Arquivos Teses 000768040

Murilo Santhiago
Dissertao de Mestrado
Instituto de Qumica
Departamento de
Qumica Analtica
Laboratrio de Eletroqumica,
Eletroanaltica e Desenvolvimento
de Sensores
Instituto Nacional de
C&T de Bioanaltica
DISSERTAO DE MESTRADO
CONSTRUO DE PLATAFORMAS NANOESTRUTURADAS

NANOESTRUTURADAS
PARA DETECO DE Cys e NADH
Autor: Murilo Santhiago

Orientador: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota
Campinas
Fevereiro / 2010
i
Murilo Santhiago
ii
Murilo Santhiago
Dedico esta dissertao minha famlia,

pelo apoio incondicional,
com amor.
Murilo Santhiago
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota, por ter me incentivado e orientado de maneira
grandiosa desde o incio do mestrado. Ficam aqui os meus sinceros
agradecimentos pela ajuda imediata nos momentos crticos e, principalmente, de
tornar possvel realizao deste trabalho;
Aos amigos Phabyanno, Wilney e Caio, pela ajuda, incentivo, amizade e
principalmente, companheirismo, qualidade difcil de se encontrar em uma rea
em que o individualismo predomina. Pessoas batalhadoras que no desanimam
ao enfrentar as dificuldades proporcionadas pela vida;
Aos amigos de Blumenau Eduardo, Aldori, Raquel e Juliano pelo companheirismo
que j ultrapassa uma dcada;
A todos os funcionrios do Instituto de Qumica que colaboraram para a realizao
deste trabalho, especialmente a Izabel Aquino Calasso, Izabel Ribeiro Filippi,
Miguel da Silva Morel e Nestor P. Maia pela ateno e ajuda;
Aos colegas do Laboratrio LEEDS;
Ao CNPq pelo apoio financeiro;
vii
Murilo Santhiago
CURRICULUM VITAE
Nome: Murilo Santhiago
Naturalidade: Blumenau-SC
Data de nascimento: 26/04/1984
I.0 Formao acadmica
I.1 Qumica
Universidade Federal de Santa Catarina UFSC, Florianpolis-SC

Incio: 2003 / 2. semestre
trmino: 2007 / 2. semestre
Ttulo da monografia: Determinao de cido Rosmarnico Utilizando Sensor

Biomimtico Contendo Complexo Binuclear de Fe-Zn e Eletroforese Capilar.
Orientadora: Profa. Dra. Iolanda da Cruz Vieira
I.2 Mestrado em Qumica
Universidade Estadual de Caminas UNICAMP, Campinas-SP

Incio: 2008 / 1. semestre
trmino: 2010 / 1. semestre
Ttulo da dissertao: Construo de Plataformas Nanoestruturadas para

Deteco de Cys e NADH.
Orientador: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota
II.0 Produo cientfica

II.1 Artigos publicados
II.1.1 SANTHIAGO, M. ; LIMA, P. R. ; SANTOS, W. J. R. ; OLIVEIRA, A. B. ;
Kubota, L. T. In situ activated 3,5-dinitrobenzoic acid covalent attached to
nanostructured platform for NADH electrooxidation. Electrochimica Acta 54
(2009) 6609 6616.
ix
Murilo Santhiago
II.1.2 SANTHIAGO, M. ; PERALTA, R. A. ; NEVES, A. ; MICKE, G. A. ; VIEIRA, I.

C. Rosmarinic acid determination using biomimetic sensor based on purple acid
phosphatase mimetic. Analytica Chimica Acta 613 (2008)91 97.
II.1.3 CARVALHO, M. L. ; SANTHIAGO, M. ; PERALTA, R. A. ; NEVES, A. ;
MICKE, G. A. ; VIEIRA, I. C. Determination of chlorogenic acid in coffee using a
biomimetic sensor based on a new tetranuclear copper(II) complex. Talanta 77
(2008) 394 399.
II.1.4 SANTHIAGO, M. ; VIEIRA, I. C. L-cysteine determination in pharmaceutical
formulations using a biosensor based on laccase from Aspergillus oryzae..
Sensors and Actuators B 128 (2007) 279 285.
II.1.5 SANTHIAGO, M. ; LIMA, P. R. ; SANTOS, W. J. R. ; KUBOTA, L. T. An

amperometric sensor for Lcysteine based on nanostructured platform modified
with 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB). Sensors and Actuators B, 2010.
II.3 Trabalhos completos apresentados em eventos cientficos

II.3.1 OLIVEIRA, C. N. ; LIMA, P. R. ; SANTHIAGO, M. ; KUBOTA, L. T.
Determinao de parmetros cinticos do sistema 1,2-NQ/MWCNT imobilizada
sobre ouro para oxidao eletrocataltica de NADH. In: XVII Simpsio Brasileiro de
Eletroqumica e Eletroanaltica, 2009, Fortaleza-CE.
II.3.2 SANTHIAGO, M. ; LIMA, P. R. ; SANTOS, W. J. R. ; KUBOTA, L. T.
Desenvolvimento de uma interface nanoestruturada para deteco eletrocataltica
de NADH. In: XVII Simpsio Brasileiro de Eletroqumica e Eletroanaltica, 2009,
Fortaleza-CE.
Murilo Santhiago
RESUMO
Ttulo: Construo de Plataformas Nanoestruturadas para Deteco de Cys e
NADH.
Autor: Murilo Santhiago
Orientador: Lauro Tatsuo Kubota
Palavras-chave: Sensor amperomtrico, nanotubos de carbono, cistena e NADH.
Neste trabalho descreve-se o desenvolvimento de dois sensores

amperomtricos empregando mediadores redox derivados do grupo nitro
imobilizados sobre plataformas nanoestruturadas para a deteco da nicotinamida
adenina dinucleotdeo (NADH) e L-cistena. Para a construo da base das
plataformas foram empregados nanotubos de carbono funcionalizados com grupos
amino. Uma vez funcionalizada, a plataforma possibilitou o ancoramento dos dois
mediadores redox. Para a deteco de NADH foi utilizado o cido 3,5dinitrobenzoico como mediador redox. Este mediador foi imobilizado na superfcie
da
plataforma
utilizando
os
catalisadores
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodimida (EDC) e N-hidroxi succinimida (NHS). J para o sensor destinado

deteco de L-cistena, foi necessrio a adsoro de nanopartculas de ouro para
imobilizar o cido 5,5ditiobis2nitrobenzoico (DTNB) como mediador redox.
Para os estudos eletroqumicos, as espcies hidroxilamina foram eletrogeradas in
situ a partir do grupo nitro presente em ambos os mediadores. As plataformas
nanoestruturadas
foram
caracterizadas
atravs
de
voltametria
cclica,
cronoamperometria, MEV e eletrodo de disco rotatrio. Os valores das constantes

heterognea de transferncia de eltrons (ks) e da velocidade da reao mediadoranalito foram ~50 s-1 e 103 - 104 L mol-1s-1, respectivamente. As curvas analticas
para ambos os sensores foram obtidas aplicando baixos sobrepotenciais e
resultaram em limites de deteco e quantificao na faixa de 1,2 9,1 mol L-1. O
sensor para L-cistena foi aplicado em amostras reais e os resultados obtidos
foram estatisticamente iguais quando confrontados com um mtodo comparativo.
xi
Murilo Santhiago
ABSTRACT
Title: Construction of nanostructured platforms for Cys and NADH detection.
Author: Murilo Santhiago
Adviser: Lauro Tatsuo Kubota
Keywords: Amperometric sensor, carbon nanotubes, cysteine and NADH.
This work describes the development of two amperometric sensors using

redox mediators derived from the nitro group immobilized on nanostructured
platforms for the detection of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Lcysteine. Carbon nanotubes functionalized with amino groups were used for the
construction of the platforms. Once functionalized, the platform allowed the
anchoring of two redox mediators. 3,5-dinitrobenzoic acid was used as redox
mediator for NADH detection. This mediator was immobilized on the surface of the
platform using the catalysts 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodimide (EDC)
and N-hydroxy-succinimide (NHS). For the construction of the sensor for Lcysteine detection, it was necessary the adsorption of gold nanoparticles to receive
5,5-dithio-2-nitrobenzoic acid as redox mediator. For the electrochemical studies,
the hydroxylamine species were electrogenerated in situ from the nitro group
present in both mediators. Nanostructured platforms were characterized by cyclic
voltammetry,
chronoamperometry,
SEM
and
by
rotating
disk
electrode
experiments. Rate constant values for the heterogeneous electron transfer (ks) and
the kinetic constants for the mediator-analyte reaction were ~50 s-1 e 103 - 104 L
mol-1s-1, respectively. The analytical curves for both sensors were obtained
applying low overpotentials and resulted in limits of detection and quantification
around 1.2 up to 9.1 mol L-1. The sensor for L-cysteine was used in
pharmaceutical samples and the results were statistically the same to those
obtained with a comparative method.
xiii
Murilo Santhiago
SUMRIO
LISTA DE ABREVIATURAS
xix
LISTA DE TABELAS
xxiii
LISTA DE FIGURAS
xxv
APRESENTAO
xxxi
CAP. I
INTRODUO E OBJETIVOS
I.1
L-cistena (Cys)
I.2
NADH
I.3
Deteco de Cys e NADH
I.4
Mediadores redox
I.5
Nanoestruturas
10
I.6
Nanotubos de carbono
11
I.6.1
Carbono
11
I.6.2
Sntese, estrutura e propriedades eletrnicas
12
I.6.3
Propriedades qumicas
14
I.6.4
Propriedades eletroqumicas
16
I.6.5
Funcionalizao dos nanotubos
18
I.6.5.1
Modificao covalente
18
I.6.5.2
Modificao no-covalente
20
I.7
Nanopartculas de ouro
22
I.8
Motivao
24
I.9
Objetivos
24
Geral
24
I.9.1
xv
Murilo Santhiago
I.9.2
Especficos
25
PARTE EXPERIMENTAL
27
Parte experimental
29
II.1.2
Reagentes e solues
29
II.1.3
Equipamentos
29
II.1.4
Limpeza do eletrodo de trabalho
30
II.1.5
Sensor para Cys (Sen-Cys)
31
Planejamento fatorial
32
II.1.6
Sensor para NADH (Sen-NADH)
32
II.1.7
Micrografias
33
II.1.8
Preparo das amostras
33
II.1.9
Estudo de repetibilidade, estabilidade e tempo de vida do

sensor
34
SENSOR PARA CISTENA
35
III.1
Apresentao do captulo
37
III.2
Resultados e discusso
39
III.2.1
Planejamento fatorial
39
III.2.2
Caracterizao da plataforma por MEV
40
III.2.3
Ativao e caracterizao do par redox
41
III.2.4
Atividade eletrocataltica da plataforma nanoestruturada
47
III.2.5
Estudos cronoamperomtricos
49
III.2.6
Caracterizao analtica
54
III.2.7
Estabilidade do sensor
60
CAP. II
II.1
II.1.5.1
CAP. III
xvi
Murilo Santhiago
III.2.8
Aplicao do sensor
60
III.2.9
Concluses
61
SENSOR PARA NADH
63
IV.1
Apresentao do captulo
65
IV.2
67
IV.2.1
Caracterizao por MEV e imobilizao do mediador
67
IV.2.2
Ativao e caracterizao do par redox
69
IV.2.3
Atividade eletrocataltica da plataforma nanoestruturada
72
IV.2.4
Efeito da ativao dos grupos nitro do mediador
74
IV.2.5
Estudos cronoamperomtricos
75
IV.2.6
Estudos com eletrodo de disco rotatrio
77
IV.2.7
O grupo R-NO/R-NHOH como mediador redox
85
IV.2.8
Mecanismo da eletrooxidao de NADH na plataforma
86
IV.2.9
Caracterizao analtica
87
IV.2.10
Estabilidade do sensor
95
IV.2.11
Concluses
95
CONCLUSES GERAIS
97
Concluses gerais
99
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
101
Referncias bibliogrficas
103
CAP. IV
CAP. V
V.1
CAP. VI
VI.1
CAP. VII PERSPECTIVAS

VII.1
Perspectivas
113
115
xvii
Murilo Santhiago
LISTA DE ABREVIATURAS
3,5-DNB
cido 3,5-dinitrobenzoico
3,5-DNBSE
(cido 3,5-dinitrobenzoico) succinimidil ster
rea do eletrodo
Coeficiente de transferncia de eltrons
Ag/AgCl
Eletrodo de referncia de prata/cloreto de prata
Concentrao de Cys ou NADH (Eq. Cottrell e Eq.III.4)
Ch
Vetor de empacotamento
CNTs
Coef. Ang.
Coeficiente angular
Cys
L-cistena
Coeficiente de difuso
Ep - Eo
Ep
Separao dos potenciais de pico
Delta de corrente
ECS
Eletrodo de calomelano saturado
ECV
Eletrodo de carbono vtreo
EDC
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodimida
DMF
NN dimetil formamida
D.P.R.
Desvio padro relativo
DTNB
cido 5,5ditiobis2nitrobenzoico
Eapl.
Potencial aplicado
EDR
Eletrodo de disco rotatrio
Ep
Potencial de pico
Eo
Potencial formal (Epa + Epc / 2)
Constante de Faraday
xix
Murilo Santhiago
FIA
Anlise por injeo em fluxo
HEPES
[N(2hidroxietil)piperazinaN(cido 2etanosulfnico)]
HOPG
Grafite piroltico altamente ordenado
Corrente
Icat
Corrente cataltica na presena de Cys ou NADH
Id(L)
Corrente limitada pelo transporte de massa
Ikin
Corrente limitada cineticamente
IL
Corrente na ausncia de Cys ou NADH
Ipa
Corrente de pico andica
Ipc
Corrente de pico catdica
KM
Constante de Michaelis-Menten
kobs
Constante cintica da reao mediador-analito
ks
Constante de velocidade heterognea de transferncia de

eltrons
MEV
Microscpio eletrnico de varredura
Mox
Mediador redox no estado oxidado
Mred
Mediador redox no estado reduzido
MWCNTs
Nanotubos de carbono de paredes mltiplas
Nmero de eltrons
np
Nmero de prtons
NADH
-nicotinamida adenina dinucleotdeo
NHS
N-hidroxi succinimida
NPAus
Nanopartculas de ouro
PBS
Soluo tampo fosfato
PEG
Polietilenoglicol
PEI
Polietilenoimina
PIPES
[PiperazinaNNbis[(cido 2etanosulfnico)]
xx
Murilo Santhiago
Carga
Constante universal do gases
SAM
Monocamada auto-organizada
Sen-Cys
Sensor para cistena
Sen-NADH
Sensor para NADH
SWCNTs
Nanotubos de carbono de paredes simples
Cobertura aparente de superfcie
tempo
Temperatura
ngulo de piramidalizao
TRIS
[Tris(hidroximetil) amino-metano]
TRITON-100
Polietilenoglicol p-(1, 1, 3, 3-tetrametilbutil)-fenil ter
VC
Voltametria cclica
VPD
Voltametria de pulso diferencial
Velocidade de varredura
Velocidade de varredura do processo andico
Velocidade de varredura do processo catdico
Velocidade de rotao do eletrodo
Viscosidade cinemtica
xxi
Murilo Santhiago
LISTA DE TABELAS
CAP. III. Sensor para Cys
Tabela III.1
Parmetros eletroqumicos e cinticos de alguns eletrodos 45

modificados com alguns mediadores redox.
Tabela III.2
Parmetros e condies experimetais extrados a partir de 51

estudos cronoamperomtricos para a eletrooxidao de Cys.
Tabela III.3
Caracterizao analtica do sensor destinado a deteco de 54

Cys.
Tabela III.4
Mtodos eletroqumicos, condies experimentais

parmetros analticos para a determinao de Cys.
Tabela III.5
Determinao de Cys nas amostras.
e 58
61
CAP.IV. Sensor para NADH

Tabela IV.1
Comparao entre a corrente cataltica da NADH em funo 74

do procedimento de ativao do 3,5-DNB ancorado na
plataforma.
Tabela IV.2
Parmetros eletroqumicos e cinticos de alguns eletrodos 84

modificados para eletrooxidao de NADH.
Tabela IV.3
Caracterizao analtica do sensor destinado a deteco de 88

NADH.
Tabela IV.4
Mtodos eletroqumicos, condies experimentais

parmetros analticos para a determinao de NADH.
e 91
xxiii
Murilo Santhiago
LISTA DE FIGURAS
I. INTRODUO E OBJETIVOS
Figura I.1
Estrutura da L-cistena.
Figura I.2
Estrutura da NADH e NAD(P)H.
Figura I.3
Esquema de comparao entre processos de oxidao

eletroqumicos: (I) direto e (II) indireto ou mediado. Mox e Mred
representam um par redox qualquer confinado na superfcie
do eletrodo. (A) e (B) representam o analito no seu estado
reduzido e oxidado, respectivamente.
Figura I.4
Esquema da estratgia eletroqumica utilizada para formao

do par redox nitroso/hidroxilamina a partir do grupo nitro.
Figura I.5
Nanotubo de carbono de paredes simples (SWCNT) e 12

mltiplas (MWCNT).
Figura I.6
(A) Coordenada dos vetores que definem o empacotamento 13

dos nanotubos e (B) tipo de estruturas normalmente
encontradas.
Figura I.7
Estrutura e hibridizao dos tomos de carbono para (a) 15

diamante, (b) grafite, (c) fulereno e (d) nanotubo de carbono.
Esquema mostrando os ngulos entre as ligaes e do
tomo de carbono de geometria (e) trigonal planar e (f)
tetradrica.
Figura I.8
Representao esquemtica das folhas do HOPG incluindo 17

as indicaes dos planos basal e edge.
Figura I.9
Esquema ilustrando os tipos mais comuns de reaes 19

covalentes nas extremidades/defeitos e nas paredes laterais
dos CNTs.
Figura I.10
Representao esquemtica das modificaes no- 21

covalentes nos CNTs. (A) Adsoro de polmeros, DNA ou
protenas e (B) exemplos de algumas modificaes
covalentes aps imobilizao de pirenos contendo grupos
funcionais (GF).
xxv
Murilo Santhiago
Figura I.11
Desenho esquemtico das rotas mais utilizadas para a 23

imobilizao de NPAus por: (A) atrao eletrosttica, (B)
adsoro de tiis e (C) adsoro de polictions.
II. PARTE EXPERIMENTAL

Figura II.1
Esquema ilustrando a clula eletroqumica com capacidade 30

para trs eletrodos (ECV = eletrodo de carbono vtreo, ECS
= eletrodo de calomelano saturado e Pt = eletrodo auxiliar) e
um local para a entrada de N2.
III. SENSOR PARA CISTENA

Figura III.1
Frmula
(DTNB).
estrutural
do
cido
5,5-ditio-2-nitrobenzoico 37
Figura III.2
Diagrama de Pareto (A) e superfcies de resposta para PEI 39

DTNB (B), MWCNTs PEI (C) e MWCNTs DTNB (D).
Figura III.3
Micrografias da superfcie nas etapas de construo do 41

sensor: (A) MWCNTs, (B) +PEI, (C) +NPAu e (D) +DTNB.
Grfico inserido: voltamograma cclico em H2SO4 0,5 mol L1
e = 100 mV s-1.
Figura III.4
Processo de ativao do mediador redox obtido em soluo 42

tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 e = 100 mV s-1.
Figura III.5
Voltamogramas cclicos do eletrodo modificado com o 44

