La phase préclinique

Anouar Hadji (AH)

Euloge Ganpo (EG)
 Abréviations
5’-DFCR : 5’-désoxy-5-fluorocytidine
5’-DFUR : 5’-désoxy-fluorouridine
5'-DVCR : 5'-désoxy-5-vinylcytidine
5'-DVUR : 5'-désoxy-5-vinyluridine
5-FU : 5-fluorouracil
5-FUMP: Fluorouricine monophosphate
5-FUDP: Fluorouricine diphosphate
5-FUTP: Fluorouricine triphosphate
5-dFUMP: Désoxyfluorouricine monophosphate
5-dFUDP: Désoxyfluorouricine diphosphate
5-dFUTP: Désoxyfluorouricine triphosphate
5-dUMP: Désoxyuridine monophosphate
5-dTMP: Désoxythymidine monophosphate
5-dTDP: Désoxythymidine diphosphate
5-dTTP: Désoxythymidine triphosphate
5-VU : 5-vinyluracil
ADME : Absorption, Distribution, Métabolisme, Élimination
ADN : L’acide désoxyribonucléique
ARN : L'acide ribonucléique
AUC : Aire sous la courbe
BPL : Bonnes Pratiques de Laboratoire
CCPA : Conseil canadien de protection des animaux
Cl : Clairance
Cmax : Concentration Maximale
DPD : dihydropyrimidine déshydrogénase
DPDi : Inhibiteur de dihydropyrimidine déshydrogénase
dThdPase: Thymidine phosphorylase
ECG : L'électrocardiogramme
FBAL: α-fluoro-β-alanine
FUPA: Acide 5-fluorouréidopropionique
HED: Human Equivalent Dose
ICH : International Conference on Harmonisation
IP : Intrapéritonéale
IV : Intraveineuse
MRSD: Maximum Recommended Starting Dose
MTD: Maximum Tolerated Dose
NOAEL: No Observed Adverse Effect Level
SNC : Système Nerveux Central
T1/2 : Temps de demi-vie
Tmax : Temps maximum

2
TS : Thymidine synthase

Table de matières
I- Sommaire : (AH).......................................................................................................................3
II- La stratégie (AH)....................................................................................................................4
III- Les espèces et les conditions animales (AH)..........................................................................5
IV- Études pharmacodynamiques (AH).......................................................................................6
IV.1 Mécanisme d’action (AH)...............................................................................................6
IV.2 Objectifs de la phase préclinique (AH)..........................................................................8
IV.3 Tests in vitro (AH)...........................................................................................................9
IV.4 Tests in vivo (AH).........................................................................................................10
V- Études de pharmacocinétique (ADME) (AH).......................................................................11
V.1 Absorption (AH).............................................................................................................11
V.2 Distribution (AH).............................................................................................................12
V.3 Métabolisme (AH)...........................................................................................................12
V.4 Élimination (AH)............................................................................................................13
VI- Études de toxicité à doses croissantes (AH)........................................................................14
VII- Études de toxicité à dose unique (AH)...............................................................................15
VIII- Études de toxicité à doses répétées (toxicité chronique): (AH).........................................16
IX- Conversion chez l’Homme (HED) : (AH)...........................................................................17
X- Génotoxicité : (AH)...............................................................................................................18
XI- Cancérogénicité : (AH)........................................................................................................19
XII- Études d’innocuité pharmacologique : (EG).......................................................................20
Les études cardiovasculaires : (EG)........................................................................................20
XIII- Études de tolérance locale (EG)........................................................................................23
Les Études du système gastro-intestinal : (EG)......................................................................23
XIV- Études de reproduction (EG)............................................................................................24

La phase préclinique

I- Sommaire : (AH)

3
Les études précliniques vont permettre d’évaluer l’efficacité et l’innocuité de la colocitabine et la
provynuril en premier lieu, une fois le profil d’innocuité est évalué on procède aux études
précliniques de l’association de ces 2 derniers, avant leurs administrations chez l’humain.
Le but de l’association est en faite d’augmenter l’efficacité anticancéreuse de la colocitabine en
inhibant la DPD par l’intermédiaire du 5–vinyluracil (5-VU) préférentiellement au niveau des
tissus tumoraux. Les études de pharmacodynamie in vitro ont déterminé que la colocitabine est un
précurseur de la 5-fluorouracil (mécanisme d’activation enzymatique en 3 étapes), alors que la
provynuril est un précurseur de la 5-vinyluracil (mécanisme d’activation enzymatique en 3 étapes).
La 5-FU bloque la voie anabolique de la méthylation de l’acide désoxyuridylique en acide
thymidylique, ce qui perturbe la synthèse de l’acide désoxyribonucléique (ADN).
L’incorporation du 5-FU entraîne également une inhibition de la synthèse de l’ARN et des
protéines. La 5-VU quant à elle, elle inhibe le métabolisme du 5-FU par le DPD qui est
surexprimé au niveau de cellules tumorales permettant ainsi une meilleure efficacité de la 5-
FU. En effet, la pro en inhibant la DPD permet d’éviter la variation circadienne qui est
responsable de la résistance au traitement de la colocitabine (5-FU) seule. (17)

II- La stratégie (AH)

Le développement préclinique joue un rôle clé dans l’évaluation de l’efficacité et l’innocuité

d’un médicament pour l’Homme. Comme premier but du développement préclinique est la
prise de décision de commencer le développement clinique.
Le programme préclinique passe au préalable par l’élaboration d’une stratégie et d’un plan
opérationnel prenant en compte la cible thérapeutique visée, le contexte réglementaire, des
éléments scientifiques et les interactions avec les différents services de R&D.
Définir un programme préclinique, destiné à soutenir le développement clinique et finalement
l’enregistrement du médicament, nécessite donc de s’appuyer sur une argumentation solide sur
laquelle va reposer la stratégie et le plan opérationnel mis en œuvre. (2)
Après le développement des molécules prototypiques et leurs optimisations, on procède aux
études chez l’animal afin d’évaluer l’efficacité ainsi que l’innocuité de chacun de nos
molécules, de l’association ainsi que les backups, éventuellement avant leurs administration
chez l’Homme.
Notre stratégie pour la phase préclinique est comme suit :

4
 • Tester les différents molécules précurseurs de 5-FU ainsi que de l’inhibiteur de la DPD
séparément, et soumettre les données aux responsables la phase clinique I, afin de les
évaluer et de les tester et de nous retourner leurs suggestions pour le développement de
l’association : Prodrogue 5-FU + Inhibiteur de DPD
• Afin de gagner le temps (temps c’est l’argent) et en collaboration avec l’équipe de la
phase clinique I et en se référant aux résultats obtenus préalablement, on procède aux
différents tests sur le lead (chef de file) retenu comme prodrogue de la 5-FU en
association avec l’inhibiteur de la DPD.
Cette étape de développement est composé de plusieurs études qui se chevauchent : Tout
d’abord les études d’escalade de doses chez un rongeur et un non-rongeur afin de déterminer
les doses à utiliser pour les études éventuelles, une fois terminées, les études de toxicités à
court terme ainsi que les études pharmacocinétiques seront entamées. Une fois le profil
d’innocuité et de pharmacologie sont excellents, on procède aux études de toxicité à long terme
ainsi qu’aux études d’innocuité pharmacologique.
Les études de toxicologie chronique, les tests in vitro d’Ames et d’aberration chromosomique
ainsi que les deux premiers segments des études de reproductions devront être totalement
compléter avant d’entamer la phase clinique I.
Les études de génotoxicité in vivo sur les micronoyaux, les études de toxicité subaigüe (doses
répétées pendant 14 jours), le dernier segment des études de reproduction doivent être achevées
avant d’entamer la phase II. Enfin les études de cancérogénicité avant la phase III. (14)

III- Les espèces et les conditions animales (AH)

Un des facteurs importants à considérer quand on fait le design du programme de toxicologie

est la sélection appropriée des espèces animales. En effet cette sélection appropriée permet
d’optimiser la qualité des données générées et donc améliorer la prédiction des effets chez
l’humain. (18)
Comme nos molécules sont des prodrogues, pour le choix des espèces animales on a tenu
compte des caractéristiques des molécules de notre association, leurs conversion chez ces
espèces, de la similarité du profile pharmacocinétique incluant la biotransformation et
l’exposition aux principaux métabolites que chez l’humain, sans oublié la littérature actuelle et
les études scientifiques antérieures.

