Mejora u optimizacion de la aptitud (capacidad) microbiana en el

intestino mamfero por metagenmica funcional temporal in vivo.

Resumen.
Dilucidar las funciones de los genes microbianos comensales en el
intestino de mamferos es un reto, ya que muchos comensales son
recalcitrantes (o reacios) al cultivo en laboratorio y a su manipulacin
gentica. Presentamos la secuenciacin metagenmica funcional
temporal (TFUMseq), una plataforma para minar funcionalmente
(extraer datos de manera funcional de) genomas bacterianos, genes
que contribuyan a la aptitud de las bacterias comensales in vivo.
Nuestro enfoque utiliza metagenmica ADN para construir bibliotecas
de expresin heterlogas a gran escala que son monitorizadas in vivo
en el transcurso del tiempo, mediante secuenciacin profunda y
mtodos computacionales. Para demostrar nuestro enfoque, hemos
construido una biblioteca de plsmidos TFUMseq utilizando
Bacteroides thetaiotaomicron comensales de intestino (Bt), y se
introdujo en ratones libres de grmenes Escherichia coli los cuales
transportaban esta biblioteca. La dinmica de poblaciones de la
biblioteca de clones revel genes de Bt confiriendo ventajas de
aptitud significativas en E. coli en el transcurso del tiempo, incluyendo
genes de utilizacin de hidratos de carbono, con una galactoquinasa
Bt primordial para la colonizacin temprana, y el dominio posterior de
una glicsidasa Bt permitiendo el metabolismo de la sacarosa
acoplada con la co-evolucin de la biblioteca del plsmido y el
genoma de E. coli llevando a una mayor utilizacin de la galactosa.
Nuestros resultados ponen de relieve la utilidad de la metagenmica
funcional para la ingeniera de bacterias comensales con propiedades
mejoradas, incluyendo la capacidades ampliadas de colonizacin in
vivo.
Introduccin.
El tracto gastrointestinal de mamferos (GI) es un entorno hostil para
los microbios mal adaptados. Sin embargo, diversos grupos de
microbios han evolucionado para prosperar en el tracto
gastrointestinal, en el marco de la intensa competencia entre
especies, factores estresantes fsicos y qumicos, y el sistema inmune
del husped (Ley et al, 2006; Dethlefsen et al, 2007). Estos
microorganismos tambin soportan las funciones homeostticas
normales del husped, ayudando a extraer nutrientes, estimular el
sistema inmune, y proporcionan proteccin contra la colonizacin por
patgenos (Stappenbeck et al, 2002; Hooper, 2004; Bckhed et al,
2005; Gill et al, 2006; Ley et al, 2006). La secuenciacin de nueva

generacin ha permitido estudios sistemticos de la microbiota de los

mamferos, y se han hecho grandes avances en la caracterizacin de
la estructura de las comunidades bacterianas y su potencial gentico
in vivo. Por ejemplo, el Proyecto Microbioma Humano (HMP)
(Turnbaugh et al, 2007; Peterson et al, 2009; Huttenhower et al, 2012)
y MetaHIT (Qin et al, 2010) han generado mapas de abundantes
especies bacterianas a lo largo de todo el cuerpo humano, genomas
de referencia y catlogos de ms de 100 millones de genes
microbianos ensambladas a partir de Shotgun Sequencing
(Secuenciacion Escopeta o Clonacion Escopeta) de comunidades in
vivo. Aunque estos estudios han generado grandes cantidades de
datos descriptivos, las funciones de la mayora de los genes
bacterianos en estas colecciones siguen siendo pobremente
caracterizadas o totalmente desconocidas.
Los mtodos tradicionales para caracterizar las funciones de los
genes microbianos requieren el aislamiento, cultivo, y la introduccin
de ADN extrao en un organismo receptor. Sin embargo, se estima
que el 60-80% de las especies de microbiota asociada a mamferos
permanecen sin cultivar (Walker et al, 2014). Incluso despus del
cultivo xitoso y la introduccin de material gentico en un
microorganismo, el ADN debe integrarse en el genoma microbiano o
mantenerse epismicamente. Esto requiere conocidos sistemas de
replicacin compatibles y de restriccin-modificacin, que pueden no
ser factibles para muchos microbios. Si se pueden superar estas
barreras, se pueden emplear mtodos de bajo rendimiento estndar
para la caracterizacin funcional de genes, o nuevos enfoques tales
como mutagnesis de transposones podran acoplarse con la
secuenciacin de nueva generacin. En este ltimo mtodo,
posiciones aleatorias en el genoma se interrumpen con un transposn
que contiene un marcador seleccionable; la biblioteca resultante se
somete a condiciones de seleccin y secuenciado profundo para
determinar mutantes enriquecidos y empobrecidos (Van Opijnen et al,
2009). Una limitacin de esta tcnica es que los genes esenciales o
aquellos que son importantes para la aptitud de clulas son difciles
de analizar, ya que la inactivacin de estos genes por mutagnesis de
transposones sera letal para el organismo en estudio. Una restriccin
adicional es que el transposn mutagnico puede alterar la expresin
de genes testigo que estn cerca del locus relevante, lo que provoca
efectos fenotpicos contradictorios.
Aqu, empleamos un enfoque alternativo, mediante la construccin de
bibliotecas de expresin escopeta a gran escala que pueden conferir
ganancia de funcin en la cepa bacteriana receptora. Nuestro mtodo