DTNB-ativado em vrias velocidades de varredura (10
600 mV s-1). (A) Grfico de Ip vs. . (B) Grfico de Laviron.
Figura III.6
Influncia do pH da soluo no potencial formal (A) e na 46

corrente de pico (B) do mediador redox a partir de
voltamogramas cclicos registrados em soluo tampo
fosfato 0,1 mol L-1 e = 100 mV s-1.
Figura III.7
Grfico de Ep versus pH.
47
xxvi
Murilo Santhiago
Figura III.8
Voltamogramas cclicos obtidos em soluo tampo fosfato 48

0,1 mol L-1 pH 7,0 na presena de Cys 1,010-4 mol L-1 em
2 mV s-1 () para (A) ECV, (B) +MWCNTs, (C) +PEI, (D)
+NPAu, (E) +DTNB-ativado e (----) na ausncia de Cys,
respectivamente.
Figura III.9
Cronoamperogramas obtidos em soluo tampo fosfato 49

0,1 mol L-1 pH 7,0: branco (a), 50,0 (b) 75,0 (c), 100,0 (d) e
125,0 (e) mol L-1 de Cys.
Figura III.10
(A) Grfico de Icat / IL vs. t1/2 ; (B) grfico obtido a partir dos 51
coeficientes angulares das retas obtidas em (A) vs. [Cys]1/2.
Figura III.11
(A) grfico I vs. t -1/2 e (B) grfico dos coeficientes angulares 52

obtidos em (A) vs. [Cys]. As concentraes de Cys
utilizadas so as mesmas dos cronoamperogramas
mostrados na Figura III.8.
Figura III.12
Proposta para as reaes que ocorrem na superfcie da 53

plataforma nanoestruturada.
Figura III.13
Estrutura, composio e ordem de resposta analtica dos 55

tipos de eletrlitos de suporte estudados na caracterizao
analtica do sensor.
Figura III.14
Resposta cronoamperomtrica observada aps adies 56

sucessivas de uma soluo estoque de Cys em soluo
tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 para: (A) ECV, (B)
+MWCNTs, (C) +PEI, (D) +NPAu e (E) +DTNB-ativado.
Figura III.15
Curva analtica.
57
IV. SENSOR PARA NADH

Figura IV.1
Frmula estrutural do cido 3,5-dinitrobenzoico (3,5-DNB).
Figura IV.2
Micrografias obtidas da plataforma nanoestruturada 67

contendo MWCNTs/PEI para as magnificaes: (A) 1,000
e (B) 10,000.
65
xxvii
Murilo Santhiago
Figura IV.3
(A) Esquema de formao do intermedirio 3,5-DNBSE a 68

partir de uma soluo contendo 3,5-DNB, EDC e NHS. (B)
Mediador redox imobilizado na superfcie da plataforma.
Figura IV.4
Formao do par redox R-NO/R-NHOH em soluo tampo 70

fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 e = 50 mV s-1.
Figura IV.5
Voltamogramas cclicos do par R-NO/R-NHOH em vrias 70

velocidades de varredura (10 800 mV s-1). (A) Grfico de
Ip vs. . (B) Grfico de Laviron.
Figura IV.6

0,1 mol L-1 para o eletrodo modificado com o 3,5-DNBativado em diferentes pHs (5,0 8,0) e = 100 mV s-1
Inserido: Grfico de Eo vs pH.
Figura IV.7

0,1 mol L-1 pH 7,0 e = 2 mV s-1 na presena de NADH
2,010-4 mol L-1 (___) para (A) ECV no modificado, (B) ECV
modificado com MWCNTs/PEI, (C) ECV modificado com
MWCNTs/PEI/3,5-DNB e (---) na ausncia de NADH,
respectivamente.
Figura IV.8
Cronoamperogramas do eletrodo modificado com a 76

plataforma contendo o 3,5-DNB-ativado em soluo tampo
fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 para: (a) branco, (b) 50, (c) 100,
(d) 150 e (e) 200 mol L-1 de NADH. Grficos inserido: Icat /
iL vs. t1/2 para 50 mol L-1 de NADH.
Figura IV.9
(A) Grfico de Q vs t1/2 utilizando as mesmas condies 77

experimentais dos cronoamperogramas ilustrados na Figura
IV.8 e (B) Grfico de Qt-1/2 versus [NADH].
Figura IV.10
Curvas de polarizao obtidas em diferentes velocidades de 78

rotao do eletrodo para a oxidao eletrocataltica de 300
mol L-1 de NADH na superfcie da plataforma contendo o
3,5-DNB-ativado. Velocidades de rotao: (a) 5,20 ; (b) 7,67
; (c) 10,89 ; (d) 16,40 ; (e) 23,72 ; (f) 34,00 e (g) 45,70 rad s1
. Estudos feitos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, = 2
mV s-1 e = 2,3810-10 mol cm2.
xxviii
Murilo Santhiago
Figura IV.11
Grficos de Levich para a resposta eletrocataltica da 79

plataforma nanoestruturada contendo o 3,5-DNB-ativado
em diferentes concentraes de NADH. Estudos feitos em
tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, = 2 mV s-1 e =
2,3810-10 mol cm2.
Figura IV.12
Grfico de Koutecky-Levich obtidos a partir da Figura IV.11. 81

Estudos feitos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, = 2
mV s-1 e = 2,3810-10 mol cm2.
Figura IV.13
(A) Variao de kobs versus [NADH] para o eletrodo 82

modificado com a plataforma contendo o 3,5-DNB-ativado e
(B) variao de kobs-1 versus [NADH]. Estudos feitos em
tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, = 2 mV s-1 e =
2,3810-10 mol cm2.
Figura IV.14
Proposta para as reaes que ocorrem na superfcie da 87

plataforma na presena de NADH.
Figura IV.15
Resposta cronoamperomtrica observada aps adies 89

sucessivas de uma soluo estoque de NADH em soluo
tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 para: (A) ECV, (B)
+MWCNTs/PEI, (C) +3,5-DNB-ativado.
Figura IV.16
Curva analtica.
90
xxix
Murilo Santhiago
APRESENTAO
Materiais com propriedades exaustivamente estudadas durante anos
podem apresentar ainda alguma melhora no seu desempenho? Esta pergunta s
ter uma resposta negativa se no houver mais possibilidades de inovar e/ou
estabelecer novas condies de trabalho para esses materiais. Certamente, do
modo como a pesquisa cientfica avana no ser invivel agregar novas
propriedades para os materiais j bem estabelecidos. Um exemplo claro de tal
contribuio poder ser observado neste trabalho onde sero construdas
plataformas nanoestruturadas sobre o eletrodo de carbono vtreo visando melhorar
as propriedades interfaciais do eletrodo e, fornecer ainda, condies que
possibilitem a imobilizao de mediadores redox. Para apresentar essa
contribuio o presente trabalho foi dividido em captulos no sentido de abordar
detalhadamente cada plataforma construda.
O primeiro captulo abordar uma pequena introduo sobre os analitos
selecionados, caractersticas gerais dos nanomateriais utilizados, estratgias
adotadas, alguns princpios tericos e por fim, a motivao e os objetivos deste
trabalho.
No segundo captulo sero apresentados os reagentes e equipamentos
empregados, rotas de preparao das plataformas e condies experimentais
adotadas nos experimentos.
No terceiro captulo sero abordados os resultados referentes
construo, caracterizao, estudo das propriedades eletrocatalticas e aplicao
de uma plataforma nanoestruturada como sensor amperomtrico para a deteco
de cistena. Visando construo de um biossensor, no quarto captulo sero
apresentados os resultados relacionados com a caracterizao e estudo das
propriedades eletrocatalticas de uma plataforma nanoestruturada para a deteco
eletrocataltica de NADH.
Os ltimos captulos sero destinados s concluses gerais, referncias
bibliogrficas e perspectivas futuras.
xxxi
Murilo Santhiago
CAPTULO I
INTRODUO E OBJETIVOS
Murilo Santhiago
I.1 L-cistena (Cys)

A cistena (Cys), Figura I.1, um dos aminocidos mais importantes e
tambm uma molcula bioativa de grande significncia. A sua participao no stio
ativo de enzimas e em muitos outros peptdeos e protenas tambm j foi
reportada [1]. Alm disso, este aminocido participa em um grande nmero de
processos
bioqumicos,
os
quais
dependem
diretamente
da
reatividade
relacionada com o grupo tiol (R-SH). A cistena tambm largamente empregada

na indstria farmacutica e alimentcia como antioxidante [2].
O
OH
HS
NH2
Figura I.1. Estrutura da L-cistena.

A sua ao antioxidante est relacionada diretamente com o processo
redox do grupo tiol [1]. Este grupo encontrado tambm em outras molculas
bioativas de grande importncia como a glutationa, N-acetil-cistena e o cido
lipoico. A funo R-SH o grupo mais facilmente oxidvel presente nas molculas
citadas e, portanto, o processo redox dessas molculas pode ser descrito de
maneira genrica pela Equao I.1 abaixo.
2 R SH
R S S R + 2e + 2 H +
(Eq. I.1)
Alm do processo descrito acima, a cistena pode estar envolvida na

modulao da atividade de protenas atravs de eventos envolvendo reaes de
complexao do grupo tiol com metais de transio (Zn2+, Mn2+ e Cu2+) [3].
Murilo Santhiago
I.2 NADH
Os nucleotdeos NADH (nicotinamida adenina dinucleotdeo) e NAD(P)H
(grupo fosfato substituindo o grupo hidroxila) ilustrados na Figura I.2 esto
onipresentes em quase todos os sistemas vivos e so necessrios para reaes
de mais de 400 xido-redutases denominadas desidrogenases (250 dependentes
do NADH e por volta de 150 do NAD(P)H). Este nmero representa 17 % de todas
as
enzimas
classificadas
consequentemente,
estes
nucleotdeos
so
responsveis por mais reaes enzimticas do que qualquer outro cofator [4].
Figura I.2. Estrutura do NADH e NAD(P)H.

O papel desses cofatores no-proteicos em reaes catalisadas por
enzimas servir como aceptor/doador de eltrons e com isso, acabam sendo
cruciais no transporte de eltrons em sistemas biolgicos [5]. A reao de
oxidao do NADH descrita pela Equao I.2 abaixo:
NADH
NAD + + 2e +
H+
(Eq. I.2)
O processo de oxidao envolve 2 eltrons e 1 prton e ocorre no anel da

nicotinamida. Quando uma enzima ou outras molculas esto presentes no meio
reacional o processo redox descrito pode ser mais complexo e apresentar uma
4
Murilo Santhiago
etapa limitante da velocidade. Sendo assim, visando construo de

biossensores amperomtricos, os qumicos empregam tcnicas eletroqumicas
para conhecer e/ou elucidar os sistemas dependentes do processo NADH/NAD+
[6].
I.3 Deteco de Cys e NADH

A deteco de cistena e NADH efetuada normalmente atravs de
tcnicas espectrofotomtricas [7-9], cromatogrficas [10-12] e eletroqumicas[1315]. As tcnicas espectrofotomtricas usualmente necessitam de inmeras
solues e reagentes para o desempenho do mtodo. Zaia e col. desenvolveram
um mtodo espectrofotomtrico para determinao de cistena monitorando o
produto da reao da cistena com a p-benzoquinona em 500 nm [7]. Alm de
necessitar de uma elevada concentrao de p-benzoquinona, o mtodo precisa de
uma etapa de aquecimento/resfriamento para promover a reao de Michael, o
qual aumenta muito o tempo de anlise. J a deteco de NADH por mtodos
espectrofotomtricos visando trabalhos analticos no muito frequente, no
entanto, o monitoramento da absoro do NADH em 340 nm normalmente
utilizado para a avaliao da atividade de enzimas que so dependentes desse
cofator [9].
Ao
contrrio
da
espectrofotometria,
os
mtodos
cromatogrficos
apresentam elevado destaque no que se diz respeito determinao de inmeros

componentes em uma amostra. Os mtodos cromatogrficos superam a falta de
seletividade dos mtodos espectrofotomtricos, que se deve ao fato de que
grande parte dos reagentes utilizados nas anlises reagem com qualquer grupo
tiol presente na amostra. Desta forma, alguns trabalhos envolvendo cromatografia
lquida de alta eficincia e gasosa j foram propostos para a determinao de
cistena e outros antioxidantes [10-11]. Para o caso do NADH, os mtodos
cromatogrficos
surgiram
principalmente
para
contribuir
com
aspecto
mecanstico das reaes envolvendo nucleotdeos em sistemas biolgicos.

Myiatake e col. desenvolveram um mtodo cromatogrfico que possibilitou a
5
Murilo Santhiago
determinao de 7 nucleotdeos derivados da adenina. O principal objetivo do

trabalho foi fornecer uma ferramenta poderosa para qumicos e bilogos
estudarem os produtos enzimticos gerados por enzimas dependentes do NADH
[12]. No entanto, as tcnicas cromatogrficas necessitam para sua operao de
solventes ou gases de elevada pureza tornando o custo da anlise mais elevado
quando comparado, por exemplo, com as tcnicas eletroqumicas.
Por sua vez, as tcnicas eletroqumicas apresentam limites de deteco
mais apreciveis que as tcnicas espectrofotomtricas e um custo operacional
menor do que as cromatogrficas. Entretanto, a cistena e o NADH se oxidam em
altos sobrepotenciais em eletrodos convencionais como de carbono, platina ou
ouro. Em eletrodos de carbono, este elevado sobrepotencial pode ser diminudo
por um pr-tratamento, mas, estes eletrodos so rapidamente desativados [13].
Alm do sobrepotencial, outro problema relacionado com a eletrooxidao
do NADH que o produto da oxidao (NAD+) pode adsorver na superfcie do
eletrodo, dificultando a transferncia de carga e tornando o sensor inativo [14-15].
Recentemente, Damian e Omanovic publicaram um trabalho mostrando que o
processo de adsoro do NAD+ sobre eletrodos de ouro altamente espontneo e
ocorre tanto para superfcies com cargas positivas quanto negativas [16].
Por outro lado, no h relatos relacionados adsoro do produto de
oxidao da Cys na superfcie de eletrodos como o de carbono vtreo ou platina
mas, a aplicao de elevados sobrepotenciais compromete a seletividade do
mtodo. Alm dos problemas relacionados com a seletividade, a sensibilidade na
deteco da Cys e NADH nesses eletrodos muito baixa. Assim, para contornar
os problemas frequentemente observados, muitos eletrodos convencionais tm
sido modificados com mediadores redox para a deteco de NADH e Cys.
I.4 Mediadores redox

Os mediadores redox podem ser definidos como qualquer tipo de
substncia que facilite a transferncia de eltrons entre a espcie de interesse e a
superfcie do eletrodo [17]. A Figura I.3 ilustra um esquema da superfcie do
6
Murilo Santhiago
eletrodo que compara um processo de oxidao eletroqumico direto e um

processo indireto ou mediado.
Figura I.3. Esquema de comparao entre processos de oxidao eletroqumicos:

(I) direto e (II) indireto ou mediado. Mox e Mred representam um par redox qualquer
confinado na superfcie do eletrodo. (A) e (B) representam o analito no seu estado
reduzido e oxidado, respectivamente.
No processo direto, ilustrado na Figura I.3(I), o analito no seu estado
reduzido se aproxima da superfcie do eletrodo por difuso e sofre oxidao na
interface eletrodo-soluo. Desta forma, se (A) for cistena ou NADH o processo
s ir ocorrer em elevados sobrepotenciais. No entanto, quando um mediador
redox est presente na superfcie do eletrodo a converso (A) (B) ocorre
atravs do mediador e no diretamente na superfcie do eletrodo (Figura I.3(II))
[17]. Neste caso, a forma oxidada do mediador (Mox) atua como um receptor de
eltrons e oxida o analito. Essa reao ocorre com uma certa velocidade e pode
7
Murilo Santhiago
ser monitorada por cronoamperometria [18] e atravs de experimentos utilizando o

eletrodo de disco rotatrio [19]. Aps a reao, o produto oxidado (B) e a forma
reduzida do mediador (Mred) so formados. Assim, o sobrepotencial necessrio
que deve ser aplicado para que a reao de oxidao de (A) (B) acontea
agora modulado pelo potencial formal do par redox do mediador que est
confinado na superfcie do eletrodo [20].
Em alguns casos, mesmo na presena de um mediador redox, no ocorre
nenhum deslocamento catdico do potencial de oxidao dos analitos, mas a
corrente associada ao processo maior e promove, portanto, um ganho de
sensibilidade [21].
E qual propriedade do mediador redox deve ser empregada? A qu
diminua o potencial de oxidao ou a qu aumente a sensibilidade? A resposta
simples. Ambas. As caractersticas desejveis de um mediador redox so: (i)
transferncia eletrnica rpida entre mediador-analito e mediador-eletrodo, (ii)
potencial formal em baixos sobrepotenciais para evitar a oxidao de possveis
espcies interferentes e (iii) estabilidade das formas oxidada e reduzida [22].
As caractersticas mencionadas j foram exploradas empregando vrios
tipos de mediadores redox destinados para detectar Cys ou NADH como:
quinonas [23-24], complexos de metais de transio [25-26], nanopartculas
metlicas [27-28], corantes [29-30] e etc. No entanto, molculas que apresentam o
grupo funcional nitro (R-NO2) tm se destacado bastante nos ltimos anos como
estratgia para a formao de pares redox que se enquadram nas caractersticas
desejveis para um mediador.
O grupo nitro, no seu estado oxidado, no tem atividade eletrocataltica
para a oxidao de tiis ou NADH [31]. Por outro lado, quando reduzido
eletroquimicamente in situ, o grupo nitro transformado no grupo hidroxilamina. A
hidroxilamina formada pode, assim, ser oxidada para nitroso (par R-NO/R-NHOH),
atravs de um processo redox envolvendo 2e-/2H+, resultando em um par redox
estvel confinado na superfcie do eletrodo, Figura I.4.
Murilo Santhiago
Figura I.4. Esquema da estratgia eletroqumica utilizada para formao do par

redox nitroso/hidroxilamina a partir do grupo nitro.
Uma vez estabelecida a molcula com o seu o par redox, a questo que
deve ser respondida : como ser feita a imobilizao do mediador na superfcie
do eletrodo? Para efetuar o processo de imobilizao a poro R ilustrada na
Figura I.4, que representa o restante da molcula do mediador, normalmente
utilizada para tal processo [32]. No entanto, essa poro R precisa ser combinada
com eletrodos convencionais (ouro, platina e carbono vtreo), que basicamente
so materiais que apresentam poucos grupos funcionais. Enquanto que os
eletrodos
de
ouro
podem
ser
facilmente
funcionalizados
empregando
monocamadas auto-organizadas de tiis, a criao de grupos funcionais nos

eletrodos de carbono muito mais difcil e exige condies drsticas para a
funcionalizao, incluindo: aquecimento sob atmosfera rica em oxignio [33],
aquecimento em meio cido [34] e tratamento eletroqumico em meio cido [35,36]
ou alcalino [37]. Estes mtodos proporcionam a formao de cetonas, cidos
carboxlicos, quinonas e de grupos hidroxila na superfcie [38-39]. Por outro lado, a
9
Murilo Santhiago
quantidade e a natureza desses grupos so muito difceis de serem controlados.