5
Toutes les expérimentations animales ont été effectuées en conformité avec le guide pour le
soin et l'utilisation des animaux d'expérimentation du Canada et le CCPA : Conseil canadien de
protection des animaux.
Tous les animaux étaient logés dans des cages et maintenu dans des conditions contrôlées de
température (22 ± 2ºC), humidité relative (55 ± 15%) et un cycle de lumière (12 heures / jour).
Des singes Rhésus (d’environ 3 à 5 kg de poids corporel) ont reçus 100 g / jour /unité du poids
corporel d’un régime spécifique et de l'eau du robinet à volonté. Après les tests hématologiques
et biochimiques sanguines, les singes qui affichent des conditions normales ont été
aléatoirement affectés à un traitement, de même pour les chiens beagle. Des rats Sprague-
Dawley S-D (âgés de 4 semaines) et des souris CD1 (âgés de 4 semaines) ont reçus le régime
CDF1 et de l'eau stérile à volonté. Après une période de réadaptation selon l’espèce (Pour les
souris et les rats : 7 jours, pour les chiens : 4 semaines et pour les singes : 8 semaines), les animaux
ont été aléatoirement affectés à un traitement. (14)
Une randomisation selon le poids et le sexe des animaux a été également effectuée préalablement à
chaque étude, et ce, afin d’obtenir des groupes relativement comparables. Les animaux ont été
achetés des laboratoires Charles Rivers de Montréal, ce qui assure une qualité des modèles
animaux. (12)

IV- Études pharmacodynamiques (AH)

IV.1 Mécanisme d’action (AH)

L’association colocitabine-provynuril est une fluoropyrimidine inhibitrice de la

dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD), administrable par voie orale. La colocitabine et la
provynuril suivent plusieurs étapes enzymatiques. Les trois enzymes impliquées dans la
conversion en 5-FU et en 5-vinylfluorouracil, la carboxylésterase et l’esterase, la cytidine
désaminase et la thymidine phosphorylase qui sont surexprimées dans les tissus tumoraux. (3,
4, 5)
La colocitabine traverse la barrière intestinale sans y subir de dégradation puis elle est
métabolisée au niveau hépatique en 5’désoxy-5-fluorocytidine (5’-DFCR) par la
carboxylestérase, puis en 5’désoxy-5-fluorouridine (5’-DFUR, doxifluridine) par la cytidine
désaminase dans le foie et les tissus tumoraux (7, 20). L’étape finale qui aboutit à la formation
de 5-FU se fait préférentiellement au niveau tumoral car elle est médiée par la thymidine
phosphorylase qui est surexprimée dans les cellules tumorales. (8, 9)

6
La 5-FU bloque dans la voie anabolique de la méthylation de l’acide désoxyuridylique en acide
thymidylique, ce qui perturbe la synthèse de l’acide désoxyribonucléique (ADN).
L’incorporation du 5-FU entraîne également une inhibition de la synthèse de l’ARN et des
protéines. Comme l’ADN et l’ARN sont indispensables à la division et à la croissance
cellulaires, il est possible que le 5-FU agisse en générant une carence en thymidine qui
provoque des déséquilibres de croissance et la mort cellulaire. Les effets de la carence en ADN
et en ARN sont plus intenses au niveau des cellules qui prolifèrent plus rapidement et qui
métabolisent plus vite le 5-FU.
De même pour l’inhibiteur de la DPD : la provynuril traverse la barrière intestinale sans y
subir de dégradation puis il est métabolisé au niveau hépatique en 5’désoxy-5-vinylcytidine
(5’-DVCR) par une estérase, puis en 5’désoxy-5-vinyluridine (5’-DVUR) par la cytidine
désaminase dans le foie et les tissus tumoraux (10). L’étape finale qui aboutit à la formation de
5-VU se fait préférentiellement au niveau tumoral car elle est médiée par la thymidine
phosphorylase qui est surexprimée dans les cellules tumorales.
Comme synthèse, on peut supposer que le nouveau mécanisme de l’association colocitabine-
provynuril va augmenter l’activité anticancéreuse de la colocitabine via 5-FU suite à
l’inhibition irréversible de la DPD (11), préférentiellement dans les tissus tumoraux et donc
une augmentation de l’efficacité couplée à une meilleure innocuité.

7
Mécanisme d’action de l’association la colocitabine et la provynuril PRORACILEX® (16)

IV.2 Objectifs de la phase préclinique (AH)

Les études de la phase préclinique ont pour but de prouver le concept du mécanisme
d’action (efficacité et innocuité) de chacun de nos prodrogues ainsi que de l’association
colocitabine-provynuril dans un environnement in vitro et in vivo, afin de supporter les
études cliniques proposées depuis la phase I jusqu’à la demande d’homologation (NDA).
(17)

8
IV.3 Tests in vitro (AH)

Ces études ont pour but de mettre en évidence l’efficacité, la puissance et la sélectivité de la
colocitabine ainsi que la provynuril sur des cellules tumorales humaines et animales (rat), et
enfin de démontrer que la provynuril augmente l’efficacité et la puissance de la colocitabine
sélectivement sur une grande variété de cellules cancéreuses.
• Les cellules tumorales humaines :
Plusieurs lignées de cellules cancéreuses ont été utilisées : LXFL529, MX-1, HT-3, Capan-1,
NCI-H441, NCI-H460, A549, PC-3, HCT116, SW480, COLO201, LXFL529, MX-1,
HCT116-DPD et HCT116-pRC qui expriment une grande activité de DPD.(11)
 Pour la colocitabine, cette dernière à été conçu pour générée la 5-FU préférentiellement
dans les cellules cancéreuses. Une fois dans les cellules cancéreuses la 5-FU générée à
partir de la colocitabine bloque la voie de la méthylation de l'acide désoxyuridylique en
acide thymidylique ce qui perturbe la synthèse de l’ADN. L'incorporation de 5-FU
entraîne également une inhibition de l'ARN et la synthèse des protéines. Étant donné
que l'ADN et l'ARN sont essentiels à la division et la croissance cellulaire, l’effet de 5-
FU peut créer un déficit en thymidine qui provoque des déséquilibres de la croissance
et la mort cellulaire.
Il faut noter que l’activité de la colocitabine est freinée par la DPD, surtout pour les
cellules présentant de fortes concentration en ce dernier ce qui nécessite de forte dose
de colocitabine afin de permette une efficacité mais au dépend de l’innocuité.
 Pour l’inhibiteur de la DPD, la provynuril : son administration seule n’a pas d’effet sur
la multiplication cellulaire des cellules cancéreuses mais à démontrer qu’il a un fort
effet inhibiteur sur la DPD qui est l’enzyme responsable de la dégradation de la 5-FU et
qui est surexprimée dans les cellules cancéreuses. (voir Figure 1) (11)
 L’association colocitabine-provynuril a été conçue et développée comme des pro-
drogues générant, d’une part l'agent cytotoxique 5-FU au niveau intracellulaire et
d’autre part un inhibiteur de la dégradation de ce dernier : le 5-VU permettant ainsi
d’augmenter l’efficacité du 5-FU préférentiellement au niveau des cellules tumoraux.
Les données à partir de culture de lignées de cellules cancéreuses humaines indiquent
que la colocitabine est cytotoxique uniquement après sa conversion en 5-FU (3).
Les études d’antiprolifération, ont démontré qu’il ya une augmentation de la sensibilité
des cellules cancéreuses à la colocitabine suite à l’addition de la provynuril; la valeur

9
 de la IC50 de la 5-FU pour les cellules HCT116-DPD en présence de la 5-VU été 1/7
que dans l’absence de ce dernier. (Voir tableau I) (11)

IV.4 Tests in vivo (AH)

Il est très difficile de prévoir l’effet des différents facteurs (génétique, environnement,
physiopathologie) sur l’activité enzymatique, d’où la nécessité des études in vivo. Ces études
permettront de confirmé l’activité de la colocitabine et de l’inhibiteur de la DPD suite aux
résultats in vitro.
Après avoir inoculé des souris de 4 à 5 semaines par des petits morceaux de tissus
tumoraux surexprimants la DPD (HCT116-DPD) par voie sous-cutanée et que les
tumeurs ont atteints 100 mm³, plusieurs tests ont étés effectués.
Ces tests ont permis de confirmer :
 Aux différentes doses, l’action inhibitrice de la colocitabine sur la synthèse de l’ADN
et l’ARN ce qui provoque des déséquilibre de la croissance et enfin la mort cellulaire
qui a été visualisé par la réduction de la taille des ganglions tumoraux,

 L’action inhibitrice de la DPD préférentiellement dans les cellules cancéreuses (vu la

surexpression de ces enzymes dans les tissus cancéreux),
 Les tests de la combinaison colocitabine-provynuril ont étés conduites dans le but de
prédire son efficacité et sa supériorité pour traiter le cancer colorectale métastasique et
le cancer du côlon de stade III (stade B et C de Dukes) comparativement à la
colocitabine seule.
Ainsi la colocitabine seule n’été pas efficace à des doses de 200 mg/kg/jour; cependant,
par contre en présence de la provynuril à doses de 10,1 mg/kg/jour, la colocitabine
devient efficace envers les cellules tumorales même à des doses de 200 mg/kg/jour. Ces
études d’antiprolifération, ont démontré qu’il ya une augmentation de la sensibilité des
cellules cancéreuses à la colocitabine suite à l’addition de la provynuril; la valeur de la
IC50 de la 5-FU pour les cellules HCT116-DPD en présence de la 5-VU été1/4,5 que
dans l’absence de ce dernier. (Voir tableau II) (11)
À des fortes doses de 750 mg/kg/jour la colocitabine à fortement inhibée la croissance
tumorale, par contre le degré d’inhibition été plus élevé lorsque la colocitabine été co-
administrée avec la provynuril à des doses de 3.37 et 10.1 mg/kg/jour. (Voir figure 3)
(11)

10
V- Études de pharmacocinétique (ADME) (AH)

Il est très important de savoir le devenir d’un principe actif dans l’organisme (chez l’animal
vivant) puisqu’il est très difficile de prédire avec certitude le degré d’absorption et l’effet du
premier passage en se fiant uniquement sur les propriétés physicochimiques, les
caractéristiques de dissolution in vitro du médicament ou de sa formulation et des études
métaboliques in vitro à cause de la complexité des phénomènes in vivo. (15)
Pour les études de toxicocinétiques elles aident à définir la relation entre la dose et le profil de
toxicité chez l’animal. (ICH S3A, S3B)
En effet, chez plusieurs espèces animales (chien, rat, souris, et singe) on a procédé à investiguer la
pharmacocinétique.