utiliza fraccionamiento fsico o digestin restrictiva del ADN donante

para generar fragmentos que se clonan en un vector de expresin y
se transformaron en la cepa receptora, para un rastreo funcional de
alto rendimiento e identificar los genes que confieren una ventaja en
la aptitud en un contexto particular. Este enfoque tiene la ventaja de
que el organismo donante no tiene que ser fcilmente cultivable o
genticamente manipulable en el laboratorio; Adems, permite la
investigacin de genes esenciales o genes que confieren una
sinrgica ventaja en la aptitud con el organismo receptor. La
metagenmica funcional utilizando muestras ambientales se provo
por primera vez en comunidades derivadas de materias primas
lignocelulsicas (Healy et al, 1995), el agua de mar (Stein et al, 1996),
y el suelo (Rondon et al, 2000). El uso de bibliotecas escopeta para la
metagenmica funcional de la microbiota asociada con mamferos se
ha demostrado ex vivo, como por el aumento de la biblioteca en
medios con diferentes sustratos para caracterizar enzimas activas de
hidratos de carbono (Tasse et al, 2010), metabolismo prebitico
(Cecchini et al, 2013), actividad glucuronidasa (Gloux et al, 2011),
tolerancia a la sal (Culligan et al, 2012), y genes de resistencia a
antibiticos (Sommer et al, 2009), o mediante el uso de lisado filtrado
de la biblioteca para detectar la modulacin de seal en cultivos de
celulas de mamferos (Lakhdari et al, 2010). Este enfoque de la
biblioteca escopeta metagenmica an no se ha llevado a cabo a
gran escala in vivo.
Para demostrar nuestro enfoque de secuenciacin metagenmica
funcional temporal (TFUMseq), se utiliz fragmentos genticos de alta
cobertura del genoma del comensal Bacteroides thetaiotaomicron
(Bt) de intestino humano , secuenciado en su totalidad (Xu et al,
2003) y se clonaron los fragmentos en una biblioteca de plsmido en
una cepa K-12 de Escherichia coli. Elegimos Bt porque es una cepa
comensal comn en el intestino humano que persistentemente
coloniza y posee un repertorio amplio y bien caracterizado de las
actividades catablicas, tales como la deteccin de polisacridos y la
reorientacin del metabolismo para buscar alimento en el husped
versus suplemento con glicanos (Sonnenburg et al, 2005 ; Bjursell et
al, 2006; Martens et al, 2008). Sometimos la biblioteca TFUMseq a
presiones selectivas in vitro e in vivo, se recogio muestras de salida
en diferentes tiempos (temporal) para la secuenciacin de alto
rendimiento, y utilizamos mtodos computacionales para reconstruir
la dinmica de poblaciones de clones que albergan genes donantes
(Fig 1). Nuestro trabajo es un avance sobre los estudios anteriores en
dos aspectos principales. En primer lugar, a nuestra comprension,
nuestro estudio es el primero en emplear bibliotecas de expresin