Por esta razo, na modificao da superfcie de carbono, tratamentos oxidativos
so raramente empregados atualmente [40].
Assim, buscando contornar este tipo de problema, a combinao da
poro R do mediador juntamente com materiais nanoestruturados imobilizados
sobre eletrodos convencionais uma abordagem relativamente recente e traz
propriedades interfaciais interessantes [41-42]. Essas nanoestruturas podem
funcionar como uma plataforma para receber os mais variados tipos de
mediadores redox e enzimas [43].
I.5 Nanoestruturas
Nanoestruturas se referem a materiais que apresentam escala de
tamanho na ordem nanomtrica. Uma maneira de classificar as nanoestruturas
baseada nas regies em que os eltrons podem se mover livremente, que
dependem basicamente do formato da nanoestrutura (tubos, partculas, cristais e
etc) [44]. De fato, o tamanho e a forma dessas nanoestruturas podem agregar
novas propriedades e aplicaes que impulsionam o campo da nanocincia e
nanotecnologia. Assim, o estudo de materiais nanoestruturados uma rea ativa
de pesquisa da qumica, fsica, engenharia de materiais e engenharia biomdica
[45].
Nesse sentido, vrias propriedades foram consideradas dependentes do
tamanho de partcula [44]. Materiais formados a partir de partculas nanomtricas
possuem caractersticas incomuns, levando a novos fenmenos que so
realmente surpreendentes. Por exemplo, Gerberich e col. apresentaram em seu
trabalho que nanopartculas individuais de silcio (~40 nm), em temperatura
ambiente, possuem dureza quatro vezes maior quando comparadas com
agregados formados a partir do mesmo elemento [45]. J em relao s
propriedades de nanofios de ZnO, Chen e col. [46] observaram que a elasticidade
destes nanofios aumenta medida que o dimetro do fio reduzido. Outro
enfoque, voltado construo de cermicas mais resistentes, pode ter uma
10
Murilo Santhiago
contribuio de forma direta da nanotecnologia. Blocos de cermica construdos a

partir de gros nanomtricos podem ser moldados em peas de motor ou de
outras formas teis sem quebra durante o processo [44]. Nanofibras formadas a
partir de carbono apresentam uma energia resistente quebra de 570 J/g. O valor
apresentado por si s no to impactante, mas quando comparado com um
material conhecido torna-se notvel. Por exemplo, as nanofibras de carbono so
17 vezes mais duras que as fibras de Kevlar utilizadas em coletes prova de
balas [47]. As fibras tm tambm o dobro da rigidez e 20 vezes a dureza do
mesmo peso de um fio de ao. Como msculos artificiais, fibras de nanotubos de
carbono so cerca de 100 vezes mais fortes do que o msculo natural com o
mesmo dimetro [48].
Fica claro, a partir dos exemplos apresentados, que a nanotecnologia
participa de forma significativa na descoberta de novas propriedades para os
materiais. Dentre os materiais apresentados destacam-se as nanoestruturas de
carbono como material base para a construo de plataformas.
I.6
I.6.1 Carbono
O carbono tem se revelado um material muito prtico e amplamente
utilizado para a confeco de eletrodos devido s suas timas propriedades para
aplicaes eletroqumicas. Eletrodos de carbono fornecem, de maneira geral, boa
condutividade eltrica, elevada estabilidade trmica e qumica, uma ampla janela
de potencial e em muitos casos atividade eletrocataltica. Alm disso, eles so
conhecidos como materiais versteis e de fcil manuseio. Assim, o carbono na
forma de carbono vtreo, fibra de carbono, grafite em p, grafite piroltico e grafite
piroltico altamente ordenado, tem desempenhado por muito tempo um importante
papel no desenvolvimento de eletrodos slidos [49-50]. No entanto, a descoberta
de um novo altropo do carbono sob formato de nanotubos [51] impulsionou de
forma indita aplicaes na eletroqumica e eletroanaltica [52,53].
11
Murilo Santhiago
I.6.2 Sntese, estrutura e propriedades eletrnicas

Os nanotubos de carbono so longos cilindros de tomos de carbono
ligados covalentemente. Esses nanomateriais so usualmente sintetizados por 3
diferentes mtodos: descarga em arco eltrico, ablao por laser e deposio
qumica de vapor [54]. Descarga em arco eltrico e ablao por laser baseiam-se
na condensao de tomos de carbono gerados atravs da evaporao de
amostras de carbono slido. Esses mtodos possuem a desvantagem de operar
em elevadas temperaturas, prximo do ponto de fuso do grafite. No entanto,
ambos os mtodos produzem CNTs de alta qualidade e com poucos defeitos. O
terceiro mtodo, baseado na deposio qumica de vapor, pode ser operado em
temperaturas consideravelmente menores, mas com a desvantagem de formar
nanotubos com mais defeitos quando comparado com as metodologias anteriores.
Neste caso, a formao dos CNTs ocorre como resultado da decomposio
trmica de uma amostra de carbono lquida ou gasosa sobre a superfcie de um
catalisador (nanopartculas de Fe, Co ou Ni) [55]. A Figura I.5 ilustra os dois tipos
de nanotubos de carbono mais sintetizados: nanotubos de carbono de paredes
simples (do ingls SWCNTs) e nanotubos de carbono de paredes mltiplas (do
ingls MWCNTs).
Figura I.5. Nanotubos de carbono de paredes simples (SWCNT) e mltiplas

(MWCNT).
Nem sempre as extremidades dos tubos esto abertas assim como
ilustrado na Figura I.5. De fato, o fechamento das extremidades nos CNTs pode
ser facilmente racionalizada considerando a presena de ligaes pendentes com
12
Murilo Santhiago
alta energia nos limites dos tubos. A energia total de um certo nmero de tomos
de carbono na camada de grafite pode ser reduzida atravs da formao de uma
estrutura fechada que elimina ligaes pendentes, mesmo custa do aumento da
energia de deformao das ligaes [56].
A maneira com que a folha de grafite embrulhada para formar o tubo
pode ser descrita pelo vetor Ch = na1 + ma2 (n , m) que conecta stios
cristalograficamente equivalentes de uma folha de grafite bidimensional, onde a1 e
a2 so os vetores base da folha de grafite (Figura I.6(A)).
Figura I.6. (A) Coordenada dos vetores que definem o empacotamento dos
nanotubos e (B) tipo de estruturas normalmente encontradas.
A Figura I.6(B) mostra os trs diferentes tipos de estruturas dos nanotubos
normalmente encontrados segundo as direes definadas pelo vetor de
empacotamento Ch, brao de cadeira (n = m), quiral (n , m) e zigue-zague (m = 0).
As diferentes estruturas so oriundas de uma mesma folha de grafite, no entanto,
podem apresentar propriedades eletrnicas com comportamento metlico ou
semicondutor [57]. Alm do tipo de estrutura, o dimetro dos nanotubos tambm
afeta as propriedades eletrnicas. O bandgap de nanotubos semicondutores pode
ser aproximado pela relao Eg = 0,8 eV / d, onde d o dimetro do tubo [58,59].
Desta forma, quanto maior o dimetro do CNT, maior a tendncia para um
comportamento metlico. Alm do mais, os CNTs so capazes de conduzir
13
Murilo Santhiago
densidades de corrente muito grandes. Por exemplo, CNTs tm demonstrado

suportar densidades de corrente maiores que 109 A / cm2, um valor que 2 - 3
ordens de magnitude maior que alguns metais como Al ou Cu [60].
Assim, as propriedades eletrnicas mencionadas podem ser atribudas
principalmente devido ao formato desse material. Apesar dos CNTs estarem muito
relacionados com as placas de grafite, a arquitetura do material sob formato de
tubo agrega propriedades nicas que fazem com que os CNTs sejam diferentes
do grafite. Alm das propriedades eletrnicas, as propriedades qumicas tambm
so alteradas devido a forma do material [61].
I.6.3 Propriedades qumicas

Um bom entendimento das propriedades qumicas dos nanotubos de
carbono indispensvel para aumentar a eficincia de dispositivos prticos e
tambm para compreender processos fundamentais. A Figura I.7(a d) mostra as
estruturas e hibridizaes dos tomos de carbono do diamante, grafite, fulereno e
dos nanotubos de carbono. Embora esse materiais sejam feitos a partir do mesmo
elemento bsico, a reatividade qumica substancialmente diferente entre eles. A
reatividade qumica maior para o CNT do que para uma folha de grafite, mas
menor quando comparada com o fulereno [61]. Tal comportamento provavelmente
est relacionado com a curvatura da superfcie da estrutura de carbono. A
reatividade dos fulerenos devido principalmente alta tenso nas ligaes
provocada pela geometria esfrica do material. Essa tenso pode ser avaliada
atravs da frmula p = - 90o onde o ngulo compreendido entre um
orbital e um orbital em um mesmo tomo de carbono e p o ngulo de
piramidalizao. Para um tomo de carbono hibridizado sp2 (trigonal planar), a
planaridade altamente preferida e isto implica em um ngulo de piramidalizao
de p = 0o, ao passo que um tomo de carbono hibridizado sp3 (tetradrico) requer
aproximadamente p = 19,5, assim como ilustrado na Figura I.7(e) e (f). J os
tomos de carbono no fulereno C60 apresentam p = 11,6. A converso qumica
de qualquer tomo trivalente no C60 para um tomo tetravalente alivia a tenso no
14
Murilo Santhiago
ponto em que foi efetuada a converso [61]. Assim, reaes que servem para
saturar os tomos de carbono so aceleradas devido ao alvio da tenso e, com
isso, modificaes no fulereno so altamente favorecidas [62].
Figura I.7. Estrutura e hibridizao dos tomos de carbono para (a) diamante, (b)
grafite, (c) fulereno e (d) nanotubo de carbono. Esquema mostrando os ngulos
entre as ligaes e do tomo de carbono de geometria (e) trigonal planar e (f)
tetradrica.
No caso dos CNTs, a curvatura dos tubos muito menor do que para os
fulerenos e, desta forma, o alvio da tenso nas paredes laterais no oferece a
mesma fora motriz para a reatividade qumica que vivida pelos fulerenos. No
caso do SWCNT, o ngulo de piramidalizao de p = 3,01, menor do que o
ngulo obtido para o fulereno C60. Consequentemente, a tenso local por tomo
15
Murilo Santhiago
de carbono devido curvatura menor para o SWCNT (0,5 kcal / mol) do que
para o fulereno (8,1 kcal / mol) [63]. Ao contrrio das paredes laterais, a
reatividade no final dos tubos muito maior, principalmente quando essas
extremidades estiverem fechadas. Devido presena de anis de 5 ou 7 tomos
de carbono [64], as extremidades fechadas apresentam uma reatividade similar ao
do fulereno, assim como demonstrado anteriormente. Por exemplo, quando os
nanotubos de carbono so submetidos a um tratamento com cidos e oxidantes
fortes so gerados principalmente grupos funcionais cidos carboxlicos e cetonas
nas extremidades [64]. Uma vez formados, esses grupos podem permitir a
imobilizao
de
biomolculas
tambm
influenciar
nas
propriedades
eletroqumicas.
I.6.4 Propriedades eletroqumicas

De maneira geral, a performance eletroqumica de materiais de carbono
basicamente determinada pelas propriedades eletrnicas, pela sua estrutura e
qumica superficial (grupos funcionais terminais ou processos de adsoro). Tais
caractersticas podero afetar a cintica do eletrodo, janela eletroqumica de
potencial, corrente capacitiva e a interao com molculas em soluo [56].
Algumas das propriedades eletroqumicas dos nanotubos de carbono tm
sido relacionadas com as propriedades do grafite piroltico altamente ordenado (do
ingls HOPG). J sabido que a condutividade eletrnica no plano paralelo das
camadas de grafite (plano basal) cerca de 4 ordens de magnitude maior do que
no plano perpendicular (plano edge) [49]. O plano basal do HOPG, ilustrado na
Figura I.8, ordenado e quimicamente mais inerte do que o plano edge. Tal
anisotropia tambm influencia o comportamento eletroqumico do material. J foi
demonstrado que o plano basal exibe uma cintica de transferncia eletrnica
lenta enquanto que os stios localizados no plano edge favorecem o processo
redox [65].
16
Murilo Santhiago
Figura I.8. Representao esquemtica das folhas do HOPG incluindo as

indicaes dos planos basal e edge.
As extremidades abertas dos CNTs tm sido relacionadas com o plano
edge do HOPG, ao passo que as paredes do tubo devem apresentar propriedades
eletroqumicas similares ao do plano basal do mesmo material [65-67]. Grupos
funcionais presentes nas extremidades dos tubos podem desempenhar um papel
importante nas propriedades eletrocatalticas, aumentando a cintica de
transferncia de eltrons ou contribuindo em processos de adsoro.
A adsoro outro fator relevante que afeta a performance eletroqumica
dos CNTs. O processo de adsoro pode aumentar ou diminuir fortemente a
cintica de transferncia de eltrons e a atividade eletrocataltica. Um dos
aspectos negativos pode ser observado quando a adsoro de espcies
(impurezas ou produtos de reaes redox) diminui drasticamente a performance
eletroqumica dos eletrodos. J um dos aspectos positivos se refere adsoro de
metaloprotenas. Os CNTs facilitam a troca de eltrons entre o centro redox da
protena e a superfcie do eletrodo, permitindo assim que a atividade
eletrocataltica seja monitorada [50].
Outra propriedade dos CNTs que eles apresentam uma elevada rea
superficial que traz benefcios no s para aumentar as correntes eletroqumicas
das espcies eletroativas, mas tambm permitir que enzimas, antgenos,
anticorpos e mediadores redox sejam imobilizados em sua estrutura. Nesse
sentido, inmeras estratgias tm sido adotadas para permitir que tais processos
ocorram [68].
17
Murilo Santhiago
I.6.5 Funcionalizao dos nanotubos

A modificao dos CNTs surge como motivao de extremo interesse
porque abre uma gama de possibilidades para desenvolver novos dispositivos que
unem as propriedades dos CNTs juntamente com as versatilidades geradas pelo
processo de funcionalizao. Alm disso, a modificao qumica tambm ajuda
contornar um dos problemas encontrados na manipulao de CNTs que a
dificuldade de dispersar os nanotubos, principalmente em meio aquoso. No
sentido de facilitar a disperso em gua e principalmente possibilitar a unio de
novas propriedades destacam-se as modificaes covalentes e no-covalentes
nos CNTs [68].
I.6.5.1 Modificao covalente

Assim como mencionado no tpico 1.6.3, as extremidades dos CNTs so
quimicamente mais reativas do que as paredes laterais. Quando as extremidades
dos tubos esto abertas, as ligaes pendentes tornam-se muitos reativas na
presena de gua ou oxignio e normalmente esta regio rica em grupos
funcionais derivados do tomo de oxignio (quinonas, cetonas e cidos
carboxlicos). Adicionalmente, as extremidades fechadas e defeitos na estrutura
dos CNTs podem ser funcionalizadas tratando os CNTs com cidos e oxidantes
fortes (HNO3, H2SO4 e H2O2) [69]. Aps o tratamento, dentre os grupos funcionais
obtidos, um de interesse especial o grupo R-COOH. Os resduos de R-COOH
nas extremidades tornam-se stios teis para a intercalao de outras molculas
atravs da formao de ligaes amida ou ster [69,70].
O esquema ilustrado na Figura I.9 mostra as reaes de modificao
covalente empregadas para modificar as extremidades e as paredes laterais dos
nanotubos de carbono. Na Figura I.9(A) podem ser observadas as estratgias
frequentemente utilizadas para a modificao das extremidades/defeitos dos
CNTs explorando a versatilidade dos grupos R-COOH. A formao de uma ligao
amida pode ser conduzida na presena de uma amina aps ativao dos grupos
18
Murilo Santhiago
R-COOH com 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodimida (EDC) e N-hidroxi

succinimida (NHS) ou com cloreto de tionila (SOCl2). A ativao do grupo RCOOH com SOCl2 permite ainda que molculas contendo o grupo funcional lcool
(R-OH) sejam tambm conectadas nos CNTs [68].
Figura I.9. Esquema ilustrando os tipos mais comuns de reaes covalentes nas
extremidades/defeitos e nas paredes laterais dos CNTs.
Por outro lado, a reatividade das paredes laterais dos CNTs aumenta com
a curvatura do tubo devido principalmente ao aumento do ngulo de
piramidalizao [61]. A reatividade da superfcie , portanto, reforada pela
exposio acentuada dos orbitais hbridos que ficam na parte externa do tubo,
favorecendo a sobreposio de orbitais com reagentes que se aproximam da
superfcie [71].
Desta forma, a Figura I.9(B) ilustra alguns exemplos de reaes que
podem ser utilizadas empregando as paredes laterais dos nanotubos de carbono.
Molculas derivadas do aminobenzeno podem ser convertidas em sais de
diaznio e posteriormente ancoradas nos CNTs [72]. J quando aquecidos na
19
Murilo Santhiago
presena de F2, so formadas ligaes C F nas paredes laterais dos CNTs. Esse
tipo de intermedirio altamente interessante sntese orgnica, possibilitando
reaes com reagentes de Grignard e tambm com ons alcxido [73]. A ligao
covalente dos CNTs com polmeros ganha destaque, principalmente, por causa da
longa cadeia polimrica que ajuda a dispersar os nanotubos em uma gama de
solventes orgnicos ou aquosos. Uma das rotas utiliza os monmeros juntamente
com os CNTs na sntese, com isso, o polmero conectado covalentemente e
polimerizado sobre o nanomaterial. Dessa forma, j foram reportados trabalhos
com polivinilpiridina, poliestirenossulfonato (Figura I.9(B)), poli(metilmetacrilato) e
polianilina [74].
As modificaes covalentes apresentadas resultam em coneces
nanotubo-molcula alvo efetivas e muito estveis. No entanto, alguns pontos
negativos aparecem tona nesse tipo de modificao. A grande densidade de
stios reativos ou pontos funcionalizados covalentemente podem trazer uma perda
da rede de conjugao e uma degradao das propriedades mecnicas e
eletrnicas do CNTs [57]. Assim, as modificaes no-covalentes ganham
destaque na funcionalizao de CNTs.
I.6.5.2 Modificao no-covalente

A grande rea superficial constituda por um sistema de eltrons
deslocalizados e com carter hidrofbico tornam os CNTs superfcies ideais para
interaes no-covalentes com molculas via interaes de Van de Waals, - ou
hidrofbicas [74].
Existem muitos exemplos na literatura de modificaes no-covalentes
nos CNTs com agentes capazes de promover o desprendimento dos CNTs e fazlos mais solveis e biocompatveis. Exemplos de tais agentes so alguns
surfactantes como dodecilsulfato de sdio [75] ou dodecilbenzeno sulfonato de
sdio [76]. Outros exemplos esto ilustrados na Figura I.10 e incluem
modificaes com protenas (Figura I.10(A)), polmeros (polivinilpirrolidona [77],
poliestirenosulfonato de sdio [78], DNA [79], polissacardeos [80] e etc.) e
20
Murilo Santhiago
compostos poliaromticos como os pirenos modificados com grupos funcionais

(Figura I.10(B)) que envolvem os CNTs servindo como uma espcie de casaco, de
forma que as pores hidrofbicas interagem com a parede do tubo enquanto que
as pores hidroflicas interagem com o meio aquoso [56].
Figura I.10. Representao esquemtica das modificaes no-covalentes nos