V.1 Absorption (AH)

Après administration orale, la colocitabine est rapidement et largement absorbée sans y subir
de dégradation, puis transformée de façon importante en ses métabolites : 5'-DFCR et 5'-DFUR
(6, 7, 20).
De même pour la provynuril, elle est rapidement absorbée et transformée en ses métabolites 5’-
DVCR et 5’-DVUR. Pour les deux prodrogues, et selon les marges de doses utilisées
l’exposition augmente proportionnellement à la dose.
Pour l’association colocitabine-provynuril, les deux produits sont rapidement absorbés et
métabolisés comme décrit ci-dessus.
Afin de voir l’effet de la nourriture sur l’absorption, une autre étude à été faite, ainsi
l'administration de l’association colocitabine-provynuril dans les 30 minutes suivant un repas
diminue le taux d'absorption des deux produits : la colocitabine et la provynuril, mais n'a que
peu d’effet sur l'AUC du 5'-DFUR, 5’DVUR et l'AUC du 5-FU et 5-VU. Les pics de
concentration plasmatique (Cmax en μg/ml) de la colocitabine, des 5'-DFCR, 5'-DFUR, 5-FU
et FBAL étaient respectivement de 4,67 ; 3,05 ; 12,1 ; 0,95 et 5,46. Le délai d'obtention des
pics de concentration plasmatique (Tmax en heures) était respectivement de 1,50 ; 2 ; 2 ; 2 et
3,34. Les valeurs de l'ASC 0-∞ étaient respectivement de 7,75 ; 7,24 ; 24,6 ; 2,03 et 36,3
μg.h/ml. (3, 19) Pour la provynuril, la 5’-DVCR, 5’-DVUR, 5-VU, les pics plasmatiques

11
étaient de 0,23 ; 0,14 ; 1,2 et 0,15 et les Tmax de 1,8 ; 2,1 ; 2,1 et 2. Pour l’association
colocitabine-provynuril le Tmax de la 5-FU été de 2 heures et le 5-VU est de 2,1 heures.

V.2 Distribution (AH)

Après administration orale chez le rat et le chien de la colocitabine, la provynuril et

l’association radiomarquées, le volume de distribution est de la colocitabine est de l’ordre de 2
l/kg alors que celui de la provynuril est de 1,8 l/kg quant à l’association le volume de
distribution de la colocitabine est de 2,3 l/kg alors celui de la provynuril est de 1,8 l/kg.
La distribution tissulaire de la 5-FU et la 5-VU après l’administration de l’association
colocitabine-provynuril à des doses de 500/30 mg/kg/j chez le rat à démonter qu’il ya une
distribution préférentielle dans le tissu colorectale tumoral comparativement avec les autres
tissus, ceci est dû à l’expression de la dThdPase en concentration plus élevée dans ces derniers
(Figure 1, tableau 2).

V.3 Métabolisme (AH)

La colocitabine chez le singe et le chien est fortement et rapidement métabolisée par la

carboxylestérase hépatique en 5'-DFCR qui est ensuite converti en 5'-DFUR par la cytidine

12
désaminase, principalement localisée dans le foie et les tissus tumoraux. L'activation
catalytique du 5'-DFUR se déroule ensuite sous l'action de la thymidine phosphorylase
(ThdPase). Les enzymes impliquées dans l'activation catalytique se trouvent dans les tissus
tumoraux, mais aussi dans les tissus sains, bien qu'habituellement à des taux moindres. En
revanche, la production de 5-FU chez les rongeurs a été rapide, mais moins importante en
raison des différences de distribution de l’enzyme générant le 5-FU, par rapport au singe et au
chien. En effet la biotransformation enzymatique séquentielle de la colocitabine en 5-FU
conduit à des concentrations plus élevées dans les cellules tumorales.
Le 5-FU est ensuite catabolisé par l’enzyme dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD) en
dihydro-5 fluorouracil (FUH2) beaucoup moins toxique. La dihydropyrimidinase clive le
noyau pyrimidine pour donner l’acide 5-fluorouréidopropionique (FUPA). Finalement la β-
uréidopropionase clive le FUPA en α-fluoro-β-alanine (FBAL) qui est éliminé dans l’urine.
L’activité de la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD) constitue l’étape limitante. Un
déficit en DPD peut conduire à une augmentation de la toxicité de la colocitabine.

V.4 Élimination (AH)

L’élimination de la colocitabine et la provynuril et leurs métabolites (5’-DFCR, 5’DFUR, 5FU,

5-FUH2, FUPA et FBAL, puis la 5 ‘DVCR, 5’DVUR, 5-VU se fait principalement par voie
urinaire. Les demi-vies d'élimination (t1/2 en heures) de la colocitabine, des 5'-DFCR, 5'-
DFUR, 5- FU et FBAL étaient respectivement de 0,85 ; 1,11 ; 0,66 ; 0,76 et 3,23. La
colocitabine et ses métabolites sont excrétés essentiellement dans les urines ; 95,5 % de la dose
administrée ont été retrouvés dans les urines. L’excrétion fécale est minimale (2,6 %). Le
métabolite principal éliminé dans les urines est le FBAL qui représente 57 % de la dose
administrée. Environ 3 % de la dose administrée sont excrétés sous forme inchangée dans les
urines. (1, 3)
Les demi-vies d’élimination de la provynuril, 5 ‘DVCR, 5’DVUR et 5-VU sont
respectivement de 1,1 ; 1,23 ; 0,76 et 3,6. La provynuril et ses métabolites sont principalement
excrétés (92%) par voie urinaire et 5,3 % par excrétion fécale.
Liaison aux protéines : (AH)
Les études in vitro avec du plasma humain ont montré que la colocitabine, les 5'-DFCR, 5'-
DFUR et 5-FU sont liés aux protéines, principalement à l'albumine, respectivement à 54%, 10
%, 62 % et 10 %. (9)

13
VI- Études de toxicité à doses croissantes (AH)

Le but de ces études est d’établir des doses qui serviront aux études antérieures à savoir : une
dose faible sans effets secondaire, une dose médiane efficace avec peu d’effets secondaires et
enfin une forte dose correspondante à la MTD (Maximum Tolerated Dose).
Chaque groupe d’animaux (rats et chiens) recevront une dose croissante en se basant sur la
réaction du groupe précédant et par la suite chaque groupe sera observé durant 14 jours après la
dernière dose reçue.
 La colocitabine :
Ordre des Doses en Rat Sprague-Dawley Chien Beagle
doses mg/kg/jour Mâle Femelle Mâle femelle
1ère 0 3 3 1 1
2ème 50 3 3 1 1
3ème 100 3 3 1 1
4ème 200 3 3 1 1
5ème 300 3 3 1 1
6ème 400 3 3 1 1
7ème 500 3 3 1 1
8ème 750 3 3 1 1
9ème 1000 3 3 - -
10ème 1500 3 3 - -
Suite à cette étude, on a déduit que la MTD de la colocitabine chez le rat été de 1500 mg/kg et
chez le chien de 750 mg/kg.
 La Provynuril :
Ordre des Doses en Rat Sprague-Dawley Chien Beagle
doses mg/kg/jour Mâle Femelle Mâle femelle
1ère 0 3 3 1 1
2ème 1 3 3 1 1
3ème 5 3 3 1 1
4ème 10 3 3 1 1
5ème 20 3 3 1 1
6ème 40 3 3 1 1
7ème 80 3 3 1 1
8ème 120 3 3 1 1
9ème 200 3 3 - -
10ème 400 3 3 - -
La MTD pour la Provynuril à été de l’ordre de 400 mg/ kg chez le rat et 120 mg/kg chez le
chien.
 L’association colocitabine-provynuril :
Ordre des Doses en Rat Sprague-Dawley Chien Beagle
doses mg/kg/jour Mâle Femelle Mâle femelle
1ère 0/0 3 3 1 1
2ème 10/0,5 3 3 1 1

14
 3ème 25/1,5 3 3 1 1
4ème 50/3 3 3 1 1
5ème 80/5 3 3 1 1
6ème 110/7,5 3 3 1 1
7ème 150/15 3 3 1 1
8ème 300/25 3 3 - -
9ème 500/50 3 3 - -
10ème 500/50 3 3 - -
Pour l’association, la MTD est de 500/50 mg/kg chez le rat, et de 150/15 mg/kg chez le chien.

