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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAU

CENTRO DE CINCIAS DA SADE


DEPARTAMENTO DO CURSO DE FARMCIA
CURSO: FARMCIA
DISCIPLINA: ANLISE BROMATOLGICA
PROFESSORA: Dr. WALESKA FERREIRA DE ALBUQUERQUE

ANLISE MICROBIOLGICA DE GUA E ALIMENTOS E CONTAGEM


PADRO DE PLACAS

Alisson Ribeiro Oliveira 2013947858


Allyson Martins Lopes Sousa 201262944
Ariane Neco de Sousa 201261731
Daiane de Oliveira 200954481
GeffesonWytalo de M. Ferreira 201262597
Jussara Barbosa M. de Carvalho 201260805
Miguel Eusbio P. C. Junior 2010122950
Samara Alves Amorin 201258816

TERESINA-PI
DEZEMBRO- 2014

INTRODUCO

O alimento e a gua so elementos essenciais que todos os seres humanos devem ter
acesso para poder viver. Tanto o acesso " mnima alimentao essencial que seja suficiente,
com valor nutricional adequado e de qualidade", quanto o acesso "gua, suficiente, de
qualidade, aceitvel, fisicamente acessvel e disponvel" so considerados direitos humanos
(BEZERRA et al, 2013).
Os microrganismos esto intimamente associados com a disponibilidade, abundncia e
a qualidade do alimento para consumo humano. Alimentos so facilmente contaminados com
microrganismo da natureza, durante manipulao e processamento. Aps ter sido
contaminado, o alimento serve como meio para o crescimento de microrganismos. Se esses
tiverem condies de crescer, podem mudar as caractersticas fsicas e qumicas do alimento e
podem causar sua deteriorao. Os microrganismos no alimento podem ser responsveis por
intoxicaes e infeces transmitidas por alimentos (PELCZAR JR. et al, 1997).
Alm da identificao do tipo do microrganismo de um meio, tambm importante
em alguns casos sua quantificao. Como exemplo de casos em que a quantificao de
microrganismos torna-se importante, pode-se citar: quantificao da populao de
microrganismos da gua e alimentos para avaliar a qualidade microbiolgica dos mesmos, na
anlise da eficincia de agentes antimicrobianos ou a eficcia de prticas higinico-sanitrias
para se verificar a populao sobrevivente ao tratamento. E, h vrias tcnicas de contagem de
microrganismos.
Assim, os microrganismos podem ser quantificados de forma direta, contando-se
microscopicamente o nmero de clulas presentes num determinado material ou superfcie, ou
indiretamente, efetuando-se anlises da turbidez, determinao do peso seco, concentrao de
substncias qumicas (protenas, pesquisa de determinada enzima ou produto final de uma via
metablica, DNA, RNA) ou atravs da contagem do nmero de microrganismos viveis
utilizando Tcnicas de Contagem Pour-Plate e Spread-Plate.
Os nmeros e tipos de microrganismos presentes dentro ou sobre os alimentos
produzidos podem ser usados para avaliar com segurana a qualidade microbiolgica dos
mesmos. A segurana determinada pela ausncia ou presena de microrganismos
patognicos ou suas toxinas, a quantidade do inculo, e o tempo de controle ou destruio
desses agentes. Testes para organismos indicadores podem ser usados para avaliar tambm a
qualidade microbiolgica ou segurana quando h uma relao entre a ocorrncia de um

organismo indicador e a provvel presena de um patgeno ou toxina for estabelecida,


(DOYLE,

BEUCHAT,

&

MONTIVILLE,

1997).

Segundo

ICMSF

(InternationalCommissiononMicrobiologicalSpecifications for Foods) microrganismos indicadores podem ser agrupados em: (I) Microrganismos que no oferecem um risco direto a
sade: contagem padro de mesfila, contagem de psicrotrficos e termfilos, contagem de
bolores e leveduras. (II) Microrganismos que oferecem um risco baixo ou indireto sade:
coliformes totais, coliformes fecais, Enterococcus, Enterobactriaceaetotais e Escherichia
coli, (SILVA, 2002).
O objetivo desse trabalho relatar e discutir os resultados obtidos nas aulas prticas da
disciplina de Anlises Bromatolgicas. As prticas realizadas foram: pesquisa de coliforme
total e fecal em gua, anlise de alimento (pesquisa da presena de Coliforme total e fecal, S
aureus, salmonela).

METODOLOGIA
I)

CONTAGEM PADRO EM PLACAS


No mtodo de contagem em placas foirealizado por meio de duas tcnicas de

inoculao em placas de petri: Spread Plate e Pourplate . Os objetos Analisados foram


celular, fone de ouvido, relgio e a mo de um dos alunos.
Na tcnica Spread Plate, primeiramente com o uso do swab fez-se o esfregao nos
objetos que iam ser analisados, logo aps, colocou-se o swab em soluo salina (10-1), pegouse 0,1 ml da diluio com pipeta estril e colocou-se no centro da placa estril no meio Agar
Padro de Contagem (PCA), este j se encontrava slido. A seguir fez-se o espalhamento da
amostra coma ala de Drigalski.
Na tcnica de Pourplate, a mesma diluio feita do esfregao dos objetos usados na
tcnica anterior, foi novamente utilizada. Com pipetas estreis transferiu-se 1ml para placas
de Petri estreis; Em seguida, verteu-se de 15 a 20 ml do meio Agar Padro de
contagem(PCA), previamente fundido e resfriado a 45 C. Homogeneizou-se com movimento
rotatrios (em 8) e aguardou-se o meio solidificar.
Nas duas tcnicas as placas foram colocadas na posio invertida, em estufa com
temperatura de 35 C por 24- 48h para a contagem total de microrganismos aerbios
mesfilos.
II)