CNTs. (A) Adsoro de polmeros, DNA ou protenas e (B) exemplos de algumas
modificaes covalentes aps imobilizao de pirenos contendo grupos funcionais
(GF).
Em alguns casos, polmeros como o PEG e Triton-100 no so utilizados
para criar pontos que possibilitam a imobilizao de molculas, pelo contrrio, so
utilizados para evitar ligaes no-especficas de protenas quando se visa o
desenvolvimento de biossensores [81].
Em decorrncia do processo de funcionalizao, tanto covalente quanto
no-covalente, existe ainda a possibilidade da combinao com outros
21
Murilo Santhiago
nanomaterias a fim de tentar trazer novas propriedades e/ou fornecer um

ambiente favorvel que possibilite a imobilizao de outros tipos de mediadores
redox ou biomolculas.
I.7 Nanopartculas de ouro

Nanopartculas de ouro (NPAus) possuem propriedades pticas e
eletrnicas que esto relacionadas com seu tamanho e formato e so, portanto, de
grande interesse em muitas aplicaes nanotecnolgicas [82]. Apesar do
crescimento recente buscando novas aplicaes das NPAus, esse nanomaterial j
se encontra disponvel por mais de 50 anos. A sntese de NPAus estabilizadas por
ons citrato foi reportada em 1950 por Turkevich e col. [83] e em 1973 por Frens
[84]. Os agentes estabilizantes, alm de permitir o uso das NPAus por semanas
[85], servem como ponto de partida quando se deseja imobilizar esse
nanomaterial em uma determinada superfcie.
A Figura I.11 mostra um desenho esquemtico dos tipos de rotas mais
utilizadas visando ampliar as aplicaes das NPAus. Uma das maneiras mais
simples de se modificar uma superfcie utiliza as propriedades eletrostticas como
fora motriz para que o processo ocorra. A Figura I.11(A) ilustra um exemplo de
uma nanopartcula carregada negativamente atrada para uma superfcie com
carga oposta. Este tipo de procedimento permite que inmeros materiais possam
ser modificados com as NPAus, no entanto, algumas superfcies precisam de um
pr-tratamento. O pr-tretamento pode incluir desde a aplicao de um elevado
sobrepotencial positivo quando o material em questo o eletrodo de carbono
vtreo [86] ou ainda, em outros casos, utilizar a qumica de superfcie para criar
grupos funcionais que possam ser protonados [87].
Uma segunda abordagem, e talvez a mais elegante, utiliza o modelo de
Pearson [88] como inspirao para a funcionalizao de nanopartculas de ouro. A
tabela construda por Pearson prev que o grupo tiol (R-SH) deve interagir
fortemente com ouro metlico e, desta forma, as NPAus podem ser
22
Murilo Santhiago
funcionalizadas e estabilizadas com inmeras molculas derivadas do tomo de

enxofre.
Figura I.11. Desenho esquemtico das rotas mais utilizadas para a imobilizao
de NPAus por: (A) atrao eletrosttica, (B) adsoro de tiis e (C) adsoro de
polictions.
A Figura I.11(B) ilustra de forma simplificada a substituio de ons citrato
por alcanotiis, exemplo na qual foi desenvolvido primeiramente em 1993 por
Giersig e Mulvaney [89]. Atualmente, a formao de monocamadas autoorganizadas (do ingls SAMs) utilizando tiis ou dissulfetos permite a criao dos
mais variados tipos de funcionalidades alterando somente o grupo terminal da
molcula [90,91].
Assim como na utilizao de tiis, outro exemplo que permite a
funcionalizao e estabilizao de nanopartculas de ouro se refere ao emprego
de polmeros. Existem basicamente duas maneiras de se obter nanopartculas
modificadas com polmeros. A primeira consiste na sntese das NPAus na
23
Murilo Santhiago
presena da rede polimrica [92] e a segunda, menos empregada, envolve a

polimerizao ao redor das nanopartculas [93].
I.8 Motivao
O presente trabalho teve como principal motivao unir as propriedades
de mediadores redox derivados do grupo nitro juntamente com plataformas
nanoestruturadas formadas base de nanotubos de carbono. Nesse sentido
busca-se o desenvolvimento de sensores
amperomtricos
sensibilidade
atividade
eletrocataltica,
com elevada
principalmente,
aplicando
sobrepotenciais baixos. Para possibilitar a unio de propriedades, molculas foram

selecionadas cuidadosamente para apresentar trs caractersticas marcantes:
(I) presena de um grupo funcional que possibilite a imobilizao na interface da
plataforma;
(II) grupo funcional retirador de eltrons ligado diretamente no anel aromtico do
mediador;
(III) grupo nitro, que serve como precursor para a formao in situ do par nitrosohidroxilamina.
I.9 Objetivos
I.9.1 Geral
Este trabalho de pesquisa visa o desenvolvimento de sensores
amperomtricos empregando mediadores redox derivados do grupo nitro
imobilizados sobre plataformas nanoestruturadas.
24
Murilo Santhiago
I.9.2 Especficos
* Construir dois sensores amperomtricos, um destinado para a deteco de
NADH e outro para a Cys.
* Caracterizar as plataformas utilizando o MEV e ensaios eletroqumicos.
* Obter as constantes cinticas das reaes interfaciais.
* Fazer a caracterizao analtica dos sensores.
* Aplicar os sensores desenvolvidos.
25
Murilo Santhiago
CAPTULO II
PARTE EXPERIMENTAL
27
Murilo Santhiago
II.1 Parte experimental

II.1.2 Reagentes e solues
A L-cistena, NADH, MWCNTs (dimetro interno 2-10 nm e comprimento
0,1 20 m), cido 5,5ditiobis2nitrobenzoico (DTNB), cido ctrico,
PIPES
[piperazinaNNbis
[(cido
2etanosulfnico)],
HEPES
[N(2hidroxietil)piperazinaN(cido 2etanosulfnico)], TRIS [tris(hidroximetil)

amino-metano], nanopartculas de ouro (10 nm, concentrao ~0,05% em citrato
como estabilizante), polietilenoimina (PEI), cido 3,5-dinitrobenzoico (3,5-DNB), 1etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodimida (EDC), catecol, dopamina, L-Dopa,
epinefrina, cido clorognico, cido cafico, N-hidroxi succinimida (NHS),
ferrocianeto e ferricianeto de potssio foram obtidos da Sigma, St. Louis, USA.
NN dimetil formamida (DMF), dihidrogenofosfato de sdio (NaH2PO4), hidrogeno
fosfato de sdio (Na2HPO4), cloreto de potssio (KCl) e etanol foram obtidos da
Synth, So Paulo, Brasil.
As solues foram preparadas usando gua purificada em um sistema
Milli-Q Millipore e os valores de pH das solues tampo foram ajustados com um
pHmetro Corning, modelo 350.
II.1.3 Equipamentos
A deteco voltamtrica e cronoamperomtrica foi obtida empregando um
potenciostato modelo PGSTAT-30 da Autolab Eco Chemie (Utrecht, Holanda)
conectado um computador utilizando um programa computacional GPES 4.9.
Uma clula eletroqumica com capacidade para trs eletrodos foi utilizada com um
eletrodo de calomelano saturado como referncia, um fio de platina como eletrodo
auxiliar e o eletrodo de trabalho de carbono vtreo (Figura II.1). Para homogeneizar
a soluo do eletrlito de suporte aps a adio do analitos (Cys ou NADH) foi
utilizado um agitador magntico da marca Corning com 6 modos de velocidades. A
clula eletroqumica possui tambm um local para entrada de N2, que serve para
29
Murilo Santhiago
remover o oxignio dissolvido.

Os experimentos utilizando o eletrodo de disco rotatrio foram conduzidos
por um equipamento de controle de rotao da Autolab com amperagem mxima
de 500 mA acoplado ao ECV.
Para o preparo das disperses e limpeza do ECV foi utilizado um banho
de ultra-som da marca UNIQUE modelo USC-1400.
Uma balana analtica Sartorius BP 211D, de 5 casas decimais, foi
utilizada para pesar os reagentes.
Figura II.1. Esquema ilustrando a clula eletroqumica com capacidade para trs
eletrodos (ECV = eletrodo de carbono vtreo (forma de disco), ECS = eletrodo de
calomelano saturado e Pt = eletrodo auxiliar) e um local para a entrada de N2.
II.1.4 Limpeza do eletrodo de trabalho

O procedimento geral do pr-tratamento do eletrodo de carbono vtreo
(ECV) descrito a seguir. Antes das modificaes, o eletrodo de trabalho foi
polido com uma pasta de alumina de 1,0, 0,5 e 0,3 m para obter uma superfcie
30
Murilo Santhiago
espelhada e ento o eletrodo foi lavado com gua destilada. O ECV foi levado ao
ultra-som em uma soluo 1:1 (v/v) etanol/gua por 5 minutos para remover
possveis partculas de alumina adsorvidas na superfcie do eletrodo.
II.1.5 Sensor para Cys (Sen-Cys)

Inicialmente, 1,0 mg de MWCNTs foram dispersos em 5 mL de DMF
utilizando um banho de ultra-som. As solues de PEI (0,1 4%) foram
preparadas dissolvendo o polmero em gua deionizada. A soluo contendo as
nanopartculas de ouro foram utilizadas assim como foram recebidas, sem
nenhuma diluio.
No ECV limpo de 0,2 cm2 foram adicionadas alquotas da disperso dos
MWCNTs (5 30 L) e em seguida a superfcie foi seca sob atmosfera de
nitrognio. Aps uma lavagem com gua, o eletrodo foi imerso em uma soluo de
PEI (0,1 4%) por 1 h e ento lavado com gua novamente. Ento, o eletrodo foi
imerso na soluo de nanopartculas de ouro por mais 1 h a 4oC e em seguida a
superfcie
foi
lavada
novamente
com
gua.
Finalmente,
plataforma
-1
nanoestruturada foi imersa em uma soluo etanlica (5 50 mmol L ) do cido

5,5-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) por 15 h e aps este perodo a superfcie foi
lavada com etanol e depois gua.
As espcies hidroxilamina foram eletrogeradas in situ a partir do DTNB
aps ciclar o potencial entre 0,1 e -0,7 V versus ECS. Dois ciclos em soluo
tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 com velocidade de varredura de 0,1 V s-1 foram
suficientes para gerar o grupo hidroxilamina.
A rea eletroativa do eletrodo modificado foi obtida utilizando 1 mmol L-1
Fe[(CN)6]3/4 em 0,1 mol L-1 KCl empregando a equao de Randles Sevcik [19].
Assim, a rea eletroativa foi de aproximadamente 0,640 cm2.
31
Murilo Santhiago
II.1.5.1 Planejamento fatorial

Para otimizar a composio da interface do Sen-CyS um planejamento
fatorial completo em duplicata e a matriz de Doehlert foram utilizados. A influncia
da quantidade dos MWCNTs (5 30 L), PEI (0,1 4,0 %) e DTNB (5 50 mmol
L-1) foram examinadas utilizando um planejamento 23 completo. A matriz de
Doehlert foi empregada para otimizar os efeitos mais importantes. Os
experimentos foram feitos em duplicata, com exceo para o ponto central onde
foram realizadas 3 replicatas. A partir destes resultados foi obtida a superfcie de
resposta
gerada
pelo
programa
computacional
STATISTICA.
Todos
os
experimentos foram realizados em ordem aleatria monitorando a corrente de pico

andica dos voltamogramas cclicos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 e =
100 mV s-1.
II.1.6 Sensor para NADH (Sen-NADH)

A disperso dos MWCNTs com o PEI foi obtida da seguinte forma: 1,0 mg
de MWCNT foi misturado com 1,0 mL de uma soluo de PEI 1,0 mg mL-1 e em
seguida a mistura foi colocada no ultra-som por 15 min assim como reportado por
Rubanes e Rivas [94].
No ECV limpo com rea geomtrica de 0,07 cm2 foi adicionado 5 L da
disperso MWCNT/PEI e ento a superfcie foi seca sob atmosfera de nitrognio.
Aps a montagem da plataforma, o eletrodo foi imerso em 5 mL de etanol
contendo 4,6 mg de NHS, 4,8 mg de EDC e 10,0 mg do mediador redox (cido
3,5-DNB) por 1,5 h. O tempo reacional de imobilizao do mediador redox foi
determinado fazendo medidas da corrente de pico andica (Ipa) do par redox RNO/R-NHOH a cada 30 minutos em um perodo total de 3,0 h.
As espcies hidroxilamina foram eletrogeradas in situ a partir do cido 3,5DNB aps ciclar o potencial entre 0,15 e -0,55 V versus ECS. Dois ciclos em
soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 com velocidade de varredura de 0,05 V
s-1 foram suficientes para gerar o grupo hidroxilamina.
32
Murilo Santhiago
A rea eletroativa do eletrodo modificado foi estimada assim como

reportado anteriormente [95] utilizando 1 mmol L-1 Fe[(CN)6]3/4 em 0,1 mol L-1
KCl empregando a teoria de Randles Sevcik [19]. Assim, a rea eletroativa foi de
aproximadamente 0,250 cm2.
II.1.7 Micrografias
As micrografias foram obtidas utilizando um microscpio eletrnico de
varredura (MEV) JEOL JSM-5610LV. As amostras foram preparadas sobre
suportes (porta amostras) utilizando as mesmas condies empregadas nos itens
II.1.5 e II.1.6. As micrografias foram obtidas empregando as condies otimizadas
na construo dos sensores.
II.1.8 Preparo das amostras

Para a anlise cronoamperomtrica, as amostras de suplemento alimentar
foram preparadas dissolvendo 3 cpsulas de 500 mg em 1000 mL de gua
deionizada e ento a soluo foi filtrada com o auxlio de um papel de filtro
quantitativo. Aps esta etapa, uma alquota de 1 mL da soluo filtrada foi diluda
para 10 mL. Finalmente, 500 L desta soluo foram adicionados em uma cela
eletroqumica contendo 5 mL de uma soluo tampo fosfato (PBS) 0,1 mol L-1 pH
7,0.
Para as medidas espectrofotomtricas, 500 L da soluo da amostra
foram misturadas com 2 mL de DTNB. Outras etapas, foram realizadas de acordo
com o procedimento j reportado [96], que baseada na reao da Cys com o
DTNB, sendo o produto desta reao monitorado espectrofotometricamente em
412 nm.
33
Murilo Santhiago
II.1.9
Estudo de repetibilidade, estabilidade e tempo de vida do
sensor
A estabilidade dos sensores foi avaliada fazendo 15 medidas sucessivas,
sem renovar a superfcie, e as respostas ao final dos experimentos foram ento
comparadas. O tempo de vida dos sensores foi avaliado fazendo medidas a cada
1-2 dias, totalizando 100 determinaes.
Para
avaliar
repetibilidade
das
medidas,
foram
realizadas
determinaes sucessivas dos analitos selecionados. A interface foi construda 8

vezes seguindo o mesmo procedimento descrito na parte experimental e, atravs
de medidas cronoamperomtricas, foi obtido o desvio padro de construo do
sensor.
34
Murilo Santhiago
CAPTULO III
SENSOR PARA CISTENA
35
Murilo Santhiago
III.1 Apresentao do captulo

Neste captulo sero apresentados os resultados referentes construo,
caracterizao, estudo das propriedades eletrocatalticas e aplicao do sensor
destinado a deteco de cistena em amostras de interesse farmacolgico.
Inicialmente, a otimizao do processo de construo da plataforma ser
abordada visando obter a maior resposta na construo do sensor. Em seguida,
sero discutidos ensaios de caracterizao por microscopia eletrnica de
varredura
tambm
caracterizaes
eletroqumicas
do
par
redox
nitroso/hidroxilamina formado a partir do mediador redox DTNB (Figura III.1). A fim

de ressaltar a atividade eletrocataltica do mediador redox utilizado aqui sero
apresentados voltamogramas cclicos que mostram o efeito de cada etapa da
construo do sensor na eletrooxidao de cistena. Sero apresentados tambm
resultados obtidos por cronoamperometria que, alm de fornecerem indcios de
uma reao qumica acoplada, permitem a obteno da constante cintica (kobs)
da reao qumica entre o mediador e o analito. Por fim, sero discutidos os
resultados referentes aplicao do sensor em amostras reais.
H
O
O O
N O
O
N O
O H
S
S
Figura III.1. Frmula estrutural do cido 5,5-ditio-2-nitrobenzoico (DTNB).
37
Murilo Santhiago
III.2
III.2.1 Planejamento fatorial

A fim de otimizar a preparao da plataforma do Sen-Cys, fatores
considerados importantes do sistema foram analisados por meio de planejamento
fatorial completo 23, o que significa 8 experimentos em duplicata. Estes fatores
foram: concentrao dos MWCNTs (5 30 L), PEI (0,1 4,0%) e do DTNB (5
50 mmol L-1). Os valores entre parnteses representam os nveis mnimo e
mximo para cada varivel estudada. A significncia dos fatores bem como as
interaes entre os mesmos foi avaliada e representada pelo diagrama de Pareto
(Figura III.2(A)) com intervalo de confiana igual a 95%.
Figura III.2. Diagrama de Pareto (A) e superfcies de resposta para PEI DTNB
(B), MWCNTs PEI (C) e MWCNTs DTNB (D).
39
Murilo Santhiago
possvel observar na Figura III.2(A) que os efeitos principais da

concentrao do DTNB e PEI assim como o efeito de interao MWCNTs-PEI
foram os efeitos mais significativos e que os mesmos deveriam ser estudados em
maiores nveis, j que os valores dos efeitos foram positivos. Sendo assim, uma
matriz de Doehlert para 3 variveis experimentais j bem estabelecida [97] foi
empregada e gerou as superfcies de resposta mostradas na Figura. III.2(B - D).
Analisando as superfcies de resposta ilustradas na Figura III.2(B - D), as
condies timas dentro do domnio experimental que geraram a maior corrente
de pico foram determinadas. Estas condies so: 20 L de MWCNTs, 2,2 % de
PEI e 30 mmol L-1 da soluo do mediador redox DTNB.
III.2.2 Caracterizao da plataforma por MEV

As micrografias do MEV da superfcie modificada nas condies
otimizadas com MWCNTs (A), MWCNTs+PEI (B), MWCNTs+PEI+NPAu (C) e
MWCNTs+PEI+NPAu+DTNB (D) podem ser observados na Figura III.3.
A micrografia da Figura III.3(A) mostra um comportamento tpico de
distribuio de MWCNTs sem qualquer tipo de modificao. No entanto, aps a
adio do polmero, pode ser observado claramente na Figura III.3(B) que os
nanotubos foram funcionalizados pelo polmero em torno de sua extenso. Em
algumas regies pode se observar tambm um excesso de polmero mesmo aps
vrias etapas de lavagem. Na micrografia da Figura III.3(C) no se observa uma
mudana significativa na morfologia do material aps a modificao com as NPAu.
No entanto, a caracterizao de uma superfcie de ouro pode ser obtida atravs da
obteno de uma resposta eletroqumica em meio cido. Assim, aps a
modificao com as NPAu, foi registrado um voltamograma cclico em uma
soluo 0,5 mol L-1 de cido sulfrico na faixa de potencial de 0,1 at 1,4 V. Como
pode ser visto no grfico inserido na Figura III.3(C), o pico que aparece em torno
de 0,9 V na varredura reversa caracterstico de uma reduo do xido de ouro
[98]. Assim, a plataforma nanoestruturada possui um perfil eletroqumico
caracterstico que permite a formao de uma SAM com o DTNB.
40
Murilo Santhiago
Figura III.3. Micrografias da superfcie nas etapas de construo do sensor: (A)