VII- Études de toxicité à dose unique (AH)

Le but de cette étude est d’évaluer la toxicité aigue de la colocitabine, la Provynuril, ainsi que
celle de l’association colocitabine-provynuril, et pour ce faire, on a utilisé deux espèces :
rongeur et non-rongeur (le rat Sprague-Dawley et le chien Beagle) et la même voie
d’administration prévu pour les études cliniques (Voie orale) tel que décrit dans le guide de
ICH : S4 (Single Dose Toxicity Tests). Chaque groupe à été randomisé à une dose contrôle et 3
doses (faible, moyenne, forte) et selon l’espèce.
• Pour la colocitabine, (voir tableau : 10) les animaux ont été observés durant les
14 jours suivant l'administration orale. On a noté deux décès dans les groupes des deux
sexes des rats à fortes doses (2000mg/kg). De même chez le chien à fortes doses
(900mg/kg), on a eu deux décès chez les deux sexes. À faibles doses chez les deux
espèces on a noté les symptômes suivants : vomissements, salivation et la diarrhée ce
qui correspond aux symptômes fréquents des anticancéreux antipyrimidiques
administrés par voie orale et qui sont doses dépendante.
Chez les deux espèces, aucune modification de l’ECG n’a été observée, par contre on a
noté de l’anorexie, de l’asthénie et de la fatigue.
• Pour la Provynuril (voir tableau : 10) et à très forte dose, on a
noté un décès chez le chien par contre pas de décès chez le rat. Pour les autres doses on
a noté des signes cliniques transitoires incluant la diminution de l'activité motrice
spontanée, une diminution de rythme respiratoire, l’anorexie.
 L’association colocitabine-provynuril : (voir Tableau :
11)
Pour l’association colocitabine-provynuril, on a noté deux décès dans chacun des deux espèces
groupes à fortes doses (600/60 mg/kg chez le rat) (200/20 mg/kg chez le chien). À faibles
doses et chez les deux espèces on a noté les symptômes suivants : vomissements, salivation et

15
la diarrhée ce qui correspond aux symptômes fréquents des anticancéreux antipyrimidiques
administrés par voie orale, aussi une diminution de l’activité motrice, l’anorexie et la fatigue et
qui s’accentuent avec la dose.
Chez les deux espèces, aucune modification de l’ECG n’a été observée.

VIII- Études de toxicité à doses répétées (toxicité

chronique): (AH)

Les études de toxicité à doses répétées permettent d’évaluer la toxicité de la colocitabine, la

provynuril, ainsi que de l’association colocitabine-provynuril à long terme. Chez le rat et le
chien, les drogues ont étés administrées par voie orale (gavage) et ce pour une durée de 4 à 78
semaines (ICH S4A). Un nombre égale de mâles et de femelles pour chacun des espèces à été
utilisé (13, 14). Chaque groupe à été randomisé à des doses répétées : contrôle, faible, médiane
et forte.
 Colocitabine : (voir tableau : 12)
Pour l’exposition de 1 et 3 mois à la colocitabine ont été comparable pour les 2 sexes et chez
les deux espèces. On a noté un cas de décès chez le chien et deux chez le rat pour l’exposition
de 3 mois et à fortes doses, par contre il n’avait pas de décès pour l’exposition de 1 mois.
Ainsi pour des fortes doses on a noté des diarrhées, vomissements, diminution de la motricité,
asthénie. Ces symptômes se sont accentués par la suite en donnant des déshydratations et des
pertes de poids (dû au vomissement et au diarrhée) chez 8 rats sur 60 et 5 chiens sur les 40 des
deux sexes.
Pour le traitement de 6 et 12 mois, on a noté les mêmes symptômes que précédemment mais
qui se sont accentuées encore plus vers la dixième au 12ème mois. Le nombre de décès à été de
4 rats sur 100 et un chien sur les 70.
Pour l’exposition de 18 mois, la diarrhée à été généralisé chez les deux espèces et les deux
sexes, ainsi les pertes de poids et les déshydratations se sont accentuées ; on a noté aussi une
diminution accentuée de la motricité vers le 15 mois jusqu’à la fin du traitement.
L’examen histopathologique à montrer une légère anémie, neutropénie, une augmentation de
l’urée sanguine, une légère augmentation de la taille de la rate et celle du thymus. Ces effets
ont été observés surtout avec de longues durées d’exposition et étés réversibles et dose
dépendant.
 Provynuril : (voir tableau : 13)

16
De même que la colocitabine, l’exposition par la voie orale de l’inhibiteur à été comparable
pour les 2 sexes et chez les deux espèces et proportionnelle à la dose. Par contre on n’a pas
noté de décès durant l’exposition à la provynuril. Les signes cliniques pour des fortes doses
étés, une diminution du rythme respiratoire et de l’activité motrice, fatigue et l’anorexie.
L’examen histopathologique à montrer une légère anémie, une augmentation de l’urée
sanguine. Cet effet été observé surtout avec des longues durées d’exposition et à été dose
dépendant.
 L’association : Colocitabine-Provynuril : (voir tableau : 14)
Pour l’exposition de 1 et 3 mois à l’association colocitabine-provynuril ont été comparable
pour les 2 sexes et chez les deux espèces. On a noté un cas de décès chez le rat femelle mais
pas chez le chien. Pour les signes cliniques à des fortes doses on a noté des diarrhées,
vomissements, diminution de la motricité, asthénie et des érythèmes au niveau des pates mais
moins accentuées que chez le groupe qui a pris la colocitabine.
Pour le traitement de 6 et 12 mois, on a noté les mêmes symptômes que précédemment mais
qui se sont un peu plus accentuées encore plus vers le 12ème mois.
Pour l’exposition de 18 mois, la diarrhée à été noté chez la majorité des animaux chez les deux
espèces et les deux sexes, aussi des pertes de poids, la diminution de la motricité mais toujours
moins accentuées que chez le groupe exposé à la colocitabine seule.
L’examen histopathologique à montrer une légère anémie, une légère augmentation de la taille
de la rate et celle du thymus qui sont moins important qu’avec la colocitabine seule par contre
l’augmentation de l’urée sanguine été plus importante. Ces changements ont été observés
surtout avec de longues durées d’exposition et été dose dépendant (21).
 À fin d’évaluer la toxicité de cette augmentation d’urée, on a procédé à une
exposition des rats avec de fortes doses d’urée, mais aucune toxicité n’a été révélée.
 D’autres tests ont été effectués pour évaluer l’excès de l’inhibiteur qui reste en
circulation, ainsi de rats sains ont étés exposés à de très fortes doses de l’inhibiteur
seule ont présentés un profil de toxicité semblable que celui décrit en haut, à
savoir : Signes cliniques transitoires incluant la diminution de l'activité motrice
spontanée, une diminution de rythme respiratoire, l’anorexie, et la fatigue.

IX- Conversion chez l’Homme (HED) : (AH)

17
Pour le calcul de la HED, on procède en deux étapes et ceux pour la colocitabine, la provynuril
puis l’association :
En première étape, on va calculer la HED en mg/ kg/ jour à partir de la NOAEL,
En deuxième étape, on va convertir la HED en mg/kg/jour en HED en mg/ m²/ jour,
Conclusion : (voir tableau : 16)
L’animal ne sera jamais l’humain (22), mais vu que le chien présente le profil
pharmacocinétique le plus comparable avec l’être humain (Le modèle animal reproduisant de
façon la plus fidèle le métabolisme humain(22)), ainsi en se référant aux résultats d’innocuité,
son NOAEL (chien) à été retenue pour le calcul de la HED (dose initiale) (15, 22).
On propose comme doses pour une première administration chez l’humain (MRSD) :
La Colocitabine : 200 mg/m²/j
La Provynuril : 5 mg/m²/j
L’association colocitabine-provynuril : 50 / 3mg/m²/j.

