estas plantas a las diversas condiciones de sequa, como ejemplo podemos citar a M.
sativa que llega a proyectar sus races hasta siete metros de profundidad. Otros factores
Otros factores posibles pueden ser los gases que hay en el terreno, las enfermedades
como hongos, virus o micoplasmas (se ha estimado que estas enfermedades causan una
perdida de al menos el 24 % de las leguminosas del forraje). Por ultimo debemos decir
que las actividades del hombre tambin han modificado las cantidades de fijacin de

nitrgeno, la mayor parte de las veces es en beneficio (como puede ser la contribucin a
la nodulacin con diferentes fertilizantes que ofrecen minerales al suelo que ayuda a la
nodulacin).
2.- Cmo afecta la presencia de o ausencia de oxgeno en los diferentes procesos
del ciclo del nitrgeno? (Haga una tabla).
PROCESO
Proteolsis

PRESENCIA
DE
OXGENO
Se lleva a cabo el proceso

Produccin de amoniaco

Se lleva a cabo el proceso

por aerobiosis.

Fijacin de nitrgeno

Se lleva a cabo por

fototrficos oxignicos.

Nitrificacin

Se lleva a cabo mediante

oxidacin de amonio y
nitritos, por Nitrosomonas
sp. y Nitrobacter sp.
No se lleva a cabo, debido
a que las bacterias que
participan son anaerobias
estrictas.

Desnitrificacin

AUSENCIA DE OXGENO
No se lleva a cabo, debido
a que las bacterias que
participan son aerobias
estrictas.
Se lleva a cabo el proceso
por
anaerobiosis
o
mediante la ureasa.
Se lleva a cabo por
fototrficos anoxignicos,
metanognesis
No se lleva a cabo.

Este proceso se lleva a

cabo
bajo
condiciones
anoxignicas.

3.- La adicin de fertilizantes nitrogenados puede tener consecuencias en los

procesos globales de contaminacin. Indique usted cuales podran ser esas
consecuencias.
A principios del siglo 20, un cientfico alemn llamado Fritz Haber descubri como acortar
el ciclo del nitrgeno fijando qumicamente el nitrgeno a altas temperaturas y presiones,
creando as fertilizantes que podan ser aadidos directamente al suelo. Esta tecnologa
se extendi rpidamente durante el ltimo siglo.
No todos los fertilizantes de nitrgeno aplicados a los campos de la agricultura se
mantienen para alimentar los cultivos. Algunos son barridos de los campos de agricultura
por la lluvia o el agua de irrigacin, y son lixiviados en la superficie o en el agua del suelo
y pueden acumularse. En el agua del suelo que se usa como fuente de agua potable, el
nitrgeno excesivo puede provocar cncer en los humanos y dificultades respiratorias en
los nios. La U.S. Environmental Protection Agency (Agencia de Proteccin Ambiental de
los Estados Unidos) ha establecido un estndar de nitrgeno para el agua potable que es
de 10 mg por litro de nitrato-N. Desafortunadamente, muchos sistemas (particularmente
en las reas de agricultura) ya exceden estos niveles. En comparacin, los niveles de

nitrato en las aguas que no han sido alteradas por la actividad humana y rara vez son
mayores de 1 mg/L.
Una de las consecuencias seria la acumulacin de nitratos en el subsuelo, puede originar
una eutrofizacin del medio. En un medio eutrofizado, se produce la proliferacin de
especies como algas y otras plantas verdes que cubren la superficie. Esto trae como
consecuencia un elevado consumo de oxgeno y su reduccin en el medio acutico, as
mismo dificulta la incidencia de la radiacin solar por debajo de la superficie. Estos dos
fenmenos producen una disminucin de la capacidad auto depuradora del medio y una
merma en la capacidad fotosinttica de los organismos acuticos.
El nitrgeno es uno de los principales contaminantes de las aguas subterrneas. Es
conocido que las plantas aprovechan nicamente un 50% del nitrgeno aportado en el
abonado, esto supone que el exceso de nitrgeno se pierde, generalmente lavado del
suelo por el agua que se filtra al subsuelo, siendo arrastrado hacia los acuferos, ros y
embalses, contaminando, por tanto, las aguas destinadas a consumo humano.
El nitrgeno reactivo (como el NO3- y NH4+) que se encuentra en el agua y suelos de la
superficie, tambin puede ingresar en la atmsfera como el componente del smog xido
ntrico (NO) y el gas de invernadero xido nitroso (N2O). Eventualmente, este nitrgeno
atmosfrico puede ser soplado en ambientes terrestres que son sensibles al nitrgeno
causando cambios de largo plazo. Por ejemplo, los xidos de nitrgeno contienen una
porcin significativa de la acidez en la lluvia cida que es la causante de la deforestacin
en partes de Europa y del Noreste de Estados Unidos. El aumento de depsitos de
nitrgeno atmosfrico tambin causa los cambios ms sutiles en las especies dominantes
y funciones del ecosistema en algunos bosques y prados. Por ejemplo, en los suelos
serpentina con poco nitrgeno de los prados del Norte de California, los conjuntos de
plantas se han limitado histricamente a las especies nativas que pueden sobrevivir sin
mucho nitrgeno. En este momento, hay evidencia que los niveles elevados de entrada de
N atmosfrico proveniente del desarrollo industrial y agrcola, han allanado el camino para
una invasin de plantas no nativas. Como se ha sealado con anterioridad, el NO es un
factor esencial en la formacin del smog, que tambin causa enfermedades respiratorias
como el asma en nios y adultos.
4.- Cuales son las ecuaciones qumicas que se llevan a cabo en cada uno de los
procesos biolgicos analizados.
Fijacin del nitrgeno
N2

Nitrogena

16
ATP
Nitrificacin
NH3+ + O2

2NH4

NO2 - + 2 H+ + H2O Nitrosomonas sp.

NO2- + O2

NO3 - Nitrobacter sp.

Desnitrificacin
NO3- NO2N2O N2
Mineralizacion
NH2-CO-NH2+ H2O

Ureasa

CO2 +2NH3

CH3-CHNH2-COOH+
COOH+NH3

H2O

CH3-CHO-

Anaerobiosis
CH3-CHNH2-COOH+O2

Aerobiosi
s

CH3-COOH+CO2+NH3

Protelisis
Ruptura de enlaces
Descomposicin de

peptdicos de las protenas.

materia orgnica

Bibliografa

https://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/bolarios/Investigacion/fijacionN.htm

www.bosquesmediterraneos.com/wp.../bacterias-fijadoras-nitrogeno.pdf

http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bradyrhizobium

http://www.uprm.edu/biology/profs/massol/manual/p3-nitrogeno.pdf