MWCNTs, (B) A+PEI, (C) B+NPAu e (D) C+DTNB. Grfico inserido: voltamograma
cclico em H2SO4 0,5 mol L-1 e = 100 mV s-1.
Na micrografia da Figura III.3(D) pode ser observado que aps a formao
SAM houve uma alterao na morfologia do material, indicando que o mediador
redox foi imobilizado na superfcie da plataforma. Pode-se observar no canto
superior esquerdo da mesma Figura um excesso de mediador mesmo aps a
lavagem da superfcie com etanol e gua.
III.2.3 Ativao e caracterizao do par redox

Aps a formao da SAM, o par redox R-NO/R-NHOH foi eletrogerado in
situ a partir do DTNB ancorado na superfcie da plataforma nanoestruturada
atravs de uma ciclagem do potencial entre 0,1 e -0,7 V em uma soluo tampo
41
Murilo Santhiago
fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0. A Figura III.4 mostra os voltamogramas cclicos obtidos
no processo de ativao nas condies otimizadas. Como pode ser observado na
Figura III.4, no primeiro ciclo o grupo nitro reduzido irreversivelmente para RNHOH e oxidado para R-NO na varredura reversa. No segundo ciclo possvel
observar um pico de reduo em torno de 0,07 V versus ECS referente a
reduo de R-NO para R-NHOH.
Figura III.4. Processo de ativao do mediador redox obtido em soluo tampo

fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 e = 100 mV s-1.
Aps o processo de ativao, a faixa de potencial ao redor do par redox foi
selecionada e foram obtidos voltamogramas cclicos em vrias velocidades de
varredura (10 - 600 mV s-1) mostrados na Figura III.5. Nesta mesma Figura podem
ser observados voltamogramas cclicos bem definidos e persistentes indicando
que o DTNB foi ligado com sucesso na superfcie da plataforma. A Figura III.5(A)
mostra um grfico da corrente de pico em funo da velocidade de varredura
obtidos a partir dos voltamogramas cclicos. O grfico da corrente de pico andica
42
Murilo Santhiago
e catdica apresentou comportamento linear em funo da velocidade de

varredura indicando assim que o DTNB-ativado mostra um comportamento
eletroqumico caracterstico de espcies redox que esto confinadas na superfcie
do eletrodo [19].
Laviron formulou expresses para a voltametria de varredura linear para o
caso de espcies eletroativas confinadas na superfcie do eletrodo [99]. O grfico
de Laviron pode ser obtido medindo-se E (definido como Ep Eo ; Ep o
potencial de pico do processo andico e catdico, e Eo o potencial formal) em
funo do log da velocidade de varredura (). Seguindo a Teoria, o coeficiente de
transferncia de eltrons () e a constante de velocidade heterognea de
transferncia de eltrons (ks) podem ser calculados empregando as Equaes III.1
e III.2 quando Ep > 200/n mV:
/(1 ) = a/c
(Eq. III.1)
ks = nFc/RT = (1 )nFa/RT
(Eq. III.2)
onde F a constant de Faraday, n o nmero de eltrons, RT apresentam seus

valores usuais, e a e c representam as velocidades de varredura no intercepto
das linhas retas do processo andico e catdico, respectivamente. Como pode ser
visto na Figura III.5(B) quando ( 0) o E praticamente independente do log
da velocidade de varredura sugerindo uma cintica de transferncia eletrnica
rpida. No entanto, quando ( ) a separao dos picos comea a aumentar,
indicando que uma limitao em decorrncia da cintica de transferncia de carga
est ocorrendo. Assim como previsto por Laviron [99] e podendo ser observado na
Figura III.5(B), para elevadas velocidades de varredura, os valores de E foram
proporcionais ao log da velocidade de varredura.
A partir da extrapolao das retas para E = 0 o valor de = 0,5 foi obtido
empregando a Equao III.1. Utilizando o coeficiente angular das retas para
ambos os processos andico 2,3RT/(1-)nF e catdico -2,3RT/nF o valor de n =
43
Murilo Santhiago
1,94 foi encontrado. O valor obtido est prximo do valor esperado de 2 eltrons
para o processo redox nitroso/hidroxilamina [100].
Figura III.5. Voltamogramas cclicos do eletrodo modificado com o DTNB-ativado

em vrias velocidades de varredura (10 600 mV s-1). (A) Grfico de Ip vs. . (B)
Grfico de Laviron.
Alm disso, utilizando a Equao III.2, a ks foi calculada empregando as

velocidades de varredura onde E = 0 (linha horizontal na Figura III.5(B))
apresentando um um valor de 43 s-1. O valor obtido para a constante maior do
que muitos trabalhos j reportados, com excesso para o eletrodo modificado
contendo riboflavina [101] (Tabela III.1). Uma das justificadas para a rpida
44
Murilo Santhiago
comunicao eletrnica DTNB-eletrodo deve estar relacionada com a presena

dos nanotubos de carbono, que atravs do seu sistema , funcionam como uma
espcie de ponte na transferncia de eltrons. Sendo assim, a comunicao
eletrnica entre os stios redox ativos do mediador redox e a superfcie do ECV
rpida, garantido que a etapa mediada no est limitando o processo que ocorre
na interface da plataforma.
Tabela III.1. Parmetros eletroqumicos e cinticos de alguns eletrodos

modificados com alguns mediadores redox.
ks (s-1)
Riboflavina [101]
0,58
1,9
45,9
4-Nitroftalonitrila [102]
0,5
2,3
9,7
Nitrofluorenona [103]
4,5
Violeta de pirocatecol [104]
0,49
5,3
1,4-dihidroxiantraquinona [24]
0,66
4,5
cido clorognico [105]
0,44
2,0
8,6
Ftalocianina Fe(II) + porfirina Fe(III) [106]
0,50
3,8
Tetrabromo-p-benzoquinona [107]
0,55
2,0
3,8
Azul de meldola [108]
0,51
5,3
Catalisador de Doyle [109]
0,22
17,0
Este trabalho
0,5
1,9
43,0
Mediadores redox
Aps as caracterizaes em funo da velocidade de varredura foram

feitos experimentos modificando o pH da soluo. Como os stios redox so
derivados do grupo R-NO/R-NHOH, a reao redox que ocorre na superfcie da
plataforma pode ser antecipada como sendo dependente do pH. O perfil
voltamtrico do eletrodo modificado com o DTNB-ativado foi caracterizado em
vrios pHs (5,0 a 8,0) por voltametria cclica. A Figura III.6 mostra os grficos da
corrente de pico andica e do potencial formal em funo do pH em soluo
45
Murilo Santhiago
tampo fosfato 0,1 mol L-1. O coeficiente angular da reta ilustrada na Figura
III.6(A) foi de 57,5 mV/pH na faixa de pH estudada. Este coeficiente angular
muito prximo para reaes onde a razo e/H+ igual a um (59,2 (np/n)) mV / pH,
onde np = n a 25 C [110]. Assim, o nmero de prtons deve ser tambm 2 porque
o mesmo valor foi encontrado atravs do mtodo de Laviron para o nmero de
eltrons. Adicionalmente, em pH 7,0 a corrente de pico andica apresentou o
maior valor (Figura III.6(B)).
Figura III.6. Influncia do pH da soluo no potencial formal (A) e na corrente de

pico (B) do mediador redox a partir de voltamogramas cclicos registrados em
soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 e = 100 mV s-1.
Os valores de Ep (Epa Epc) em funo do pH da soluo tambm foram
avaliados (Figura III.7) empregando os resultados obtidos por voltametria cclica.
Este parmetro permaneceu praticamente constante at pH 7,0 e ento comeou
a aumentar, trazendo indcios de que uma limitao do processo redox est
ocorrendo quando o meio fica alcalino.
46
Murilo Santhiago
Figura III.7. Grfico de Ep versus pH.
III.2.4 Atividade eletrocataltica da plataforma nanoestruturada

A construo de plataformas nanoestruturadas visando melhoria dos
processos interfaciais pode trazer inmeras vantagens ao sensor. Desta forma,
alguns nanomateriais so to bem arquitetados que por si s j apresentam
propriedades eletrocatalticas. Os nanotubos de carbono, por exemplo, possuem
propriedades eletrocatalticas para a oxidao do NADH e Cys ilustradas em
alguns trabalhos da literatura [111,112]. Assim, para ilustrar a eficincia do
mediador redox na superfcie da plataforma, foram obtidos voltamogramas cclicos
na presena de Cys aps cada etapa envolvida no procedimento de construo do
sensor. O processo associado com a oxidao eletroqumica do analito pode ser
observado nos voltamogramas cclicos da Figura III.8.
47
Murilo Santhiago
Figura III.8. Voltamogramas cclicos obtidos em soluo tampo fosfato 0,1 mol
L-1 pH 7,0 na presena de Cys 1,010-4 mol L-1 em 2 mV s-1 () para (A) ECV,
(B) +MWCNTs, (C) +PEI, (D) +NPAu, (E) +DTNB-ativado e (----) na ausncia de
Cys, respectivamente.
Como pode ser observado na Figura III.8(A), utilizando o ECV sem
nenhuma modificao a oxidao da Cys ocorre em um potencial muito positivo
(550 mV) e com um incremento de corrente baixo. Por outro lado, quando o ECV
foi modificado com os MWCNTs (Figura III.8(B)) foi observado uma diminuio de
aproximadamente 130 mV no potencial de oxidao da Cys. Aps a modificao
com o polmero e as NPAus (Figuras III.8(C) e (D) respectivamente), a plataforma
no apresentou nenhuma mudana significativa no potencial de oxidao da Cys.
No entanto, quando a plataforma nanoestruturada foi modificada com o DTNBativado, uma diminuio drstica do potencial de oxidao pode ser observada na
Figura III.8(E), cerca de 550 e 420 mV em relao ao ECV e ECV+MWCNTs
respectivamente, evidenciando dessa forma a eficincia eletrocataltica do
mediador redox empregado.
48
Murilo Santhiago
III.2.5 Estudos cronoamperomtricos

A cronoamperometria foi empregada na investigao do processo
eletroqumico na presena e ausncia da Cys. A Figura III.9 mostra as curvas
corrente-tempo do eletrodo modificado resultantes aps aplicao de duas etapas
de potenciais, uma de 50 mV (1a. etapa) e outra de -130 mV (2. etapa).
Figura III.9. Cronoamperogramas obtidos em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1
pH 7,0: branco (a), 50,0 (b) 75,0 (c), 100,0 (d) e 125,0 (e) mol L-1 de Cys.
Como pode ser visto na Figura III.9, quando a concentrao de Cys

aumenta, a corrente andica associada com o potencial aplicado na primeira
etapa tambm aumenta. No entanto, na segunda etapa a corrente catdica no
aumenta, indicando que a espcie oxidada do mediador (Mox) est reagindo na
superfcie da plataforma. A reao qumica que ocorre na superfcie do eletrodo
pode ser explicada pela Equao III.3:
49
Murilo Santhiago
2R SH
+ Mox
k
obs
R S S R
Mred
(Eq. III.3)
Uma transferncia de ons hidreto esperada quando esse tipo de

mediador redox reage com o NADH [113]. Entretanto, o mecanismo descrito em
artigos para a reao entre grupos tiis e o grupo nitroso diferente. J foi
reportado por dois artigos distintos [103-114] que a reao entre os grupos R-SH e
R-NO ocorre atravs da formao de um aduto e no por uma simples
transferncia direta de eltrons. O ataque nucleoflico do grupo tiol da Cys no
nitrognio do grupo nitroso leva formao deste aduto, que pode reagir com
outra molcula de Cys formando a cistina e a espcie reduzida do mediador redox
[115].
Sendo assim, uma reao qumica ocorre na superfcie da plataforma
nanoestruturada na presena de Cys e a constante cintica (kobs) desta reao
pode ser obtida por cronoamperometria de acordo com o mtodo descrito na
literatura [18]:
I cat
=
IL
1 / 2 1 / 2 = 1 / 2 ( kobs Ct )1 / 2
(Eq. III.4)
onde Icat a corrente cataltica do eletrodo modificado na presena de Cys, IL a

corrente na ausncia de Cys e = k obs Ct (C a concentrao de Cys e t o tempo
(s)). A partir do coeficiente angular de um grfico Icat / IL versus t1/2 o valor de kobs
pode ser obtido para uma concentrao conhecida do analito. Assim, como pode
ser observado na Figura III.10(A), inicialmente foi um obtido um grfico de Icat / IL
em funo de t1/2. Em seguida, os coeficientes angulares dessas retas foram
plotados em funo da [Cys]1/2, Figura III.10(B). O coeficiente angular obtido foi de
164,4 s-1/2 L1/2 mol-1/2, resultando em um valor de constante de 8,60103 L mol-1 s-1
para a constante cintica. Como pode ser observado na Tabela III.2 a constante
cintica obtida est entre as maiores j publicadas, com exceo para o trabalho
reportado por Ardakani e col. [24]. No entanto, o presente trabalho apresenta o
menor potencial aplicado para a eletrooxidao de Cys sob condies de meio
neutro.
50
Murilo Santhiago
Figura III.10. (A) Grfico de Icat / IL vs. t1/2 ; (B) grfico obtido a partir dos
coeficientes angulares das retas obtidas em (A) vs. [Cys]1/2.

Tabela III.2. Parmetros e condies experimetais extrados a partir de estudos
cronoamperomtricos para a eletrooxidao de Cys.

Referncias
Raoof e col.
[116]
Ardakani e
col. [24]
Raoof e col
[117]
Tong e col.
[118]
Este
trabalho
Eapl.* (mV)
800 vs Ag/AgCl
Eletrlito de suporte
0,1 mol L-1 PBS + 0,1 mol L-1

LiClO4 pH 8,0
kobs
(L mol-1 s-1)
8,29
800 vs Ag/AgCl
0,1 mol L-1 PBS pH 2,0
3,43104
350 vs Ag/AgCl
4,48103
800 vs Ag/AgCl
0,1 mol L-1 NaClO4 pH 6,8
1,59103
50 vs ECS
8,60103
*Potencial aplicado na 1 Etapa (Ag/AgCl = ECS - 45 mV).
51
Murilo Santhiago
Com o intuito de extrair mais informaes dos cronoamperogramas

mostrados na Figura III.9 o coeficiente de difuso da Cys tambm foi calculado.
Para uma espcie eletroativa com um coeficiente de difuso (D), a corrente
correspondente da reao eletroqumica (sob controle difusional) descrita pela
Equao de Cottrell [19]:
I=
nFAD1/2 C
1/2 t 1/2
(Eq. III.5)
onde D e C so o coeficiente de difuso (cm2 s-1) e a concentrao (mol cm-3) da

espcie eletroativa, respectivamente. Um grfico de I versus t-1/2 deve ser linear, e
a partir do seu coeficiente angular, o coeficiente de difuso pode ser obtido. Os
cronoamperogramas na presena de Cys ilustrados na Figura III.9 mostram um
perfil tpico de uma curva I t, indicando que os valores de corrente obtidos
devem ser controlados pela difuso da Cys na soluo. O grfico de I versus t-1/2
para as concentraes de Cys empregadas resultaram em linhas retas (Figura
III.11(A)) e os coeficientes angulares dessas retas foram plotados em funo da
concentrao de Cys, como mostrado na Figura III.11(B). Assim, o coeficiente de
difuso da Cys foi estimado como sendo 1,51106 cm2 s1, prximo do valor
reportado na literatura [119].
Figura III.11. (A) grfico I vs. t -1/2 e (B) grfico dos coeficientes angulares obtidos
em (A) vs. [Cys]. As concentraes de Cys utilizadas so as mesmas dos

cronoamperogramas mostrados na Figura III.9.
52
Murilo Santhiago
Utilizando as constantes obtidas, a Figura III.12 mostra uma proposta

esquemtica para as reaes que devem estar ocorrendo na superfcie da
plataforma nanoestruturada.
Figura III.12. Proposta para as reaes que ocorrem na superfcie da plataforma
nanoestruturada.
A reao comea com a cistena (pKa R-COOH = 2,0, R-SH = 8,2 e R-NH3
= 10,3 [120]) se aproximando da superfcie da plataforma por difuso (D =
1,51106 cm2 s1) em pH 7,0. Na superfcie da plataforma, o grupo tiol da Cys
reage com o grupo nitroso do mediador redox e essa reao apresenta uma
constante cintica de 8,60103 L mol-1 s-1. Aps a reao, o produto oxidado
liberado e a espcie reduzida do mediador redox formada. O produto de
oxidao deve ser provavelmente a cistina, assim como reportado em outros
trabalhos [114,121], no entanto no foram realizados ensaios de caracterizao
mais especficos. Aps a formao da espcie reduzida do mediador, a
hidroxilamina oxidada na superfcie do eletrodo (+50 mV vs. ECS). A
comunicao eletrnica bastante rpida (43 s-1) quando comparada com outros
53
Murilo Santhiago
mediadores redox (Tabela III.1). A oxidao da hidroxilamina na superfcie da

plataforma envolve 2e- e 2H+ e forma o grupo nitroso, permitindo que o ciclo
cataltico continue.
III.2.6 Caracterizao analtica

Para efetuar a caracterizao analtica foram realizados experimentos
amperomtricos monitorando a corrente cataltica aps adies sucessivas de
Cys. Sendo assim, a influncia de alguns parmetros foi estudada, como:
potencial aplicado, pH da soluo, tipo e concentrao do eletrlito. A Tabela III.3
mostra as melhores condies obtidas para os parmetros estudados.
Tabela III.3. Caracterizao analtica do sensor destinado a deteco de Cys.