X- Génotoxicité : (AH)

Le but de ces études est de permettre d’évaluer le potentiel de la colocitabine et de la

provynuril à induire des mutations génétiques, des altérations et des dommages au niveau de la
structure chromosomale (ICH S2A, S2B).
Une batterie standard de tests (3 tests in vitro et 1 essai in vivo) a été faite pour enquêter sur le
potentiel génotoxique pour chacune des molécules à savoir : la colocitabine, la provynuril et
enfin l’association et avec des doses ascendantes. Ainsi les tests de génotoxicité in vitro sont
effectués avant d’entamer la phase clinique I et les tests in vivo avant d’entamer la phase II
(14, 22)
• La colocitabine n'était pas mutagène in vitro pour les bactéries (test d'Ames) ni
sur les cellules de mammifères (Chinese hamster V79/HPRT gene mutation assay) ni
sur les lymphocytes TK de souris. Toutefois, comme d'autres analogues nucléosidiques
(c'est-à-dire, 5-FU), la colocitabine a été clastogène dans les lymphocytes humains (in
vitro). Les risques associés à l'exposition à la colocitabine dépendent largement de la
conversion enzymatique en 5-FU. La première étape consiste à la carboxylestérase, qui
est préférentiellement exprimé dans le foie humain. La dernière étape, c'est-à-dire
ThdPase, qui génère 5-FU est généralement surexprimé dans les tissus tumoraux par
rapport aux cellules humaines normales. Elle est donc supposée que le risque

18
 génotoxique dans les cellules humaines normales après une exposition à la colocitabine
est significativement plus faible par rapport à l'exposition directe à la 5-FU.
• La provynuril est de même que la colocitabine n’était pas mutagène in vitro
pour les bactéries (test d’Ames) ni pour les cellules de mammifères. En plus sa
conversion en 5-VU se fait principalement dans les tissus tumoraux, vu la surexpression
de la ThdPase dans ces derniers par rapport aux cellules normales.
• L’association colocitabine-provynuril n’est pas mutagène in vitro sur les
bactéries ni sur les cellules de mammifères par contre elle a été clastogène dans les
lymphocytes humains (in vitro), effet fort probablement dû à la 5-FU généré à partir de
la colocitabine. Il est supposé que le risque génotoxique dans les cellules humaines
normales après une exposition à l’association est significativement plus faible par
rapport à l'exposition directe à la 5-FU (conversion principalement dans les cellules
tumorales) (19).
De même pour les tests in vivo des micronoyaux des érythrocytes des mammifères à
démontrer que ni la colocitabine, ni le provynuril, ni l’association n’induit des aberrations
chromosomiques à différentes doses (19).

XI- Cancérogénicité : (AH)

Afin d’évaluer le pouvoir d’induction de tumeurs lors d’administration de la colocitabine, la

provynuril ainsi que de l’association, des études de deux ans de cancérogénicité ont été
effectuées chez la souris (groupe de 50/sexe recevant la dose) (ICH S1) (14, 22). La
colocitabine à été donnée quotidiennement par voie orale à des doses de : 0 (contrôle-1), 0
(Control-2), 30, 60 ou 90 mg / kg / jour en mélange avec la nourriture. L'étude n'a révélée
aucune preuve d'un potentiel cancérogénique de la colocitabine. Chez les souris mâles,
l'incidence des adénomes bronchéo-alvéolaires et chez les souris femelles, l'incidence des
sarcomes histiocytaires ont diminués de manière statistiquement significativement à un niveau
de dose de 90 mg / kg / jour. Ces résultats sont susceptibles d'être liées à l'activité
pharmacodynamique de la colocitabine (19).
Pour la provynuril, à été administré à des doses quotidiennes chez la souris de l’ordre de : 0
(contrôle-1), 0 (contrôle-2), 5, 10, 15mg / kg / jour en mélange avec la nourriture. L’étude n’a
révélée aucune preuve d’un potentiel cancérogénique.

19
Pour l’association, à des doses combinées (colocitabine/provynuril) de : 0/0 (contrôle-1), 0/0
(contrôle-2), 30/5, 60/10, 90/15 mg / kg / jour en mélange avec la nourriture, aucune preuve
d’un potentiel cancérogénique de l’association n’a été révélée. On a noté que chez les souris
mâles, l’incidence des adénomes bronchéo-alvéolaires et chez les souris femelles, l'incidence
des sarcomes histiocytaires ont diminués de manière statistiquement significativement à un
niveau de dose de 90/15 mg / kg / jour. Ces résultats sont susceptibles d'être liées à l'activité
pharmacodynamique de la colocitabine (19). (tableau17)

XII- Études d’innocuité pharmacologique : (EG)

L’innocuité pharmacologique évalue, identifie et détermine le mécanisme d’action de tout

effet indésirable d’une nouvelle entité moléculaire à l’étude pour utilisation éventuelle en
clinique. Ainsi les objectifs des études pharmacologiques d'innocuité sont les suivants : 1)
déterminer les propriétés pharmacodynamiques indésirables d'une substance qui pourraient
affecter l'innocuité de cette dernière chez les sujets humains; 2) évaluer les effets
pharmacodynamiques et/ou physiopathologiques indésirables d'une substance observés dans
les études toxicologiques et/ou cliniques; et 3) étudier le mécanisme des effets
pharmacodynamiques indésirables observés et/ou soupçonnés. Le plan expérimental permettant
d'atteindre ces objectifs devrait être clairement défini et précisé.

Les études cardiovasculaires : (EG)

Il faut choisir, avec justifications à l'appui, les systèmes de test in vivo et les espèces qui
conviennent le mieux. Pour cela, le choix de l’espèce s’est arrêté sur : Le chien pour sa
sensibilité cardiovasculaire et son rapprochement chez l’humain.
 Condition :
• Dose : Voir les tableaux 18, 19, 20 en annexe 1.
• Voie d’administration : In vivo : par gavage orale une seule fois chez chaque cochon et
les observations faites pendant 24 heures.
• 4 groupes de chien de 2 mâles et 2 femelles (3 groupes traités + 1 contrôle)

 Cas de la colocitabine :

D’après des études la Colocitabine du tableau 1 pourrait être cardiotoxique chez le chien car
chez cet animal, une dose unique = 750 mg a provoqué des réactions cardiovasculaires comme

20
une élévation de la tension artérielle, hypotension chez trois chiens. Compte tenu des données
non cliniques et des similitudes qu’on peut observer entre le chien et l’humain sur le plan de la
biotransformation et de l’exposition médicamenteuse, il y a lieu de s’inquiéter de l’innocuité de
la colocitabine lorsqu’elle est administrée aux patients à des doses élevées. On doit envisager la
possibilité qu’une surdose de Colocitabine causera un dysfonctionnement cardiaque susceptible
d’entraîner la mort du patient.
 Cas du Provynuril

Avec le provynuril, les résultats de l’étude du tableau 2 sur le système cardiovasculaire

indiquent qu’il n’y a aucun risque de toxicité cardiaque chez le chien pour toutes les catégories
de doses. On a également constaté qu’aucune donnée n’a été obtenue sur le risque de
repolarisation ventriculaire retardée chez les deux espèces étudiées.

 Cas de la Colocitabine + provynuril

Les résultats obtenus pour les groupes 1 et 2 ne sont pas statistiquement significativement
différents de ceux du groupe de contrôle 0. Par contre le groupe trois a donné :

-Pression artérielle : 90± 9 - 60± 5 mm. Hg (hypotension)

-Fréquence cardiaque : 53-145 bat/min

-Électrocardiogramme (ECG) : On a observé une tension artérielle chez un chien, mais pas de
troubles de repolarisation avec allongement du QT, et pas de torsade de pointe. Le produit est
néanmoins légèrement cardiotoxique. Tous ces effets anormaux sont totalement réversibles
après 36 heures.

 Les études du système respiratoire : (EG)

 Condition :

• Dose : Voir les tableaux 21, 22, 23 en annexe 2.

• 4 groupes de rats de 5 mâles et 5 femelles chacun ont été étudiés. (3 groupes traités + 1
Contrôle).

• Le dosage a été fait par gavage oral une seule fois par rat.
• Observations mesurables : fréquence respiratoire, volume respiratoire, saturation de
l’Oxygène

 Cas de colocitabine
Les résultats obtenus des groupes 1 et 2 sont similaires à ceux du groupe de contrôle 0. Pour le
groupe 3 les résultats sont les suivants :

21
Saturation en O2 de l’Hb : 95± 2 %
Fréquence respiratoire : 66± 6 mouvement thorax/min
Volume respiratoire :10,7 ± 0,6 mL·kg-1
Ventilation : 1,4 ± 0,08, L·kg-1·min-1)
Chez le groupe 3 on a donc observé une légère difficulté de respiration.
 Cas du provynuril (voir tableau 24, Annexe 2)

 Cas de la Colocitabine + provynuril (voir tableau 25, Annexe 2)

Chez les groupes 2 et 3, on remarque une légère difficulté de respiration chez quelques rats tel
qu’observé dans le groupe 3 lorsque la colocitabine est administré seule.
 Les études de système nerveux central : (EG)
Condition :

• Le design de cette étude d’innocuité pharmacologique du système nerveux central chez

le rat (annexe3) est identique à celui du système respiratoire quant au nombre de
groupes, aux doses et à la façon dont elles sont administrées.

• Par contre, l’évaluation se fait à l’aide d’une batterie d’observations fonctionnelles

(BOF), test (modifié) d’Irwin et de tests non invasifs.

• Observations fonctionnelles : coordination, température, modification du

comportement, EEG, réaction réflexe sensorimotrices, réactions réflexes autonomes,
convulsions

 Cas de colocitabine
Le groupe 1 et 2 ne présentent aucun changements significatifs par rapport au groupe de
contrôle 0.