escopeta para metagenmica funcional in vivo. Las caractersticas

importantes del intestino de los mamferos son difciles de recapitular
in vitro, tales como la respuesta inmune del husped. Por lo tanto, los
experimentos in vivo son esenciales para investigar la funcin de los
genes de la microbiota comensal en el husped. En segundo lugar,
nuestro estudio aprovecha la secuenciacin de alto rendimiento y
mtodos computacionales para generar dinmicas detalladas de toda
la poblacin sometidas a seleccin con el tiempo. Esta informacin
cintica es crucial para la comprensin de la secuencia de eventos
durante los procesos dinmico inherentes y complejos de la
colonizacin del huesped.
MATERIALES y METODOS.
Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento.
Se cultiv anaerbicamente Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482
(ATCC # 29148) en un medio rico basado en infusin de cerebrocorazn con otros suplementos aadidos (ver Materiales y Mtodos
complementarios). La biblioteca genmica se mantuvo en una cepa K12 de Escherichia coli, NEB Turbo (New England Biolabs, Ipswich, MA,
EE.UU.). Las cepas de Escherichia coli fueron cultivadas en caldo Luria
(LB) y se suplement con carbenicilina (concentracin final 100 g/ml)
segn lo necesario. Para el crecimiento anaerobio, se utiliz un
recipiente anaerbico (Sistema GasPak, Becton Dickinson, Franklin
Lakes, NJ). Se preparo comida para ratn filtrado (MC) aadiendo 150
ml de agua desionizada a 8 g de comida para ratones triturado (Dieta
de Cra de Ratn 5021, LabDiet, St. Louis, MO, EE.UU.). La mezcla se
calent a 95 C durante 30 min con agitador, pasado por un filtro de
0,22-m, y en autoclave. La esterilidad del filtrado MC se confirm
mediante la incubacin a 37 C en condiciones aerbicas y
anaerbicas y sin observar ningn crecimiento despus de varios
das.
Generacin de la Biblioteca.
Se aisl el ADN genmico de Bacteroides thetaiotaomicron (DNeasy
Blood & Tissue Kit, Qiagen, Venlo, Pases Bajos), fragmentado por
sonicacin a 3-5 kb (Covaris E210, Covaris, Woburn, MA, EE.UU.), y
seleccionados por tamao y extrado por electroforesis en gel (Pippin
Prep, Ciencias Sage). Los fragmentos fueron reparados en sus
extremos (kit End-It End-Repair ADN , Epicentro, Madison, WI, EE.UU.)
y se clonaron en un vector soporte GMV1c amplificado por PCR
mediante la ligadura de extremo romo. La reaccin se transform en
NEB clulas Turbo electrocompetentes E. coli (New England Biolabs).

El tamao de la biblioteca se cuantific contando colonias formadas

en un medio selectivo (LB carbenicilina) despus de sembrar una
fraccin de las clulas transformadas. Para evaluar el tamao de los
insertos clonados con xito en la biblioteca, elegimos colonias para
amplificacin por PCR utilizando cebadores ver2_f / r (Tabla S2) que
flanqueaban el sitio de insercin. Adems, se confirm la presencia de
insertos mediante la presentacin de los insertos amplificados por
secuenciacin de Sanger (GENEWIZ, South Plainfield, Nueva Jersey,
EE.UU.) y alineado de secuencias con el genoma donante de B.
thetaiotaomicron. Un protocolo ms detallado se incluye en Materiales
y Mtodos Complementarios.
Retencin del plsmido.
Grnulos individuales de heces de 0,75, 1,5, 1,75, 2,5, 4, 10, 14, 21,
25, 28 Das se homogeneizaron en PBS al 10% y se sembraron en
agar LB con o sin carbenicilina (carb). Para obtener recuentos exactos,
se realizaron plaqueos de colonias por triplicado y se repitieron a
diluciones 100x si las placas estaban sobrecubiertas. La retencin del
plsmido se calcula como el nmero de colonias crecidas en placas de
LB-carb dividido por el nmero de colonias que crecen en placas de
LB slo.
seleccin in vitro.
Despus de la inoculacin de la biblioteca en caldo LB o MC, los
cultivos se pasaron por dilucin 20 veces en medio fresco. Los cultivos
LB se cultivaron en condiciones aerbicas con agitacin y pasadas
todos los das durante 2 semanas. Los cultivos MC se hicieron crecer
en condiciones anaerbicas sin agitacin y se pasaron cada 2 das
durante 2 semanas, ya que los cultivos llevaron ms tiempo para
llegar a la saturacin comparada con la condicin LB.
(pasar o pases: Proceso de pasar o mantener um grupo de
microorganismos o celulas a travez de una serie de cultivos o
huespedes.)
seleccin in vivo.
Todos los ratones utilizados en este estudio fueron manejados de
acuerdo con los protocolos aprobados por el rea Mdica del Comit
Permanente de Harvard sobre Animales (HMA IACUC). fueron
utilizados ratones machos C57BL/6 , 6-8 semanas de edad. Los
animales fueron criados en el Centro para la metagenmica Clnica y
Traslacional mantenidos en condiciones libres de grmenes antes de
los experimentos. Los ratones libres de germenes fueron alimentados