Parmetros estudados
Faixa / tipo de estudo
Melhor resposta*
Potencial aplicado
-100 at +100 mV
0 mV
pH
5,0 at 8,0
7,0
Tipo de eletrlito
[Eletrlito] mol L-1
PIPES, HEPES, TRIS,

Mcllvaine e PBS
0,01 at 0,2
PBS
0,1
*Obtida pela sensibilidade das curvas aps adies sucessivas de Cys.
Inicialmente foi realizado um estudo do potencial aplicado no eletrodo de

trabalho para as anlises de Cys. As respostas do sensor aumentaram at 0 mV e
ento permaneceram praticamente constantes devido s limitaes que surgem
do processo de transferncia de massa. Assim, o potencial de 0 mV vs. ECS foi
selecionado para os estudos posteriores.
O efeito do pH sobre a resposta do sensor tambm foi avaliado na faixa de
5,0 at 8,0. Em pH 7,0 a corrente atingiu o valor mximo e diminuiu para pHs
54
Murilo Santhiago
maiores. A corrente cataltica diminui para valores de pH maiores que 7,0

possivelmente devido desestabilizao do intermedirio formado Cys-nitroso,
assim como reportado por Adam e col. atravs de estudos cinticos realizados em
soluo [122].
No estudo do tipo de eletrlito suporte a maior resposta foi obtida
utilizando soluo tampo fosfato, seguida por TRIS, Mcllvaine, HEPES e PIPES
(Figura III.13).
Figura III.13. Estrutura, composio e ordem de resposta analtica dos tipos de
eletrlitos de suporte estudados na caracterizao analtica do sensor.
Como pode ser observado na Figura III.13, a resposta do sensor foi maior
para os eletrlitos que apresentam uma estrura menor, facilitando possivelmente a
difuso desses ons pela plataforma. Assim, a soluo tampo fosfato foi
selecionada para os estudos subsequentes.
Finalmente, as respostas obtidas nas medidas cronoamperomtricas em
diferentes concentraes da soluo tampo fosfato aumentaram at 0,1 mol L-1.
Para valores superiores a resposta permaneceu praticamente constante indicando
que existe uma quantidade de carga suficiente para manter a eletroneutralidade
do eletrodo. Nesse sentido, a concentrao de eletrlito de 0,1 mol L-1 foi
selecionada e a curva analtica foi construda empregando os resultados
mostrados na Tabela III.3.
55
Murilo Santhiago
A Figura III.14 ilustra a resposta cronoamperomtrica do sensor em

soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, aps sucessivas adies de Cys, em
funo de cada etapa (A E) da construo do sensor.
Figura III.14. Resposta cronoamperomtrica observada aps adies sucessivas
de uma soluo estoque de Cys em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0
para: (A) ECV, (B) +MWCNTs, (C) +PEI, (D) +NPAu e (E) +DTNB-ativado.
Como pode ser observado na Figura III.14(E), somente quando a
plataforma est modificada com o mediador redox possvel observar uma
resposta cronoamperomtrica com o potencial aplicado de 0 mV vs. ECS. Os
resultados obtidos aqui esto em concordncia com os voltamogramas cclicos
mostrados na Figura III.8, mostrando que o efeito eletrocataltico em baixos
sobrepotenciais atribudo devido presena do mediador redox ativado na
superfcie da plataforma.
56
Murilo Santhiago
Na Figura III.15, pode ser observado uma faixa linear de resposta de 9,0
at 250,0 mol L-1, podendo ser expressa com a seguinte equao:
I(A)= 0,023(0,03) + 0,021(0,005)[Cys] (mol L-1)
(Eq. III.6)
com um coeficiente de correlao de 0,999 (n = 3). O sensor apresentou limite de

deteco e quantificao de 2,7 e 9,1 mol L-1 respectivamente, seguindo as
recomendaes da IUPAC [123]. Alm disso, o tempo de resposta do sensor foi
de 0,16 s.
Figura III.15. Curva analtica.
A Tabela III.4 mostra uma srie de trabalhos envolvendo mediadores

redox para a determinao de Cys. Para um efeito de comparao, inmeros
artigos cientficos com condies experimentais semelhantes foram selecionados.
57
Murilo Santhiago
_______________________________
Tabela III.4 Mtodos eletroqumicos, condies experimentais e parmetros analticos para a determinao de Cys.
Referncias
Amini e col. [124]

Inoue e Kirchhoff
[125]
Shahrokhian e
Karimi [126]
Tan e col. [21]
Teixeira e col.
[127]
Salimi e
Pourbeyram [128]
Ozoemena e col.
[129]
Mtodo
Eapl. (V)
VPD
0,600 vs.
Cronoamperometria
Ag/AgCl
Cronoamperometria
VC, VPD
VC
Cronoamperometria
VC
VC
0,500 vs.
Ag/AgCl
0,500 vs.
Ag/AgCl
0,580 vs.
Ag/AgCl
0,650 vs. ECS
~0,800 vs.
Ag/AgCl
~0,400 vs.
Ag/AgCl
L.D.
(mol L-1)
Sensibilidade
(nA L mol-1)
PBS (pH 6 - 8)
0,5
~ 22
Tampo borato (pH 8,2)
0,0006
4,71
Tampo acetato (pH 5,0)
0,2
0,036
PBS (pH 7,0)
15,5
KCl (pH 5,0)
170
4,7
PBS (pH 2,0)
Soluo tampo (pH 4,0)
0,31
58
Murilo Santhiago
Ozoemena e col.
[130]
Filanovsky [131]
Li e col. [132]
Shahrokhian
_______________________________
VC
0,540 e 0,330
vs. Ag/AgCl
VC e
0,400 vs.
Cronoamperometria
Ag/AgCl
Amperometria - FIA
0,800 vs.
Ag/AgCl
Potenciometria
[134]
Voltametria - FIA
0,570 vs. ECS
Lima e col. [114]
Cronoamperometria
Deng e col. [111]
Cronoamperometria
Este trabalho
Cronoamperometria
[133]
Sptaru e col.
0,33 vs.
Soluo tampo (pH 4,0)
0,52
Tampo acetato (pH 5,0)
0,2
8,89
PBS (pH 7,0)
1,7
9,28
PBS (pH 8,5)
~1
KHCO3
(pH 9,0)
0,9
12 - 20
12
PBS (pH 7,0)
0,25
37
0,470 vs ECS
PBS (pH 7,4)
0,26
0,025
0 vs. ECS
PBS (pH 7,0)
2,7
21
Ag/AgCl
VC: voltametria cclica; VPD: voltametria de pulso diferencial; FIA: anlise por injeo em fluxo. (Ag/AgCl = ECS - 45 mV).
59
Murilo Santhiago
Como pode ser observado na Tabela III.4, as sensibilidades das curvas

analticas so menores quando comparadas com o presente trabalho, exceto para
os trabalhos reportados por Lima [114] e Amini [124], no entanto o potencial de
oxidao apresentado por estes autores foi mais positivo. Um dos aspectos que
merece destaque se refere ao potencial de oxidao da Cys. De acordo com a
Tabela III.4, o presente trabalho apresenta o menor potencial de oxidao para a
eletrooxidao da Cys, resultando assim em uma anlise que pode minimizar
possveis interferentes.
III.2.7 Estabilidade do sensor

A estabilidade do eletrodo modificado foi avaliada em soluo tampo
fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 fazendo adies sucessiva de Cys e monitorando a
corrente (I) por cronoamperometria. Os eletrodos modificados, armazenados em
temperatura ambiente, apresentaram estabilidade de aproximadamente 3
semanas.
A repetibilidade das medidas e da construo das interfaces tambm
foram
avaliadas.
Depois
de
10
medidas
sucessivas,
resposta
cronoamperomtrica do sensor para 50 mol L-1 de Cys apresentou um desvio

padro relativo (D.P.R.) menor que 5%. Alm disso, quando a plataforma foi
preparada 7 vezes da mesma forma e avaliada em soluo tampo fosfato 0,1 mol
L-1 pH 7,0 o D.P.R. obtido foi de 4,5 %, indicando uma boa repetibilidade.
III.2.8 Aplicao do sensor

O sensor proposto foi empregado na determinao de amostras de Cys
em triplicata. As concentraes de Cys foram obtidas utilizando o mtodo da
adio de padro e o resultados foram confrontados com o mtodo
espectrofotomtrico [8] utilizando o teste-t pareado (Tabela III.5). Os resultados
obtidos foram estatiscamente iguais ao do mtodo comparativo.
60
Murilo Santhiago
Tabela III.5. Determinao de Cys nas amostras.

Amostras
Sensor amperomtrico*
Mtodo comparativo*
498 (2)
496 (8)
506 (4)
503 (5)
503 (3)
501 (6)
* massa (mg) obtida por cpsula.
O efeito das seguintes substncias na determinao de Cys foi

investigado: cido ctrico, EDTA, glicose, polietilenoglicol e cloreto de sdio.
Monitorando a corrente (I) de 20 mol L-1 de Cys por cronoamperometria, foi
verificado que nenhuma destas substncias interferiram no desempenho do
sensor. No entanto, molculas contendo o grupo tiol so interferentes para os
sensores desenvolvidos por razes descritas anteriormente. O cido ascrbico,
um possvel doador de ons hidreto [135], tambm interfere nas medidas e o seu
efeito como interferente ser abordado no prximo captulo.
Ensaios de recuperao das amostras comerciais de Cys foram obtidos
utilizando o sensor proposto. Neste estudo, alquotas de 20 mol L-1 de Cys foram
adicionadas e a corrente (I) foi obtida por cronoamperometria. A porcentagem de
recuperao das amostras variou de 97 103 % sugerindo que no h efeito de
matriz nas determinaes.
III.2.9 Concluses
O mediador redox DTNB (cido 5,5-ditio-2-nitrobenzoico) foi ancorado
com sucesso sobre uma plataforma nanoestruturada contendo MWCNTs, PEI e
NPAus. O ancoramento foi possvel devido boa interao entre os tomos de
enxofre do mediador com a superfcie de ouro das nanopartculas. As etapas de
montagem do sensor foram caracterizadas por MEV e tambm atravs de ensaios
eletroqumicos. Obtendo-se voltamogramas cclicos em funo de cada etapa da
61
Murilo Santhiago
construo do sensor foi possvel verificar a contribuio de cada material na

resposta eletrocataltica frente eletrooxidao da Cys. J os estudos
cronoamperomtricos forneceram uma rota experimental rpida para se extrair a
constante cintica (kobs) da reao qumica e o coeficiente de difuso da Cys em
soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0. Por fim, o sensor foi aplicado em
amostras reais e apresentou resultados estatisticamente iguais ao do mtodo
comparativo.
62
Murilo Santhiago
CAPTULO IV
SENSOR PARA NADH
63
Murilo Santhiago
IV.1 Apresentao do captulo

Neste captulo sero apresentados os resultados referentes construo,
caracterizao e estudo das propriedades eletrocatalticas do sensor destinado
deteco do NADH, visando construo de um biossensor. A molcula
selecionada para mediar o processo eletroqumico da eletrooxidao do NADH foi
o cido 3,5-dinitrobenzoico (3,5-DNB), Figura IV.1. Para exercer tal papel, a
molcula ser ancorada em uma plataforma nanoestruturada baseada em
MWCNTs funcionalizados com PEI. Em seguida, sero discutidos ensaios de
caracterizao por microscopia eletrnica de varredura e tambm caracterizaes
eletroqumicas do par redox nitroso/hidroxilamina formado a partir do mediador
redox utilizado. Para centralizar o efeito eletrocataltico do mediador redox, sero
apresentados voltamogramas cclicos obtidos aps cada etapa da construo do
sensor. A cronoamperometria e experimentos empregando o eletrodo de disco
rotatrio (EDR) sero abordados a fim de estudar o mecanismo de eletrooxidao
do NADH. Ao final, sero apresentados os resultados da caracterizao analtica
do sensor proposto.
H
O
O
O
Figura IV.1 Frmula estrutural do cido 3,5-dinitrobenzoico (3,5-DNB).
65
Murilo Santhiago
IV.2 Resultados e discusso
IV.2.1 Caracterizao por MEV e imobilizao do mediador

A
Figura
IV.2
mostra
as
micrografias
do
MEV
da
plataforma
nanoestruturada baseada em MWCNTs/PEI em diferentes magnificaes: (A)

1,000 e (B) 10,000. A micrografia ilustrada na Figura IV.2(A) mostra que os
MWCNTs esto bem distribudos na superfcie. A partir da Figura IV.2(B), que
representa uma magnificao da poro central da Figura anterior, pode ser
observado que os MWCNTs esto densamente empacotados e eficientemente
entrapeados na rede polimrica fornecendo uma matriz ideal para receber
mediadores redox ou enzimas. A excelente distribuio do material devido
presena de grupos amino protonados repelindo os tubos, evitando agregao
causada pelas interaes hidrofbicas e foras atrativas de van der Waals entre
os tubos [136].
Figura IV.2. Micrografias obtidas da plataforma nanoestruturada contendo
MWCNTs/PEI para as magnificaes: (A) 1,000 e (B) 10,000.

A rede polimrica que envolve os MWCNTs fornece uma grande
quantidade de grupos amino que permitem a imobilizao do mediador redox na
superfcie da plataforma. Sendo assim, para imobilizar o mediador redox, a
67
Murilo Santhiago
plataforma nanoestruturada foi deixada em contado com uma soluo etanlica

contendo EDC, NHS e o 3,5-DNB. O sistema EDC/NHS amplamente utilizado na
literatura para conectar um grupo R-COOH com uma funo R-NH2 atravs da
formao de uma ligao amida [137, 138]. A partir desse sistema reacional, os
grupos R-COOH so convertidos em um intermedirio mais reativo derivado do
grupo succinimidil-ster [137]. Assim, a Figura IV.3(A) mostra a formao do
intermedirio (3,5-DNBSE) a partir do grupo R-COOH do 3,5-DNB.
Figura IV.3. (A) Esquema de formao do intermedirio 3,5-DNBSE a partir de
uma soluo contendo 3,5-DNB, EDC e NHS. (B) Mediador redox imobilizado na
A
imobilizao
do
3,5-DNB
na
plataforma
(Figura
IV.3(B))
foi
acompanhada monitorando a corrente de pico andica do par redox R-NO/RNHOH em funo do tempo. A resposta aumentou at 1,5 h e ento permaneceu
constante. Portanto, o tempo reacional de 1,5 h foi selecionado para a construo
do sensor. O tempo reacional obtido foi relativamente curto e pode estar
68
Murilo Santhiago
relacionado com a presena dos grupos nitro eltron-retiradores presentes na

molcula do mediador, tornando o carbono da carbonila mais eletroflico e
facilitando a etapa de imobilizao.
Um ponto interessante que merece ser destacado se refere estratgia
utilizada para imobilizar o mediador redox na superfcie da plataforma. Se a
reduo dos grupos nitro tivesse sido feita antes da imobilizao utilizando uma
enzima [139] ou um complexo de estanho (II) [140], as molculas do 3,5-DNB
poderiam reagir entre si, pois a hidroxilamina uma base de Lewis e reage com
eletrfilos [141]. Assim, a estratgia empregada de ativao in situ do mediador
desempenha um papel importante no processo de imobilizao minimizando
possveis reaes indesejveis.
IV.2.2 Ativao e caracterizao do par redox

Aps o 3,5-DNB estar quimicamente ligado nos grupos amino do PEI, o
par redox R-NO/R-NHOH foi eletrogerado in situ atravs de uma ciclagem do
potencial entre 0,15 e -0,55 V versus ECS em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1
pH 7,0. Como pode ser observado na Figura IV.4, no primeiro ciclo o grupo nitro
reduzido irreversivelmente para R-NHOH e oxidado para R-NO na varredura
reversa. No segundo ciclo possvel observar um pico de reduo que pode ser
atribudo ao par redox R-NO/R-NHOH.
Os voltamogramas cclicos obtidos aps o processo de ativao do
eletrodo modificado com o 3,5-DNB so mostrados na Figura IV.5 em vrias
velocidades de varredura (10 - 800 mV s-1). Nesta mesma Figura podem ser
observados voltamogramas cclicos bem definidos e persistentes indicando que o
cido 3,5-DNB foi ligado com sucesso na superfcie da plataforma. A Figura
IV.5(A) mostra um grfico de corrente de pico em funo da velocidade de
varredura. Os grficos da corrente de pico andica e catdica apresentaram
comportamento linear em funo da velocidade de varredura indicando assim que
o 3,5-DNB-ativado mostra um comportamento eletroqumico caracterstico de
espcies redox que esto confinadas na superfcie do eletrodo [19].
69
Murilo Santhiago
Figura IV.4. Formao do par redox R-NO/R-NHOH em soluo tampo fosfato
0,1 mol L-1 pH 7,0 e = 50 mV s-1.
Figura IV.5. Voltamogramas cclicos do par R-NO/R-NHOH em vrias velocidades
de varredura (10 800 mV s-1). (A) Grfico de Ip vs. . (B) Grfico de Laviron.
70
Murilo Santhiago
A partir dos valores de E obtidos na Figura IV.5 foi construdo o grfico

de Laviron (Figura IV.5(B)), assim como demonstrado no captulo III (Item III.2.3).
O grfico apresentou um comportamento caracterstico esperado pelo modelo
descrito por Laviron [99] e, utilizando as Equaes III.1 e 2, foi possvel extrair da
Figura IV.5(B) alguns parmetros importantes como o , n e ks. O coeficiente de
transferncia de eltrons () obtido foi 0,5 e o nmero de eltrons (n) envolvidos
no processo redox apresentou um valor de 1,87. Este ltimo, est prximo do
valor esperado de 2 eltrons para o processo redox nitroso/hidroxilamina [100].
Alm disso, a constante de velocidade heterognea de transferncia de eltrons
(ks) apresentou um valor de 50 s-1, maior do que muitos outros mediadores j
reportados (Tabela III.1), sugerindo um processo de transferncia de eltrons
rpido do mediador com a superfcie do eletrodo.
Aps as caracterizaes do par redox em funo da velocidade de
varredura foram obtidos voltamogramas cclicos variando o pH da soluo (5,0
8,0). Como pode ser observado na Figura IV.6, o potencial formal (Eo) sofre um
deslocamento em funo do pH e, esse deslocamento, pode ser analisado de
maneira mais criteriosa obtendo-se um grfico de Eo vs pH. Como pode ser visto
no grfico inserido na Figura IV.6, o coeficiente angular (Eo / pH) 60,6 mV / pH
na faixa de pH estudada. Este coeficiente angular muito prximo para reaes
onde a razo e/H+ igual a um (59,2 (np/n)) mV / pH, onde np = n a 25 C [48].
Assim, o nmero de prtons deve ser tambm 2 porque o mesmo nmero foi
encontrado atravs do mtodo de Laviron para o nmero de eltrons.
71
Murilo Santhiago
Figura IV.6. Voltamogramas cclicos obtidos em soluo tampo fosfato 0,1 mol
L-1 para o eletrodo modificado com o 3,5-DNB-ativado em diferentes pHs (5,0

8,0) e = 100 mV s-1. Inserido: Grfico de Eo vs pH.
IV.2.3 Atividade eletrocataltica da plataforma nanoestruturada

Experimentos preliminares para a elucidao da atividade eletrocataltica
da plataforma nanoestruturada contendo o 3,5-DNB-ativado para a deteco do
NADH foram realizados utilizando voltametria cclica. Os voltamogramas cclicos
foram obtidos aps cada etapa de montagem da plataforma nanoestruturada. A
Figura IV.7 destaca os processos relacionados com a oxidao eletroqumica do
NADH. Como pode ser observado na Figura IV.7(A), com o ECV no modificado,
a oxidao do NADH ocorre em sobrepotenciais elevados, com um potencial de
pico em 650 mV.
72
Murilo Santhiago
Figura IV.7. Voltamogramas cclicos obtidos em soluo tampo fosfato 0,1 mol
L-1 pH 7,0 e = 2 mV s-1 na presena de NADH 2,010-4 mol L-1 (___) para (A) ECV
no modificado, (B) ECV modificado com MWCNTs/PEI, (C) ECV modificado com
MWCNTs/PEI/3,5-DNB e (---) na ausncia de NADH, respectivamente.
J o eletrodo modificado com a disperso de MWCNTs/PEI (Figura IV.7(B))
mostra um deslocamento catdico substancial do potencial de pico andico,
aproximadamente 330 mV. Estes resultados confirmam que mesmo na presena
do polmero, os MWCNTs mantiveram sua reatividade eletroqumica justificado
pelo efeito sinrgico reportado recentemente entre MWCNTs-PEI [142]. Alm
disso, quando o 3,5-DNB-ativado est ancorado na plataforma, um decrscimo
drstico do potencial de oxidao (cerca de 680 e 350 mV em relao ao ECV e
ao ECV+MWCNTs/PEi respectivamente) e um perfil bem definido podem ser
observados na Figura IV.7(C) mostrando, desta forma, a eficincia eletrocataltica
do mediador redox empregado.
73
Murilo Santhiago
IV.2.4 Efeito da ativao dos grupos nitro do mediador

Voltamogramas cclicos na presena e ausncia de NADH foram obtidos
no sentido de avaliar as propriedades redox que ocorrem quando mais de um
grupo nitro ativado in situ. A Tabela IV.1 mostra a corrente cataltica obtida na
presena de 1,010-4 mol L-1 de NADH aps diferentes processos de ativao.
Tabela IV.1. Comparao entre a corrente cataltica da NADH em funo do
procedimento de ativao do 3,5-DNB ancorado na plataforma.