Pour le groupe 3, on a observé une diminution des réactions réflexes sensori-motrice et

autonome, perte d’équilibre, incoordination des mouvements, un léger étourdissement chez
quelques rats. Tous ces effets anormaux observés sont réversibles chez le rat.

 Cas du provynuril
Le groupe 1, 2, 3 ne présentent aucun changements significatifs par rapport au groupe de
contrôle 0 lors du gavage avec le provynuril.

 Cas de Colocitabine + provynuril

22
Les études de neurotoxicité in vivo chez le rat lors du traitement avec l’association ont montré
une diminution des effets observés lors du traitement avec la colocitabine seule. Cependant, on
a observé un étourdissement chez un seul rat.

XIII- Études de tolérance locale (EG)

Nos produits sont prévus pour une administration orale chez l’humain, les études de tolérance
locale seront portées sur le tractus gastro-intestinal. Lors de nos études de toxicologie pré
clinique et en particulier lors des études de toxicité aiguë et subaiguë, pour chaque rat et chien
qui a été sacrifié, l’attention a été portée aussi sur l’état de l’œsophage, du duodénum, de
l’estomac et des intestins.

Les Études du système gastro-intestinal : (EG)

Lors des études de toxicité aiguë et subaiguë, pour chaque rat et chien qui a été sacrifié,
l’attention a été portée aussi sur l’état de l’œsophage, du duodénum, de l’estomac et des
intestins.

 Condition :
• Dose : Voir les tableaux 26, 27, 28 en annexe 4.
• 4 groupes de rats de 5 mâles et 5 femelles chacun ont été étudiés. (3 groupes traités + 1
Contrôle).

• Le dosage a été fait par gavage oral une seule fois par rat.

• Observations mesurables : contraction iléale, mesure des sécrétions gastriques, mesures

des sécrétions biliaires, pH gastrique.

Cas de colocitabine
À différentes doses et même pour le contrôle, une irritation locale a été observée au niveau de
la gorge. Ceci est certainement le fait du matériel utilisé pour le gavage. À la dose 1500
mg/kg/j une fois par jour, on a observé une irritation des intestins et une diarrhée chez le rat.
Parallèlement, on a constaté une inflammation au niveau de l’œsophage. On a constaté un
vomissement et une diarrhée chez le groupe 3

Cas du provynuril

23
Lors des études, aucun fait n’a été signalé en dehors d’une irritation locale observée au niveau
de la gorge.
Cas du Colocitabine + provynuril
Les études avec le traitement de l’association ont montré une légère irritation au niveau des
intestins. On a également constaté un vomissement et une diarrhée chez le groupe 3 à des doses
de 500/50 mg/kg/j une fois par jour.

XIV- Études de reproduction (EG)

Lors de l’étude sur la reproduction, on vérifiera si la prise du produit n’a pas des effets sur la
fertilité des animaux, sur l’ovulation et sur la qualité des spermatozoïdes ?
Après administration du produit testé au mâle et/ou à la femelle, les modifications de l'activité
sexuelle peuvent être décelées en étudiant le déroulement et la fréquence des accouplements et
la modification de la fertilité en comptant la fréquence des gestations. Une étude des
spermatozoïdes peut également être entreprise.
 Fertilité :
 Condition :
• Dose : Voir les tableaux 29, 30, 31 en annexe 5.
• 4 groupes de rats de 5 mâles et 5 femelles chacun ont été étudiés. (3 groupes traités + 1
Contrôle).

• Le dosage a été fait par gavage oral une seule fois par rat.

 Cas de colocitabine
Lors de l’accouplement pendant 28 jours de traitement, on a remarqué une incapacité pour le
rat mâle de fertiliser les partenaires femelles non soignés. Cette incapacité serait due à la
diminution du nombre de spermatozoïde lors du traitement avec 1500 mg/kg/jours
Avec la même dose de colocitabine chez les femelles, nous avons constaté après analyse un
désordre dans le cycle d’ovulation. Cet effet était réversible lors de l’accouplement des
femelles au quatorzième jour du retrait du médicament.
 Cas du provynuril
L’administration du provynuril à de doses variées n’a eu aucun effet sur la fertilité des
animaux, sur l’ovulation et sur la qualité des spermatozoïdes après 28 jours d’étude.
 Cas du Colocitabine + Provynuril

24
L’association Colocitabine + provynuril a montré les mêmes effets obtenus dans le cas de
colocitabine seul, à savoir une incapacité pour le mâle à fertiliser les femelles et un désordre
dans le cycle ovarien lors du traitement.
 Développement embryonnaire :
 Condition :
• Dose : Voir les tableaux 32, 33, 34 en annexe 5.
• 4 groupes de rats de 5 mâles et 5 femelles chacun ont été étudiés. (3 groupes traités + 1
Contrôle).

• Le dosage a été fait par gavage oral une seule fois par rat.

Dans cette étude on examinera les effets que l’administration du médicament à un animal
gravide produit sur un organisme en développement (fœtus ou embryon).
 Cas de colocitabine
Lors de l’étude sur les rats femelles portant un embryon, on a donné tous les jours des doses
orales de colocitabine pour les jours de gestation 6 – 15. Les femelles ont été tuées le jour de
gestation 17. Après analyse, nous avons constaté que la cause de la mort n’était pas
attribuable à la prise du médicament car aucune toxicité concernant le médicament n'a été
observée cliniquement dans les conclusions d'autopsie. Cependant, la diminution de poids de
corps de fœtus, la diminution du nombre les fœtus vivants et la teratogenicité a été observée à
la dose de 1500mg/kg/jours.
 Cas du provynuril
L’administration du provynuril à de doses variées n’a eu aucun effet sur le développement
fœtal chez les souris femelles pour les jours de gestation 6-15. Il n’y a aucun cas de décès
constaté après des longues périodes de gestation.
 Cas du Proracilex®
Lors des études avec l’association, on n’a constaté aucun cas de mort pour le jour de gestation
17. Cependant, la diminution de poids de corps de fœtus, la diminution du nombre les fœtus
vivants et la teratogenicité ont été observée à la même dose observée dans le cas de
colocitabine seul.
 Développement périnatal
Les accidents de périnatalité sont des troubles qui surviennent chez le nouveau-né dans la
majorité des cas à la suite de la prise d'un médicament par la mère peu avant l'accouchement et
de sa diffusion à travers le placenta.

25
  Condition :
• Dose : Voir les tableaux 35, 36, 37 en annexe 6.
• Voie d’administration : In vivo : par gavage orale une seule fois chez chaque cochon et
les observations faites pendant 24 heures.
• 4 groupes de chien de 2 mâles et 2 femelles (3 groupes traités + 1 contrôle)
 Cas de Colocitabine
Aucun effet pertinent sur le développement post-natal ou la fonction n'a été identifié dans
l'étude de peripostnatal avec les doses jusqu'à 750 mg/kg/jour. Néanmoins, un chiot a
développé hydrocéphalie provoquant une dilatation des ventricules cérébraux, une
augmentation du volume du crâne
 Cas du provynuril
L’administration du provynuril à de doses variées n’a eu aucun effet sur le développement
post-natal ou la fonction.
 Cas du Proracilex®
Comme dans le cas de la colocitabine, aucun effet sur le développement post-natal ou la
fonction n’a été identifié. Toute fois, le phénomène d’hydrocéphalie n’a pas été observé sur un
animal.

26
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22- François Xavier Lacasse, Automne 2007, cours PHM6156E Le développement
préclinique.
23- http://en.wikipedia.org/wiki/Laboratory_rat
24- Lignes Directrices BPL : http : //www. hc-sc.gc.ca
25- Lamouche, Stéphane Ph.D. PHM 6156E : Atelier thématique toxicologie, notes de
cours, Automne 2007
26- Lignes Directrices ICH : http : / www. Ich.org / S7A et S7B
27- Guidance for industries and Reviewers, Estimating the Safe Starting Dose in Clinical
Trials for therapeutics in Adults Healthy Volunteers,
http://www.fda.gov/cber/gdlns/dose.pdf, p7

ICH:

28
S1A: Guideline on the Need for Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals
S1B: Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals
S1C: Dose Selection for Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals
S1C: (R) Addendum to Dose Selection for Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals Addition of
a Limit Dose and Related Notes
S2A: Guidance on Specific Aspects of Regulatory Tests for Pharmaceuticals
S2B: Genotoxicity: A Standard Battery for Genotoxicity Testing for Pharmaceuticals
S3A: Note for Guidance on Toxicokinetics: the Assessment of Systemic Exposure in Toxicity
Studies
S3B: Pharmacokinetics: Guidance for Repeated Dose Tissue Distribution Studies
S4: Single Dose Toxicity Tests
S4A: Duration of Chronic Toxicity Testing in Animals (Rodent and Non-Rodent Toxicity Testing)
S5A (R2): Detection of Toxicity to Reproduction for Medicinal Products & Toxicity to male
fertility.
S7A: Safety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals
S7B: The Non-Clinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT
Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals
S8: Immunotoxicology Studies for Human Pharmaceuticals
M3 (R1): Non-Clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials for
Pharmaceuticals