via oral con ~2 108 UFC de bacterias en un volumen de 200 l en el

da 0. Los ratones que recibieron la biblioteca fueron enjaulados
individualmente en un aislador gnotobiticos. Los ratones de control
se mantuvieron en una sola jaula en un aislador gnotobiotico
separado. los pellets fecales se recogieron en 0,5, 0,75, 1,5, 1,75, 2,5,
3, 4, 7, 10, 14, 21, 25, y 28 das despus de la inoculacin y se
almacenaron a -80 C en 10% de tampn PBS.
PCR de colonias y secuenciacin Sanger.
Las colonias individuales fueron aisladas a partir de muestras de
heces trazados sobre agar LB con carbenicilina (100 mg / ml). Las
colonias se cultivaron durante la noche a 37 C en una placa de 96
pocillos con 200 l de LB + carbenicilina. 0,8 l del cultivo fue
aadido a un volumen PCR total de 20 l. La mezcla de PCR (kit KAPA
HiFi HotStart ReadyMix PCR, Kapa Biosystems, Wilmington, MA,
EE.UU.) contena cebadores ver2_f/r (Tabla S2) que flanqueaba el sitio
de insercin. Los amplicones PCR se sometieron a secuenciacin
(GENEWIZ), y la secuencia de insercin se mapeo de nuevo al
genoma B. thetaiotaomicron utilizando BLASTn. Los primers para el
genotipado del locus galK en el genoma de E. coli se enumeran en el
cuadro complementario S2. La presencia o ausencia de IS2 en galK se
confirm usando cebadores galK16_chk_f/r que flanqueaba el sitio de
insercin esperado en galK.

Extraccin de ADN y la amplificacin por PCR de insertos para la

secuenciacin Illumina.
Se extrajo el ADN de las muestras recogidas en el experimento in
vitro utilizando el kit DNeasy Tissue & Blood (Qiagen). Los insertos
fueron amplificados por PCR utilizando primers ver2_f / r (Tabla S2) en
mezcla KAPA HiFi HotStart (Kapa Biosystems) y se purific con perlas
Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, EE.UU.) en
una relacin volumtrica perlas:muestra de 0,5 : 1. Los amplicones se
prepararon para la secuenciacin usando el kit Nextera (Illumina, San
Diego, CA, EE.UU.). Para todas las muestras fecales desde el
experimento in vivo, se utiliz el Mini kit de heces QIAamp DNA
(Qiagen). El ADN aislado se digiri con enzimas AvrII y PspXI (New
England Biolabs) antes de la purificacin con el kit de purificacin
QIAquick PCR (Qiagen) y posterior amplificacin por PCR con
cebadores A_L y A_R (Tabla S2) en KAPA HiFi HotStart Mix. El PCR se
purific con perlas de AMPure en una relacin volumtrica
perlas:muestra de 0.5:1. Un protocolo detallado est incluido en los
materiales y mtodos complementarios.