Estrutura qumica do
mediador redox
O +
N
O
+ ON
Processo de
ativao
Grupos (R-NO2)
reduzidos
I (A)b
0,15 at -0,55 V
1,35
0,15 at -0,80 V
1,17
O +
N
O
NHOH
HOHN
NHOH
Estudo em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0. bVoltamogramas cclicos
obtidos na faixa de potencial de -0,23 a 0,1 V vs. ECS ( = 2 mV s-1) e 110-4 mol
L-1 NADH.
74
Murilo Santhiago
Como pode ser observado na Tabela IV.1, quando nenhum processo de

ativao realizado, ambos os grupo nitro permanecem na sua forma oxidada e
eles no so capazes de catalisar a electrooxidao do NADH. No entanto, um
processo de ativao entre 0,15 e -0,55 V versus ECS converte somente um dos
grupos nitro para hidroxilamina. O par redox formado agora capaz de catalisar a
eletrooxidao do NADH em baixos sobrepotenciais. Quando o potencial de
ativao estendido at -0,80 V versus ECS os dois grupos nitro presentes na
molcula do mediador so reduzidos para hidroxilamina. O processo redox
apresenta agora dois pares redox muito prximos tambm capazes de catalisar a
eletrooxidao do NADH, mas a corrente corrente cataltica menor quando
comparada com o caso anterior. Estes resultados esto em concordncia com
estudos prvios reportados sobre a influncia da quantidade de grupos nitro
reduzidos e a atividade eletrocataltica [143]. Mano e Kuhn reportaram em seu
trabalho que a presena de um segundo grupo eltron retirador torna o nitrognio
do grupo nitroso mais eletroflico, facilitando a reao [143].
IV.2.5 Estudos cronoamperomtricos

A cronoamperometria foi empregada para a investigao do processo
eletroqumico na presena e ausncia de NADH. A Figura IV.8 mostra o grfico de
corrente-tempo para o eletrodo modificado com a plataforma contendo o 3,5-DNBativado fixando o potencial em 20 mV e em seguida -130 mV versus ECS para
vrias concentraes de NADH. Como pode ser observado na Figura IV.5, quando
a concentrao de NADH aumenta, a corrente relacionada ao processo andico
tambm aumenta. No entanto, quando o potencial fixado em -130 mV, no
ocorre nenhum aumento relacionado ao processo catdico evidenciando que o
grupo nitroso (Mox) est sendo consumido em uma etapa qumica que pode ser
explicada pela Equao IV.1:
NADH
+ M ox
k
obs
NAD +
M red
(Eq. IV.1)
75
Murilo Santhiago
Figura IV.8. Cronoamperogramas do eletrodo modificado com a plataforma
contendo o 3,5-DNB em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 para: (a)
branco, (b) 50, (c) 100, (d) 150 e (e) 200 mol L-1 de NADH. Grficos inserido: Icat
/ iL vs. t1/2 para 50 mol L-1 de NADH.
Alm disso, a constante cintica (kobs) para a reao qumica entre o
NADH e o stios redox confinados na superfcie da plataforma pode ser obtida por
cronoamperometria de acordo com o mtodo descrito na literatura [18] e mostrado
na Equao III.4. A partir do grfico inserido na Figura IV.8, o coeficiente angular
foi encontrado como sendo 2,42 s-1/2 para 50 mol L-1 de NADH resultando em um
valor de kobs de 3,73 x 104 L mol-1 s-1.
No sentido de extrair mais informaes a partir dos cronoamperogramas
mostrados na Figura IV.8, grficos da carga (Q) em funo de t1/2 foram obtidos
(Figura IV.9(A)). Para uma espcie eletroativa com coeficiente de difuso D (4,45
x 10-6 cm2 s-1 obtido empregando experimentos com EDR, item IV.2.6), a carga
(Q) est relacionada com a reao eletroqumica descrita a partir da integrao da
76
Murilo Santhiago
equao de Cottrell [19]:
Q=
2nFAD1/2 Ct 1/2
1/2
(Eq. IV.2)
Figura IV.9. (A) Grfico de Q vs t1/2 utilizando as mesmas condies
experimentais dos cronoamperogramas ilustrados na Figura IV.8 e (B) Grfico de

Qt-1/2 versus [NADH].
A partir dos coeficientes angulares das retas obtidas na Figura IV.9(A), foi
construdo um grfico de Qt-1/2 em funo da concentrao do NADH (Figura
IV.9(B)). Assim, empregando a Equao IV.2, foi obtido o valor n (nmero de
eltrons) como sendo 1,88. O valor obtido sugere a participao de 2 eltrons
envolvidos na eletrooxidao do NADH, de acordo com outros trabalhos j
reportados [143,144].
IV.2.6 Estudos com eletrodo de disco rotatrio

No sentido de estudar o mecanismo da reao e obter as constantes
cinticas que ocorrem na superfcie da plataforma nanoestruturada, experimentos
com o eletrodo de disco rotatrio (EDR) foram realizados. A Figura IV.10 mostra
as curvas de polarizao para a oxidao do NADH empregando diferentes
velocidades de rotao do eletrodo (rad s-1). Como pode ser observado na
77
Murilo Santhiago
Figura IV.10, as correntes limites aumentam em funo da velocidade de rotao

do eletrodo.
Figura IV.10. Curvas de polarizao obtidas em diferentes velocidades de rotao
do eletrodo para a oxidao eletrocataltica de 300 mol L-1 de NADH na

superfcie da plataforma contendo o 3,5-DNB-ativado. Velocidades de rotao: (a)
5,20 ; (b) 7,67 ; (c) 10,89 ; (d) 16,40 ; (e) 23,72 ; (f) 34,00 e (g) 45,70 rad s-1.
Estudos feitos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, = 2 mV s-1 e = 2,3810-10
mol cm2.
Aps a obteno das curvas de polarizao foram obtidos grficos de
Levich (I versus 1/2), ilustrado na Figura IV.11, para quatro diferentes
concentraes de NADH, 100, 200, 300 e 400 mol L-1 em soluo tampo fosfato
0,1 mol L-1 pH 7,0. Na Figura IV.11 pode ser observada uma limitao cintica do
processo, onde os valores de corrente possuem uma tendncia direcionada
formao de um patamar praticamente constante com o aumento de 1/2.
78
Murilo Santhiago
Figura IV.11. Grficos de Levich para a resposta eletrocataltica da plataforma
nanoestruturada contendo o 3,5-DNB-ativado em diferentes concentraes de

NADH. Estudos feitos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, = 2 mV s-1 e =
2,3810-10 mol cm2.
Para possibilitar que os parmetros cinticos sejam extrados dos grficos
de Levich, equaes foram estabelecidas em trabalhos da literatura considerando
as correntes limitadas pelo transporte de massa e pela cintica do processo [19].
A corrente limitada pelo transporte de massa (Id(L)) depende da velocidade de
rotao do eletrodo () e da concentrao de NADH no seio da soluo [NADH]*,
de acordo com a equao de Levich representada abaixo:
Id(L) = 0,620nFA[NADH]*D2/3-1/61/2
(Eq. IV.3)
sendo n o nmero de eltrons, F a constante de Faraday, a viscosidade

cinemtica e D o coeficiente de difuso. Os valores de n e foram empregados
79
Murilo Santhiago
como sendo 2 e 0,01 cm2 s-1 [19].

Para uma reao catalisada, a corrente limitada cineticamente (Ikin) dada
geralmente pela expresso abaixo:
Ikin = nFAkobs*[NADH]*
(Eq. IV.4)
sendo * a cobertura total do par redox R-NO/R-NHOH presente na plataforma

nanoestruturada. Assim, a corrente global (I) pode ser descrita pela contribuio
da corrente limitada pelo transporte de massa e pela cintica do processo,
conforme a equao abaixo:
I = Ikin + Id(L)
(Eq. IV.5)
Fazendo a inverso da Equao IV.5 e substituindo os valores correspondentes

para Ikin e Id(L) obtem-se a equao de Koutecky-Levich (Equao IV.6):
1
1
1
=
+
I n F Ak obs * [NADH ]* 0,62 n F A D 2 /3 1/6 [NADH ]* 1/2
(Eq. IV.6)
A Figura IV.12 mostra o grfico de Koutecky-Levich obtido a partir da

Figura IV.11. Assim como previsto pela Equao IV.6, o grfico I-1 versus -1/2
apresentou um comportamento linear nas condies experimentais apresentadas.
Pelo coeficiente angular da curva, possvel calcular o nmero de eltrons
envolvidos na reao (n) ou o coeficiente de difuso do NADH (D). Como o valor
de n j foi obtido anteriormente (Item IV.2.5) o coeficiente angular foi empregado
para se estimar o coeficiente de difuso do NADH. Dessa forma, foi encontrado
um valor de 4,4510-6 cm2 s-1 para o coeficiente de difuso do NADH em soluo
tampo fosfato 0,1 mol L-1 e pH 7,0. O valor obtido est de acordo com os
resultados de Zare e Golabi [145], que encontram um valor de 3,2410-6 cm2 s-1,
utilizando as mesmas condies experimentais.
80
Murilo Santhiago
Figura IV.12. Grfico de Koutecky-Levich obtidos a partir da Figura IV.11. Estudos
feitos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, = 2 mV s-1 e = 2,3810-10 mol cm2.
O coeficiente linear do grfico de Koutecky-Levich permite a obteno de
um parmetro extremamente importante no estudo de mecanismos de reaes
eletroqumicas, a constante cintica (kobs). Assim, foram obtidas as constantes
cinticas para cada concentrao de NADH estudada mas, ao invs de calcular
uma mdia das constantes, os valores encontrados foram plotados em funo da
concentrao do NADH (Figura IV.13(A)). Na mesma Figura pode ser observado
que as constantes cinticas diminuem com o aumento da concentrao de NADH
no seio da soluo. Este tipo de comportamento j foi reportado em alguns
trabalhos na literatura para a oxidao eletrocataltica empregando eletrodos
modificados com mediadores redox [31,146].
81
Murilo Santhiago
Figura IV.13. (A) Variao de kobs versus [NADH] para o eletrodo modificado com
a plataforma contendo o 3,5-DNB-ativado e (B) variao de kobs-1 versus [NADH].

Estudos feitos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, = 2 mV s-1 e = 2,3810-10
mol cm2.
De acordo com o trabalho de Gorton e col., o mecanismo da reao do
NADH com alguns mediadores redox confinados na superfcie de eletrodos ocorre
atravs da formao de um complexo de transferncia de carga [147]. Para uma
uma reao cataltica que ocorre atravs da formao de um complexo de
transferncia de carga e seguindo o modelo proposto [147], temos:
k +1
k +2
NADH + Mox [NADH Mox ] NAD + + Mred
k 1
(Eq. IV.7)
Esta reao similar ao modelo cintico enzimtico de Michaelis-Menten, e

atravs de uma combinao das constantes possvel relacionar a constante
82
Murilo Santhiago
cintica (kobs) com o KM [147]:
k obs =
k +2
K M + [NADH ]
(Eq. IV.8)
A inverso da Equao IV.8 resulta em:
K M + [NADH ]
k obs k + 2
(Eq. IV.9)
k+2
A Equao IV.9 mostra que um grfico de 1/kobs versus [NADH] resulta em

uma reta se um complexo de transferncia de carga estiver envolvido na reao
do NADH com o mediador redox. A Figura IV.13(B) mostra uma dependncia
linear do inverso da constante cintica em funo da [NADH] como previsto pela
Equao IV.9, com uma equao kobs = 6,17(0,6)10-5 + 1,18(0,5) e com um
-1
coeficiente de correlao 0,9992 para n = 3, evidenciando fortemente que um

complexo de transferncia de carga est envolvido na reao entre o mediador
redox e o NADH. A partir dos coeficintes angulares deste grfico o valor de k+2
pode ser obtido e, atravs de uma extrapolao para uma concentrao de NADH
igual a zero o valor de KM pode ser encontrado. Empregando a Equao IV.9, kobs,
k+2 e o KM foram obtidos como sendo 1,62104 L mol-1 s-1, 0,85 s-1 e 5,2410-5 mol
L-1 respectivamente. O valor obtido para a constante cintica est prximo do valor
obtido nos estudos cronoamperomtricos. A Tabela IV.2 mostra uma lista de
parmetros eletroqumicos e cinticos usualmente obtidos empregando eletrodos
modificados com mediadores redox para a eletrooxidao de NADH. Como pode
ser observado na Tabela IV.2, a constante cintica obtida est entre uma das
maiores j reportadas (104 105 L mol-1 s-1). Alm disso, o valor da constante de
Michaelis-Menten obtido est na faixa de valores usualmente encontrados e, o
nmero de eltrons, tambm est de acordo com o esperado para a
eletrooxidao do NADH (Equao I.2).
83
Murilo Santhiago
Tabela IV.2 Parmetros eletroqumicos e cinticos de alguns eletrodos
modificados para eletrooxidao de NADH.
kobs
KM
(mol cm2)
(L mol-1 s-1)
(mol L-1)
7,0
6,510-10
1,0104
2,710-5
1,9
Ag/AgCl
7,0
2,610-10
9,8103
7,0
9,710-11
2,0103
6,0
2,710-10
3,0103
3,410-4
2,0
7,0
4,410-9
1,8103
2,710-4
1,9
8,0
1,210-10
5,0104
1,9
7,0
6,810-10
8,2102
1,810-3
2,0
7,0
5,210-9
1,4103
2,110-4
1,9
7,0
4,210-10
1,1105
2,210-5
2,0
Referncia
Eo (mV)
Lima e
+100 vs.
col. [31]
Ag/AgCl
Vasantha e
+200 vs.
Chen [148]
Antiochia e
col. [149]
pH
Munteanu e
+156 vs.
col. [150]
Ag/AgCl
Santos e col.
-60 vs.
[151]
ECS
Mano e Kuhn
-50 vs.
[143]
Ag/AgCl
Kubota e
-220 vs.
Gorton [152]
ECS
Santos e col.
-230 vs.
[153]
ECS
Nassef e col.
+200 vs.
[154]
Ag/AgCl
Pereira e col.
-140 vs.
[144]
ECS
7,0
5,710-9
5,5103
1,010-4
1,9
Este trabalho
-50 vs. ECS
7,0
2,410-10
1,6104
5,210-5
1,9
84
Murilo Santhiago
Assim, as constantes cinticas e parmetros eletroqumicos que ocorrem

na superfcie da plataforma nanoestruturada foram obtidos. No entanto, antes de
propor o mecanismo das reaes que ocorrem na plataforma, foram levados em
considerao resultados apresentados por Leskovac e Trivi [155] e alguns
ensaios na presena de compostos fenlicos.
IV.2.7 O grupo R-NO/R-NHOH como mediador redox

O grupo nitroso tm sido amplamente estudado em reaes de xidoreduo devido a sua reatividade ser semelhante de aldedos. Leskovak e Trivi
[155] reportaram em seu trabalho que o nitrosobenzeno rapidamente reduzido
pelo NADH na ausncia de oxignio, em solues tampo pH 7,0 ou fracamente
alcalinas e ainda em metanol anidro. Os autores do trabalho propuseram,
avaliando o efeito isotpico cintico, que ocorre uma transferncia de hidreto
direta do carbono 4 do anel da nicotinamida para o grupo nitroso. Esses
resultados explicam em parte, porque ambos os sensores construdos neste
trabalho no apresentaram eletrocatlise para a oxidao de catecol, dopamina, LDopa, epinefrina, cido clorognico e cido cafico. Um aspecto interessante
que esses compostos fenlicos citados apresentam um mecanismo redox similar
ao do par R-NO/R-NHOH envolvendo 2 eltrons e 2 prtons, no entanto, no foi
encontrado nenhum trabalho cientfico mostrando que esses compostos possam
atuar como doadores de ons hidreto. Sendo assim, o mecanismo de transferncia
de ons hidreto do analito para o mediador plausvel e provavelmente deve estar
ocorrendo na superfcie do eletrodo. Adicionalmente, alm dos estudos realizados
em soluo [155], j foi reportado na literatura atividade eletrocataltica do par RNO/R-NHOH na deteco de NADH [31]. Alm do NADH, outra molcula que
pode atuar como um doador de ons hidreto o cido ascrbico [156]. Lima e col,
reportaram recentemente que o par redox R-NO/R-NHOH possui uma elevada
atividade eletrocataltica para a oxidao de cido ascrbico, com uma constante
cintica na ordem de 106 L mol-1 s-1 [157]. Dessa forma, o cido ascrbico um
interferente para as anlises empregando o par R-NO/R-NHOH como mediador de
85
Murilo Santhiago
eltrons. No entanto, se necessrio, o efeito do cido ascrbico como interferente

pode ser minimizado tratando a amostra com a enzima ascorbato oxidase, a qual
apresenta uma alta seletividade para a oxidao de cido ascrbico [158,159].
Levando em considerao os resultados apresentados, o par redox RNO/R-NHOH apresenta uma certa seletividade para o NADH, tornando esse tipo
de mediador um forte candidato para a configurao e aplicao de biossensores
em matrizes que possam apresentar os compostos fenlicos citados como
possveis interferentes. Visando a construo de biossensor necessrio
conhecer as etapas e/ou processos que ocorrem na superfcie da plataforma antes
da imobilizao de alguma enzima, seja ela uma desidrogenase ou no. Sendo
assim, empregando as constantes obtidas e as discusses apresentadas neste
tpico foi possvel estabelecer uma proposta para o mecanismo que ocorre na
IV.2.8. Mecanismo da eletrooxidao de NADH na plataforma

A Figura IV.14 mostra uma proposta para as reaes que ocorrem na
superfcie da plataforma. A reao inicia com a molcula do NADH se
aproximando da superfcie da plataforma por difuso com uma velocidade de
4,45106 cm2 s1 em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0. Na interface da
plataforma, a molcula de NADH forma um complexo de transferncia de carga
com o mediador redox. Aps a formao desse complexo, a molcula de NADH
transfere um on hidreto a partir do carbono 4 do anel da nicotinamida para o
nitrognio do grupo nitroso do mediador. Essa reao, estudada com o EDR,
apresentou uma constante cintica de 1,62104 L mol-1 s-1 e n aproximadamente 2
para o nmero de eltrons. Aps a transferncia de hidreto, o complexo se
dissocia formando a espcie reduzida do medidor (R-NHOH) e NAD+, onde esta
ltima, liberada para a soluo com uma velocidade de 0,85 s-1. Aplicando-se 20
mV versus ECS (Item IV.2.5) a hidroxilamina oxidada na superfcie da
plataforma formando o grupo nitroso. A comunicao eletrnica mediador-eletrodo
foi determinada como sendo 50 s-1 e o processo redox do mediador envolvendo
86
Murilo Santhiago
2e-/2H+ foi confirmado utilizando a voltametria cclica. Com a formao do grupo

nitroso na plataforma o ciclo cataltico regenerado permitindo que uma nova
molcula de NADH se aproxime e reaja novamente, conforme ilustrado na Figura
IV.14.
Figura IV.14. Proposta para as reaes que ocorrem na superfcie da plataforma
na presena de NADH.
IV.2.9 Caracterizao analtica

Para efetuar a caracterizao analtica foram realizados experimentos
amperomtricos monitorando a corrente cataltica aps adies sucessivas de
NADH. Sendo assim, a influncia de alguns parmetros foram estudados, como:
potencial aplicado, pH da soluo, tipo e concentrao do eletrlito. A Tabela IV.3
87
Murilo Santhiago
mostra as melhores condies obtidas para os parmetros estudados.