Annexes

29
30
Preuve de concept (AH) : Action antiprolifératrice de la colocitabine, Inhibition de la DPD
par la provynuril, Augmentation de l’activité antiprolifératrice de la colocitabine suite à
l’addition de la provynuril.
Lignées de cellules cancéreuses : LXFL529, MX-1, HT-3, Capan-1, NCI-H441, NCI-H460,
A549, PC-3, HCT116, SW480, COLO201, LXFL529, MX-1, HCT116-DPD et HCT116-pRC
qui expriment une grande activité de DPD (études in vitro).
Études in vivo : Tableau 3
Espèce Poids Âge
Rats Sprague- Mâles Femelles Mâles Femelles
250-300 g - 10 à 12 semaines -
Dawley S-D

Études pharmacocinétiques (AH) : (ADME) Tableau 4

Espèce Poids Âge
Mâles Femelles Mâles Femelles
Souris CD-1 35-45 g 35-40 g 40-45 jours 35-40 jours
Rats S-D 200-250 g 200-240 g 7 -8 semaines 6-7 semaines
Rats SD juvéniles 135-175 g 130-160 g 3-4 semaines 3-4 semaines
Chien Beagle 8,5-9 kg 7,5- 8 kg 9-11 mois 9-11 mois
Singe Rhésus 17-20 kg 16-18 kg 2 ans 2 ans

o Les paramètres pharmacocinétiques de Colocitabine chez les espèces animales

testées : Tableau 5
Espèces animales Dose mg/kg C max µg/ml T max (h) AUC µg.h/ml
Rats par VO 500 68 ± 3,6 1,35 1420 ± 206
Rats par IV 120 1025 ± 38 -- 1712 ± 186
Chien VO 400 54 ± 4,5 1,56 3 017 ± 108
Chien IV 80 789 ± 27 -- 2945 ± 96
Singe VO 450 42 ± 4,3 2,31 2813 ± 157
Singe IV 60 645 ± 52 -- 2645 ± 236

o Les paramètres pharmacocinétiques de la provynuril chez les espèces testées :

Tableau 6
Espèces animales Dose mg/kg C max ng/ml T max (h) AUC ng.h/ml
Rats par VO 50 16,3 ± 0.6 1,07 14,8 ± 0.6
Rats par IV 25 21.5 ± 0.64 -- 17,6 ± 0.8
Chien VO 40 40,2 ± 0.8 1,83 49,9 ± 0.9
Chien IV 18 48,5 ± 0.35 -- 69.2 ± 0.8
Singe VO 45 23,2 ± 0.7 1.99 28,7 ± 0.7

31
 Singe IV 20 26,8 ± 0.67 -- 23,2 ± 0.6

o Les paramètres pharmacocinétiques de l’association : Colocitabine + Provynuril

chez les espèces animales testées : Tableau 7
Espèces animales Dose mg/kg C max µg/ml T max (h) AUC µg.h/ml
Rats par VO 125/10 25 ± 3,8 1,42 530/2,8 ± 21/0,2
Rats par IV 45/7 137 ± 15,6 -- 620/4,2 ± 32/0,5
Chien VO 100/9 8,9 ± 2,7 1,55 745/2,5 ± 38/0,3
Chien IV 30/4 128 ± 12,3 -- 803/3,1 ± 45/0,4
Singe VO 130/12 21 ± 3,8 2,42 793/3,0 ± 41/0,3
Singe IV 35/5 141 ± 14,5 -- 726/3,4 ± 36/0,5

Études de toxicité (AH) :

Toxicité à doses croissantes : Tableau 8
Espèce Poids Âge
Mâles Femelles Mâles Femelles
Rats S-D 280-320 g 260-300 g 8-10 semaines 7-10 semaines
Chien Beagle 9-10 kg 8,5-9,5 kg 12 mois 12 mois

Toxicité à dose unique : Tableau 9

Espèce Poids Âge
Mâles Femelles Mâles Femelles
Souris CD-1 45-50 g 38-42 g 40-45 jours 36-40 jours
Rats S-D 250-280 g 2 8-10 semaines 7-9 semaines
40-270 g
Chien Beagle 8-9 kg 7,5-9 kg 10 mois 10 mois

 Colocitabine et provynuril séparément : Tableau 10

Espèce Drogue Voie Dose Nombre Durée
(mg/kg) d’animaux
Rat Sprague- Colocitabine Orale 0 5 mâles 1 journée
Dawley 800 5 femelles
1200
2000
Rat Sprague- Provynuril Orale 0 5 mâles 1 journée
Dawley 150 5 femelles
300
500
Chien Beagle Colocitabine Orale 0 3 mâles 1 journée
300 3 femelles
600
900
Chien Beagle Provynuril Orale 0 3 mâles 1 journée
20 3 femelles
100
150

32
  L’association : colocitabine + provynuril : Tableau 11
Espèce Voie Dose Nombre d’animaux Durée
colocitabine/provynuril
(mg/kg)
Rat Sprague-Dawley Orale 0/0 5 mâles 1 journée
350/35 5 femelles
450/45
600/60
Chien Beagle Orale 0/0 3 mâles 1 journée
80/8 3 femelles
125/12,5
200/20

Toxicité à doses répétées : Tableau 12

Espèce Poids Âge
Mâles Femelles Mâles Femelles
Souris CD-1 40-45 g 38-42 g 40-45 jours 35-40 jours
(Pour les études de 1 et 3 mois)
Rats S-D (pour les études de 1, 225-300 g 220-280 g 7-10 6,5-9 semaines
3, 6, et 12 mois) semaines
Chien Beagle (pour les études 8,5-13 kg 8-12 kg 10-14 mois 9-13 mois
de 1, 3, 6, 12 et 18 mois)

 Colocitabine : Tableau 13
Espèce Voie Dose (mg/ kg / jour) Nombre d’animaux Durée
Rats Sprague- Orale (gavage) 0 15 mâles 1 mois
Dawley S-D 300 15 femelles
700
1000
Chien beagle Orale (gavage) 0 10 mâles 1 mois
150 10 femelles
300
500
Rats Sprague- Orale (gavage) 0 15 mâles 3 mois
Dawley S-D 300 15 femelles
600
900
Chien beagle Orale (gavage) 0 10 mâles 3 mois
150 10 femelles
300
500
Rats Sprague- Orale (gavage) 0 20 mâles 6 mois
Dawley S-D 300 20 femelles
600
800
Chien beagle Orale (gavage) 0 15 mâles 6 mois

33
 120 15 femelles
200
400
Rats Sprague- Orale (gavage) 0 30 mâles 12 mois
Dawley S-D 300 30 femelles
500
750
Chien beagle Orale (gavage) 0 20 mâles 12 mois
120 20 femelles
180
350
Chien beagle Orale (gavage) 0 30 mâles 18 mois
120 30 femelles
150
300

 Provynuril : Tableau 14
Espèce Voie Dose (mg/ kg / jour) Nombre d’animaux Durée
Rats Sprague- Orale (gavage) 0 15 mâles 1 mois
Dawley S-D 75 15 femelles
150
250
Chien beagle Orale (gavage) 0 10 mâles 1 mois
20 10 femelles
40
75
Rats Sprague- Orale (gavage) 0 15 mâles 3 mois
Dawley S-D 75 15 femelles
150
250
Chien beagle Orale (gavage) 0 10 mâles 3 mois
20 10 femelles
40
75
Rats Sprague- Orale (gavage) 0 20 mâles 6 mois
Dawley S-D 65 20 femelles
130
200
Chien beagle Orale (gavage) 0 15 mâles 6 mois
15 15 femelles
40
65
Rats Sprague- Orale (gavage) 0 30 mâles 12 mois
Dawley S-D 50 30 femelles
100
175
Chien beagle Orale (gavage) 0 20 mâles 12 mois
15 20 femelles
35
50
Chien beagle Orale (gavage) 0 30 mâles 18 mois
10 30 femelles
30
50

