[SUBCULTIVO DE CLULAS

EN MONOCAPA Y
CITOMETRIA DE FLUJO]

INTRODUCCIN
Una de las formas de crecimiento in vitro es el cultivo en monocapa. Cuando las clulas requieren la adhesin
a un sustrato para crecer y dividirse, el crecimiento se realiza en una nica capa celular (monocapa). Esta
monocapa crecer hasta alcanzar cerca del 100% de confluencia (mxima capacidad de cubrimiento de
superficie); pasado esta etapa, el crecimiento se detiene por inhibicin por contacto y las clulas pueden
comenzar a degenerar, despegarse y morir. No obstante, algunas variantes de clulas tumorales son capaces
de apilarse y dar lugar a multicapas.
CULTIVO CELULAR: Termino utilizado para denominar el crecimiento de clulas in vitro, incluyendo el cultivo
de clulas aisladas. En los cultivos celulares, las clulas no estn organizadas en verdaderos tejidos.
CULTIVO PRIMARIO: El cultivo iniciado a partir de clulas, tejidos u rganos tomados directamente de un
organismo. Un cultivo primario debe ser considerado como tal hasta que se subcultive (o repique) con xito
por primera vez. En ese momento se considera una lnea celular.
DENSIDAD DE SATURACION: El mximo nmero de clulas mantenible bajo condiciones especficas de
cultivo en un recipiente. Este trmino se expresa usualmente como el nmero de clulas por centmetro
cuadrado en una superficie de cultivo o el nmero de clulas por centmetro cbico en un cultivo en
suspensin.
EFICIENCIA DE SIEMBRA (ADHESION): El porcentaje de clulas sembradas que se adhieren a la superficie
del recipiente de cultivo en un tiempo determinado. Siempre deben establecerse las condiciones bajo las
cuales se realiz la determinacin.
LINEA CELULAR: Una lnea celular se origina a partir de un cultivo primario en el momento del primer
subcultivo exitoso. El trmino lnea celular implica que los cultivos de la misma consisten en numerosos linajes
de clulas presentes originalmente en el cultivo primario. Los trminos finita o continua son usados como
prefijo si se conoce el estado del cultivo. Si no, el trmino lnea es suficiente. El trmino lnea continua
reemplaza al trmino lnea establecida.
MEDIO QUIMICAMENTE DEFINIDO: Una solucin nutritiva para cultivo de clulas siendo conocida la
estructura qumica de cada componente. Aunque se sabe que an los compuestos qumicos puros pueden
tener algunos contaminantes, se deben usar compuestos qumicos de alta calidad con datos analticos, si es
posible, de los contaminantes.
PASAJE (REPIQUE): La transferencia o trasplante de clulas, con o sin dilucin, de un recipiente de cultivo a
otro. Se entiende que siempre que las clulas se transfieren de un recipiente a otro,.una cierta porcin de
stas se pierde y que por lo tanto, se produce la dilucin de las clulas en forma deliberada o no. Este trmino
es sinnimo del trmino subcultivo.
PASAJE NUMERO (REPIQUE NUMERO): El nmero de veces que las clulas en cultivo han sido
subcultivadas. En la descripcin de este proceso debe establecerse la relacin o dilucin de las clulas a fin
de determinar la edad relativa del cultivo
Los criterios para el subcultivo de clulas en monocapa son los siguientes
Densidad del cultivo. Las clulas deben ser subcultivadas tan pronto como alcancen confluencia de otra
manera saldran del ciclo y tardaran mas tiempo en recuperarse al ser resembradas.
Agotamiento del medio
Tiempo desde el ultimo subcultivo

Citometra de flujo es un trmino general que hace referencia a una medida rpida de partculas que se
mueven en un flujo. Esta tcnica fue diseada para la valoracin de una o ms propiedades de clulas
individuales en suspensin, de forma secuencial en el tiempo. La informacin se obtiene a travs del uso de
varias propiedades pticas de las partculas, de un rango de tamao entre 1 y 150 11m. Los aparatos
diseados para estas mediciones provocan el paso consecutivo de clulas individuales suspendidas en un
fluido apropiado a travs de una zona delimitada de anlisis, dnde se lleva a cabo este anlisis a medida que
la clula atraviesa dicha zona.
PARMETROS QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRA DE FLUJO La citometra de flujo permite
medir diferentes parmetros de una clula.
Parmetros nucleares
Parmetros citoplsmicos
Parmetros de superficie
Parmetros extracelulares

Objetivos:
Comprender los fundamentos en los que se basa la citometra de flujo.
Analizar citometras
MATERIALES

Pipetas pasteur

Clulas en mocapa

Tubos de 15 ml

Medio de cultivo

Centrifuga

PBS

Incubadora a 37C

Tripsina

Cmara de Neubawuer

Alcohol al 70%

Papel absorbente

Contenedor de desechos

Microscopio invertido

Azul de tripano

Clitmetro de flujo

Pipetas graduadas (5 a10 ml)

1ml, 200 l y 20 l

PROCEDIMIENTO
1. Examinar cuidadosamente el cultivo, con la finalidad de observar su morfologa, o posible
contaminacin
2. Tomar la caja en el rea de trabajo estril y remover el medio, adicionar PBS y lavar la monocapa,
retirar el PBS con ayuda de la pipeta. Este paso se realiza con la finalidad de eliminar trazas de suero
que puedan inhibir la accin de la tripsina
3. Agregar la tripsina, asegurndose de que la monocapa quede cubierta. Colocar la incubadora por
minutos, o hasta que las clulas se muestren redondas No incubar ms de lo necesario.
4. Agregar medio y dispersar las clulas mediante repetido pipeteo sobre la superficie de la monocapa
5. Finalmente mezclar la suspensin celular (opsional : transferir la suspensin celular a tubos falcon de
15ml y centrifugar, resuspender las clulas en 1 ml de medio. Realizar el conteo celular) y contar las
clulas con un hemocitometro a 4000 reboluciones por minuto por 5 minutos
6. Diluir la suspensin celular a una adecuada concentracin para su resiembra
7. Colocar nuevamente las clulas

RESULTADOS
caractersticas delas lneas celulares
Las clulas HaCaT son una lnea celular establecida procedente de queratinocitos humanos inmortalizados
espontneamente a partir de su incubacin a temperaturas altas y concentraciones bajas de Ca2+ en el
medio de cultivo
Esta lnea celular conserva la gran mayora de las caractersticas de queratinocitos humanos primarios,
manteniendo una adecuada sntesis de queratinas, as como un fenotipo epidrmico prcticamente normal,
incluso despus de ms de 300 subcultivos Las clulas HaCaT presentan una morfologa poligonal, son
atumorignicas tras su inyeccin en ratones atmicos y poseen una notable estabilidad cromosmica