Tabela IV.3. Caracterizao analtica do sensor destinado a deteco de NADH.
Parmetros estudados
Faixa / tipo de estudo
Melhor resposta*
Potencial aplicado
-100 at 0 mV
-30 mV
pH
5,0 at 8,0
7,0
Tipo de eletrlito
[Eletrlito] mol L-1
PIPES, HEPES, TRIS,

Mcllvaine e PBS
0,01 at 0,2
PBS
0,1
*Obtida pela sensibilidade das curvas aps adies sucessivas de NADH.
Inicialmente foi realizado um estudo do potencial aplicado no eletrodo de

trabalho para as anlises de NADH. As respostas do sensor aumentaram at -30
mV e ento permaneceram praticamente constantes devido as limitaes que
surgem do processo de transferncia de massa. Assim, o potencial de 0 mV vs.
ECS foi selecionado para os estudos posteriores.
O efeito do pH sobre a resposta do sensor tambm foi avaliado na faixa de
5,0 at 8,0. Em pH 7,0 a corrente atingiu o valor mximo e diminuiu para pHs
maiores. Dessa forma, o pH 7,0 foi selecionado nos estudos posteriores.
No estudo do tipo de eletrlito suporte a resposta do sensor foi similar ao
do sensor destinado deteco de Cys (Figura III.13), a nica diferena obtida foi
que a resposta para o tampo PIPES foi superior ao do tampo HEPES. Assim, a
soluo tampo fosfato foi selecionada para os estudos subsequentes.
Finalmente, as respostas obtidas nas medidas cronoamperomtricas em
diferentes concentraes da soluo tampo fosfato aumentaram at 0,1 mol L-1.
Para valores superiores a resposta permaneceu praticamente constante indicando
que existe uma quantidade de carga suficiente para manter a eletroneutralidade
do eletrodo. Nesse sentido, a concentrao de eletrlito de 0,1 mol L-1 foi
selecionada e a curva analtica foi construda empregando os resultados
88
Murilo Santhiago
mostrados na Tabela IV.3.

A Figura IV.15 ilustra a resposta cronoamperomtrica do sensor em
soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, aps sucessivas adies de NADH, em
funo de cada etapa (A C) da construo do sensor.
Figura IV.15. Resposta cronoamperomtrica observada aps adies sucessivas
de uma soluo estoque de NADH em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0
para: (A) ECV, (B) +MWCNTs/PEI, (C) +3,5-DNB-ativado.
Como pode ser observado na Figura IV.15(C), somente quando a
plataforma est modificada com o mediador redox possvel observar uma
resposta cronoamperomtrica com o potencial aplicado de -30 mV vs. ECS. Os
resultados obtidos aqui esto em concordncia com os voltamogramas cclicos
mostrados na Figura IV.7, mostrando que o efeito eletrocataltico em baixos
sobrepotenciais atribudo devido a presena do mediador redox ativado na
89
Murilo Santhiago
Na Figura IV.16, pode ser observado uma faixa linear de resposta de 4,0
at 42,0 mol L-1, podendo ser expressa com a seguinte equao:
I(A)= 0,11(0,14) + 0,07(0,01)[NADH] (mol L-1)
(Eq. III.10)
com um coeficiente de correlao de 0,998 (n = 5). O sensor apresentou limite de

deteco e quantificao de 1,2 e 3,9 mol L-1 respectivamente, seguindo as
recomendaes da IUPAC [123]. Alm disso, o tempo de resposta do sensor foi
de 0,12 s.
Figura. IV.16. Curva analtica.
A Tabela IV.4 mostra uma srie de trabalhos envolvendo mediadores

redox para a determinao de NADH.
90
Murilo Santhiago
___
_______________________________
Tabela IV.4 Mtodos eletroqumicos, condies experimentais e parmetros analticos para a determinao de NADH.
Referncias
Banks e Compton
[160]
Deng e col.
[161]
Zhang e col.
[162]
Wu e col.
[163]
Prieto-Simn e
Fbregas [164]
Mtodo
Eapl. (mV)
L.D.
(mol L-1)
Sensibilidade
(nA L mol-1)
Cronoamperometria
400 vs. ECS
PBS 0,1 mol L-1 pH 7,4
0,965
54,6
Cronoamperometria
400 vs. ECS
0,05
2,25
Cronoamperometria
400 vs. Ag/AgCl
PBS 0,05 mol L-1 pH 7,4
3,0
61,0
Cronoamperometria
600 vs. ECS
5,6
Cronoamperometria
650 vs. ECS
PBS 0,05 mol L-1 pH 6,5
21,1
Cronoamperometria
200 vs. ECS
0,1
1,982
Cronoamperometria
150 vs. Ag/AgCl
0,15
14,0
Behera e col.
[165]
Nassef e col.
[154]
91
Murilo Santhiago
Zhu e col.
[108]
Zeng e col.
[166]
___
_______________________________
Cronoamperomeria
- 100 vs. Ag/AgCl
PBS 0,05 mol L-1 pH 6,85
0,05
0,52
Cronoamperometria
0 vs. ECS
PBS 0,06 mol L-1 pH 7,0
0,5
FIA - amperometria
150 vs. Ag/AgCl
1,2
Cronoamperometria
- 50 vs. ECS
0,1
1,65
Cronoamperometria
300 vs. Ag/AgCl
PBS 0,05 mol L-1 pH 7,0
0,17
3,1
Cronoamperometria
- 5 vs. Ag/AgCl
0,005
56
Cronoamperometria
- 120 vs. ECS
8,0
0,58
Fia - amperometria
50 vs. Ag/AgCl
TRIS 0,1 mol L-1 pH 8,5
0,94
0,27
Radoi e col.
[167]
Raj e
Chakraborty [168]
Ag e col.
[169]
Jena e Raj
[170]
Maroneze e col.
[171]
Radoi e col.
[172]
92
Murilo Santhiago
Pereira e col.
[144]
Lima e col.
[31]
Silva e col.
[173]
Yang e Liu
[29]
Zhang e Gorski
[174]
Wang e col.
[175]
Lawrence e
Wang [176]
Huang e col.
[177]
___
_______________________________
Cronoamperometria
- 50 vs. ECS
7,10
20
Cronoamperometria
100 vs. Ag/AgCl
TRIS 0,1 mol L-1 pH 7,0
0,25
500
Cronoamperometria
100 vs. Ag/AgCl
0,1
220
Cronoamperometria
0 vs. Ag/AgCl
1,0
9,88
Cronoamperometria
-100 vs. Ag/AgCl
PBS 0,05 mol L-1 pH 7,4
0,5
10,3
Cronoamperometria
300 vs. ECS
PBS 0,05 mol L-1 pH 6,8
0,06
84,4
Cronoamperometria
-200 vs. Ag/AgCl
PBS 0,05 mol L-1 pH 7,4
15
0,975
Cronoamperometria
-100 vs. Ag/AgCl
1,0
4,70
93
Murilo Santhiago
Tu e col
[178]
Doaga e col.
[179]
Arvinte e col.
[180]
Liu e col.
[181]
Arvinte e col.
[182]
Este
trabalho
___
_______________________________
Cronoamperometria
250 vs. Ag/AgCl
0,0064
11,5
Cronoamperometria
-50 vs. Ag/AgCl
PBS 0,05 mol L-1 pH 7,0
50
6,1
Cronoamperometria
-50 vs. Ag/AgCl
6,0
0,46
Cronoamperometria
450 vs. Ag/AgCl
0,02
10
Cronoamperometria
350 vs. Ag/AgCl
11
0,25
Cronoamperometria
- 30 vs.ECS
1,2
70
FIA: anlise por injeo em fluxo. (Ag/AgCl = ECS - 45 mV).
94
Murilo Santhiago
___ __
Como pode ser observado na Tabela IV.4, a sensibilidade da curva

analtica obtida est entre as maiores j reportadas. Um dos aspectos que merece
destaque se refere ao potencial de oxidao do NADH. De acordo com a Tabela
IV.4, o presente trabalho apresenta um potencial de deteco para o NADH que
est entre os mais baixos j reportados, resultando assim em uma anlise que
pode minimizar possveis interferentes.
IV.2.10 Estabilidade do sensor

A estabilidade do eletrodos modificados foi avaliada em soluo tampo
fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 fazendo adies sucessiva de NADH e monitorando a
corrente (I) por cronoamperometria. Os eletrodos modificados, armazenados em
temperatura ambiente, apresentaram estabilidade de aproximadamente 3
semanas.
A repetibilidade das medidas e da construo das interfaces tambm
foram
avaliadas.
Depois
de
medidas
sucessivas,
resposta
cronoamperomtrica do sensor para 15 mol L-1 de NADH apresentou um desvio

padro relativo (D.P.R.) 4,7 %. Alm disso, quando a plataforma foi preparada 8
vezes da mesma forma e avaliada em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 o
D.P.R. obtido foi menor que 5,0 %, indicando uma boa repetibilidade.
IV.2.11 Concluses
O mediador redox 3,5-DNB (cido 3,5-dinitrobenzoico) foi imobilizado com
sucesso sobre uma plataforma nanoestruturada formada a partir de uma disperso
de MWCNTs em PEI. Os grupos amino do polmero permitiram que o mediador,
na presena de EDC e NHS, fosse imobilizado na superfcie da plataforma. As
etapas de montagem do sensor foram caracterizadas por MEV e tambm atravs
de ensaios eletroqumicos. Empregando a tcnica de voltametria cclica, foi
possvel obter parmetros cinticos como o n, , ks e o nmero de prtons
envolvidos no processo redox do mediador. Alm disso, a voltametria cclica
possibilitou caracterizar a eletrooxidao do NADH em funo de cada etapa da
95
Murilo Santhiago
___ __
construo do sensor. J os estudos cronoamperomtricos forneceram uma rota

experimental rpida para extrair a constante cintica (kobs) da reao qumica e
ainda calcular o nmero de eltrons envolvidos na reao entre o NADH e o 3,5DNB-ativado. Empregando o EDR foi possvel identificar que a reao entre o
mediador e o NADH ocorre a travs da formao de um complexo de transferncia
de carga, de maneira anloga ao modelo cintico de Michelis-Menten. Alm do
mais, kobs, KM, k+2 e o coeficiente de difuso do NADH em soluo tampo fosfato
0,1 mol L-1 e pH 7,0 foram tambm obtidos atravs dos estudos com o EDR. Vale
a
pena
destacar
que
os
estudos
foram
realizados
aplicando
baixos
sobrepotenciais, cuja caracterstica altamente importante quando se visa a

construo de biossensores. Por fim, a curva analtica, obtida sob condies de
pH neutro, apresentou boa sensibilidade quando comparada com trabalhos j
reportados (Tabela IV.4).
96
Murilo Santhiago
___ __
CAPTULO V
CONCLUSES GERAIS
97
Murilo Santhiago
V.1 Concluses gerais

Este trabalho demonstra a construo de plataformas nanoestruturadas
para a deteco de Cys e NADH. Como material base para a construo foram
empregados nanotubos de carbono de paredes mltiplas funcionalizados com PEI.
As estratgias adotadas permitiram que os mediadores redox 3,5-DNB e DTNB
fossem imobilizados nas diferentes plataformas construdas. O 3,5-DNB foi
empregado na deteco e estudo mecanstico do NADH enquanto que o DTNB foi
utilizado para a quantificao de Cys.
As micrografias do MEV foram teis e possibilitaram identificar o processo
de
funcionalizao
da
plataforma.
Alm
disso,
estudos
eletroqumicos
complementares possibilitaram identificar as pores eletroativas no processo de

montagem da plataforma.
Aps a montagem da plataforma, ambos os mediadores redox
empregados foram facilmente ativados utilizando a voltametria cclica. Aps a
ativao, o par redox R-NO/R-NHOH apresentou boa definio e ainda um Eo em
um sobrepotencial baixo.
Empregando a voltametria cclica foi possvel obter alguns parmetros
cinticos como o n, , ks e np referentes ao processo redox dos mediadores. Os
valores de n, e np esto de acordo com trabalhos j reportados referentes ao
processo redox nitroso-hidroxilamina. J a ks, apresentou valores superiores
muitos trabalhos j reportados, na faixa de 43 50 s-1, indicando uma
comunicao eletrnica rpida mediador-eletrodo.
Alm disso, a voltametria cclica foi empregada com sucesso para
identificar a contribuio de cada material no processo de montagem da
plataforma
nanoestruturada.
Esses
experimentos
possibilitaram
visualizar
claramente o decrscimo do sobrepotencial de oxidao dos analitos estudados.

Os estudos cronoamperomtricos foram empregados aplicando baixos
sobrepotenciais para calcular a constante cintica (kobs) para ambos os sensores,
o coeficiente de difuso as cistena e o valor de n da reao mediador-NADH. As
99
Murilo Santhiago
constantes obtidas (103 104 L mol-1 s-1) esto entre as maiores j reportadas e os
parmetros D e n apresentaram valores prximos de trabalhos j publicados.
O cido 3,5-dinitrobenzoico foi utilizado com sucesso, pela primeira vez,
como mediador redox para detectar o NADH. Adicionalmente, estudos cinticos
foram obtidos utilizando o EDR e a cronoamperometria. Experimentos
empregando o EDR forneceram uma quantidade suficiente de parmetros
cinticos que possibilitaram propor o mecanismo que ocorre na superfcie da
plataforma quando o NADH adicionado. A constante cintica (kobs) foi de
1,62104 L mol-1 s-1, prximo do valor obtido pelos estudos cronoamperomtricos.
Alm disso, outras constantes puderam ser calculadas e forneceram indcios
significativos que o processo na interface da plataforma ocorre de maneira similar
cintica enzimtica de Michaelis-Menten.
As curvas analticas apresentaram sensibilidade de 21 e 70 nA L umol-1
para a deteco de Cys e NADH, respectivamente. J os limites de deteco dos
sensores construdos esto na faixa de 1,2 2,7 mol L-1. Alm disso, os
sensores construdos apresentaram estabilidade de aproximadamente 3 semanas
e a repetibilidade do processo de construo para ambos os sensores apresentou
um desvio padro relativo prximo de 5 %. O sensor destinado a deteco de Cys
foi aplicado em amostras reais e apresentou resultados estatisticamente iguais ao
do mtodo comparativo.
100
Murilo Santhiago
CAPTULO VI
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
101
Murilo Santhiago
VI.1 Referncias bilbiogrficas

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112
Murilo Santhiago
CAPTULO VII
PERSPECTIVAS
113
Murilo Santhiago
VII.1 Perspectivas
O presente trabalho demonstrou que o processo de funcionalizao de
nanotubos de carbono empregando polmeros pode ser facilmente empregado
para imobilizar mediadores redox. Agora, sero concentrados experimentos com o
auxlio de pesquisadores na rea de sntese orgnica no sentido de possibilitar
que uma nica molcula seja capaz de possuir trs caractersticas interessantes:
I) Possuir um arranjo de tomos arquitetado de tal maneira que a molcula seja
imobilizada atravs de um processo no-covalente;
II) Apresentar um grupo nitro em sua estrutura;
III) Apresentar um grupo funcional, preferencialmente R-NH2 ou R-COOH, que
possibilite a imobilizao de uma enzima dependente do processo redox do
NADH.
115

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Murilo Santhiago

CONSTRUO DE PLATAFORMAS NANOESTRUTURADAS

Autor: Murilo Santhiago

Dedico esta dissertao minha famlia,

Universidade Federal de Santa Catarina UFSC, Florianpolis-SC

trmino: 2007 / 2. semestre

Ttulo da monografia: Determinao de cido Rosmarnico Utilizando Sensor

I.2 Mestrado em Qumica

Universidade Estadual de Caminas UNICAMP, Campinas-SP

trmino: 2010 / 1. semestre

Ttulo da dissertao: Construo de Plataformas Nanoestruturadas para

II.0 Produo cientfica

II.1.2 SANTHIAGO, M. ; PERALTA, R. A. ; NEVES, A. ; MICKE, G. A. ; VIEIRA, I.

II.1.5 SANTHIAGO, M. ; LIMA, P. R. ; SANTOS, W. J. R. ; KUBOTA, L. T. An

II.3 Trabalhos completos apresentados em eventos cientficos

Neste trabalho descreve-se o desenvolvimento de dois sensores

carbodimida (EDC) e N-hidroxi succinimida (NHS). J para o sensor destinado

cronoamperometria, MEV e eletrodo de disco rotatrio. Os valores das constantes

This work describes the development of two amperometric sensors using

Deteco de Cys e NADH

Sntese, estrutura e propriedades eletrnicas

Funcionalizao dos nanotubos

Limpeza do eletrodo de trabalho

Sensor para Cys (Sen-Cys)

Sensor para NADH (Sen-NADH)

Preparo das amostras

Estudo de repetibilidade, estabilidade e tempo de vida do

SENSOR PARA CISTENA

Caracterizao da plataforma por MEV

Ativao e caracterizao do par redox

Atividade eletrocataltica da plataforma nanoestruturada

SENSOR PARA NADH

Caracterizao por MEV e imobilizao do mediador

Ativao e caracterizao do par redox

Atividade eletrocataltica da plataforma nanoestruturada

Efeito da ativao dos grupos nitro do mediador

Estudos com eletrodo de disco rotatrio

O grupo R-NO/R-NHOH como mediador redox

Mecanismo da eletrooxidao de NADH na plataforma

CAP. VII PERSPECTIVAS

(cido 3,5-dinitrobenzoico) succinimidil ster

Coeficiente de transferncia de eltrons

Eletrodo de referncia de prata/cloreto de prata

Concentrao de Cys ou NADH (Eq. Cottrell e Eq.III.4)

Separao dos potenciais de pico

Eletrodo de calomelano saturado

Eletrodo de carbono vtreo

Desvio padro relativo

Eletrodo de disco rotatrio

Potencial formal (Epa + Epc / 2)

Anlise por injeo em fluxo

Grafite piroltico altamente ordenado

Corrente cataltica na presena de Cys ou NADH

Corrente limitada pelo transporte de massa

Corrente limitada cineticamente

Corrente na ausncia de Cys ou NADH

Corrente de pico andica

Corrente de pico catdica

Constante cintica da reao mediador-analito

Constante de velocidade heterognea de transferncia de

Microscpio eletrnico de varredura

Mediador redox no estado oxidado

Mediador redox no estado reduzido