 L’association : Colocitabine-Provynuril : Tableau 15

34
 Espèce Voie Dose (mg/ kg / jour) Nombre d’animaux Durée
Rats Sprague- Orale (gavage) 0/0 15 mâles 1 mois
Dawley S-D 180/20 15 femelles
250/30
400/40
Chien beagle Orale (gavage) 0/0 10 mâles 1 mois
50/7,5 10 femelles
100/10
120/12
Rats Sprague- Orale (gavage) 0/0 15 mâles 3 mois
Dawley S-D 180/15 15 femelles
250/25
400/35
Chien beagle Orale (gavage) 0/0 10 mâles 3 mois
40/7,5 10 femelles
80/9
100/11
Rats Sprague- Orale (gavage) 0/0 20 mâles 6 mois
Dawley S-D 150/15 20 femelles
200/20
350/30
Chien beagle Orale (gavage) 0/0 15 mâles 6 mois
40/5 15 femelles
70/8
80/10
Rats Sprague- Orale (gavage) 0/0 30 mâles 12 mois
Dawley S-D 150/10 30 femelles
180/18
300/25
Chien beagle Orale (gavage) 0/0 20 mâles 12 mois
40/4 20 femelles
50/6
75/8
Chien beagle Orale (gavage) 0/0 30 mâles 18 mois
35/3 30 femelles
40/5
65/7,5

i. Conversion chez l’Homme (HED) : Tableau 16

Colocitabine
Chien : 100 mg/kg/j
Rat : 500 mg/kg/j
Provynuril
Chien : 2,5 mg/kg/j
Rat : 10 mg/kg/j
Colocitabine + Provynuril
Conversion chez l’Homme (HED)
Calcul en mg/kg/j Calcul en mg/m2/j
(Facteur de sécurité de 1/10) (x 37)
100 mg/kg/j x 0,541 = 54,1 mg/kg/j 5,41 mg/kg/j x 37 = 200,17 (200)
54,1 mg/kg/j ÷ 10 = 5,41 mg/kg/j 2
mg/m /j
500 mg/kg/j x 0,162 = 81,00 mg/kg/j 8,1 mg/kg/j x 37 = 299,70 mg/m2/j
81,00 mg/kg/j ÷ 10 = 8,1 mg/kg/j
2,5 mg/kg/j x 0,541 = 1,35 mg/kg/j 0,135 mg/kg/j x 37 = 5 mg/m2/j
1,35 mg/kg/j ÷ 10 = 0,135 mg/kg/j
10 mg/kg/j x 0,162 = 1,62 mg/kg/j 0,162 mg/kg/j x 37 = 5,99 mg/m2/j
1,62 mg/kg/j ÷ 10 = 0,162 mg/kg/j

35
Chien : 25 mg/kg/j + 1,5 25/1,50 mg/kg/j x 0,541 = 1,353/0,081 mg/kg/j x 37 =
mg/kg/j 13,53/0,81mg/kg/j 50/3mg/m2/j
13,53/0,81 mg/kg/j ÷ 10 = 1,353 / 0,081
mg/kg/j
Rat : 110 mg/kg/j + 7,5 110/7,5 mg/kg/j x 0,162 = 1,782/0,122 mg/kg/j x 37 = 65,93/4,50
mg/kg/j 17,82/1,22mg/kg/j mg/m2/j
17,82/1,22mg/kg/j ÷ 10 = 1,782 / 0,122
mg/kg/j

Études de cancérogénicité (AH) : Tableau 17

Espèce Voie Nombre d’animaux Durée
Souris CD-1 Orale dans la nourriture 50 mâles, 50 femelles 2 ans
Souris CD-1 Orale dans la nourriture 50 mâles, 50 femelles 2 ans
Souris CD-1 Orale dans la nourriture 50 mâles, 50 femelles 2 ans
Rat Wistar (23) Orale dans la nourriture 50 mâles, 50 femelles 2 ans
Rat Wistar (23) Orale dans la nourriture 50 mâles, 50 femelles 2 ans
Rat Wistar (23) Orale dans la nourriture 50 mâles, 50 femelles 2 ans

ANNEXE : (EG)
Annexe 1

Colocitabine Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 2 2
Dose faible 1 50 2 2
Dose médiane 2 400 2 2
Dose élevée 3 750 2 2

Tableau 18. Étude d’innocuité pharmacologique du système cardiovasculaire chez le

chien.

36
 Provynuril Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 2 2
Dose faible 1 5 2 2
Dose médiane 2 60 2 2
Dose élevée 3 120 2 2

Tableau 19 Étude d’innocuité pharmacologique du système cardiovasculaire chez le

chien.

Colocitabine + Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

provynuril

Contrôle 0 0 2 2
Dose faible 1 10/0,5 2 2
Dose médiane 2 80/7,5 2 2
Dose élevée 3 150/15 2 2

Tableau 20. Étude d’innocuité pharmacologique du système cardiovasculaire chez le

chien.

Annexe 2

Colocitabine Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 5 5
Dose faible 1 50 5 5
Dose médiane 2 800 5 5
Dose élevée 3 1500 5 5

Tableau 21. Étude d’innocuité pharmacologique du système respiratoire chez le rat.

Provynuril Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

37
 Contrôle 0 0 5 5
Dose faible 1 5 5 5
Dose médiane 2 200 5 5
Dose élevée 3 400 5 5

Tableau 22. Étude d’innocuité pharmacologique du système respiratoire chez le rat.

Colocitabine + Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

provynuril

Contrôle 0 0 5 5
Dose faible 1 10/0,5 5 5
Dose médiane 2 260/30 5 5
Dose élevée 3 500/50 5 5

Tableau 23. Étude d’innocuité pharmacologique du système respiratoire chez le rat.

Observations mesurables Contrôle Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3

Fréquence respiratoire normale Normale normale normale
Volume respiratoire normal Normal normal normal
Saturation de l’O2 normale Normale normale normale
Ventilation normale Normale normale normale

Tableau 24 : Les études du système respiratoire : Cas du provynuril

Observations Contrôle Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3

mesurables
Saturation de l’O2 normale normale 92± 2 % 96± 2 %
normale normale 66± 6 mouvement thorax/min 68± 6 mouvement
Fréquence respiratoire
thorax/min
Volume respiratoire normale normale 10,7 ± 0,6 mL·kg-1 10,5 ± 0,6

38
 mL·kg-1

normale normale 1,4 ± 0,08, L·kg-1·min-1) 1,2 ± 0,08, L·kg-

Ventilation
1·min-1)

Tableau 25 : Les études du système respiratoire : Cas de la colocitabine + provynuril

Annexe 3

Colocitabine Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 5 5
Dose faible 1 50 5 5
Dose médiane 2 800 5 5
Dose élevée 3 1500 5 5

Tableau 26. Étude d’innocuité pharmacologique du système nerveux central chez le rat.

Provynuril Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 5 5
Dose faible 1 5 5 5
Dose médiane 2 200 5 5
Dose élevée 3 400 5 5

Tableau 27. Étude d’innocuité pharmacologique du système nerveux central chez le rat.

Colocitabine + Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

provynuril

Contrôle 0 0 5 5
Dose faible 1 10/0,5 5 5
Dose médiane 2 260/30 5 5
Dose élevée 3 500/50 5 5

39
Tableau 28. Étude d’innocuité pharmacologique du système nerveux central chez le rat.

Annexe 4

Colocitabine Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 5 5
Dose faible 1 50 5 5
Dose médiane 2 800 5 5
Dose élevée 3 1500 5 5

Tableau 29. Étude d’innocuité pharmacologique du système gastro-intestinal chez le rat.

Provynuril Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 5 5
Dose faible 1 5 5 5
Dose médiane 2 200 5 5
Dose élevée 3 400 5 5

Tableau 30. Étude d’innocuité pharmacologique du système gastro-intestinal chez le rat.

Colocitabine + Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

provynuril

Contrôle 0 0 5 5
Dose faible 1 10/0,5 5 5
Dose médiane 2 260/30 5 5
Dose élevée 3 500/50 5 5

Tableau 31. Étude d’innocuité pharmacologique du système gastro-intestinal chez le rat.

40
 Annexe 5

Colocitabine Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 5 5
Dose faible 1 50 5 5
Dose médiane 2 800 5 5
Dose élevée 3 1500 5 5

Tableau 32. Étude d’innocuité pharmacologique du système reproduction – fertilité –

développement embryonnaire chez le rat.

Provynuril Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 5 5
Dose faible 1 5 5 5
Dose médiane 2 200 5 5
Dose élevée 3 400 5 5

Tableau 33. Étude d’innocuité pharmacologique du système reproduction – fertilité -

développement embryonnaire chez le rat.

Colocitabine + Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

provynuril

Contrôle 0 0 5 5
Dose faible 1 10/0,5 5 5
Dose médiane 2 260/30 5 5
Dose élevée 3 500/50 5 5

41
Tableau 34. Étude d’innocuité pharmacologique du système reproduction – fertilité -
développement embryonnaire chez le rat.
Annexe 6

Colocitabine Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 2 2
Dose faible 1 50 2 2
Dose médiane 2 400 2 2
Dose élevée 3 750 2 2

Tableau 35. Étude d’innocuité pharmacologique du système reproduction –

développement périnatal chez le chien.

Provynuril Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 2 2
Dose faible 1 5 2 2
Dose médiane 2 60 2 2
Dose élevée 3 120 2 2

Tableau 36. Étude d’innocuité pharmacologique du système reproduction – développement

périnatal chez le chien.

Colocitabine + Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

provynuril

Contrôle 0 0 2 2
Dose faible 1 10/0,5 2 2
Dose médiane 2 80/7,5 2 2
Dose élevée 3 150/15 2 2

Tableau 37. Étude d’innocuité pharmacologique du système reproduction –

développement périnatal chez le chien.

42
IV- Graphique de Gantt pour les études précliniques : (AH)

1996
__In vitro
__ In
__ G
__

43