ANALISE DE GUA
Foi realizado coleta da gua distribuda em um dos bebedouros da UFPI. O bebedouro

possui 2 torneiras de sada de gua. No momento da coleta usou-se gases e lcool 70, para
limpa-las, aps a limpeza deixamos elas abertas por um minuto. Logo a seguir, as amostras de
gua foram coletadas em sacos estreis de 100 ml. No teste presuntivo foram inoculadas 10
ml da gua analisada em cada um dos 10 tubos composto por concentrao dupla de caldo
Lauril Sulfato Triptose, para realizao do teste presuntivo, em seguida, foram incubadas em
estufa a 37C por 48 horas. Para termos a prova confirmatria, foram utilizados 3 tubos de
ensaio contendo de caldo verde brilhante e outros 3 contendo caldo EC. Em todos os tubos foi
inoculada 1 alada da amostra contida no tubo com lauril. Posteriormente foram incubadas em
banho-maria 37C por 48 horas.

III)

ANLISE DE ALIMENTO
O alimento analisado foi um salgado, coletado em saco estril. Na analise

microbiolgica do alimento foram pesados 25g do mesmo e homogeneizado em 225 ml de


gua peptonada, correspondendo diluio 10-1. Para as demais diluies foram utilizados 2
tubos contendo 9 ml de gua cada um. No tubo para diluio 10 -2 foi inoculado 1 ml do frasco
de diluio 10-1. Para diluio 10-3 foi utilizado 1 ml do tubo com diluio 10 -2. Na prova
presuntiva para anlise da presena de coliformes foram usados 9 tubos contendo Lauril
Sulfato Triptose. Em 3 deles foi inoculado 1 ml da diluio 10 -1. Em outros 3, foi utilizado 1
ml da diluio 10-2, e nos 3 ltimos da diluio 10-3. Em seguida, foram incubados em estufa a
37C por 48 horas.
Para anlise de Salmonella sp. foram utilizadas alquotas de 1 ml e 0,1 ml retirados da
gua peptonada e inoculadas em 10 ml de caldo rappaport. Esses tubos foram incubados em
estufa a 37C por 24 horas. Passadas 24 horas foram retiradas alquotas de cada meio e, com o
auxlio de uma ala de nquel-cromo, foram estriadas em placas de petri contendo os meios de
cultura Agar Entrico Hektoen (HEA) e Agar Salmonella/Shigela (SS). As placas foram ento
incubadas por 24 horas. Para anlise deStaphylococcus sp. foi retirada uma alquota de 0,1 ml
de cada diluio e, com o auxlio de uma ala de Drigalski, foram distribudas na superfcie
do meio ABP (Agar BairdPaker). As placas foram incubadas invertidas em estufa a 37C por
48 horas.

RESULTADOS

TABELA 1.0 - REGISTRO DA CONTAGEM DE PLACA PELA TCNICA DE SPREAD


PLATE E POUR PLATE. TERESINA-PI, 2014.
OBJETO
Relogio
celular
Mo
Fone

TCNICA
Spread Plate
18
139
Incontvel
Incontvel

Pour Plate
52
138
157
73

FONTE: LABORATRIO DE ALIMENTOS DA UFPI, ALUNOS DE FARMCIA 2014.2.

TABELA 2.0. REGISTRO DA ANLISE MICROBIOLGICA DE GUA DO


BEBEDOURO DA BIBLIOTECA DA UFPI, UTILIZANDO COMO MEIO DE CULTURA
O LAURIL SULFATO TRIPTOSE EM DUPLA CONCENTRAO TERESINA, 2014.
LOCAL DE COLETA
BEBEDOURO DA

TURVAO

PRESENA DE GAS

BIBLIOTECA
FONTE: LABORATRIO DE ALIMENTOS DA UFPI, ALUNOS DE FARMCIA 2014.2.
LEGENDA: (-) NEGATIVO.

TABELA 3.0 - REGISTRO DA ANLISE DO NMERO MAIS PROVVEL DE


COLIFORMES FECAIS EM AMOSTRA DE ALIMENTO, INOCULADAS NOS MEIOS
DE CULTURA LAURIL SULFATO TRIPTOSE. TERESINA PI, 2014.
MEIO DE CULTURA
CALDO LAURIL

DILUIO / TUBOS
10-1

SULFATO TRIPTOSE

10-2

10-3

CRESCIMENTO

(1)

(-)

(2)

(-)

(3)

(-)

(1)

(-)

(2)

(-)

(3)

(-)

(1)

(-)

(2)

(-)

(3)

(-)

FONTE:LABORATRIO DE ALIMENTOS DA UFPI, ALUNOS DE FARMCIA 2014.2


LEGENDA: ( - ) NEGATIVO.
TABELA 4.0 REGISTRO DA ANLISE GAR ENTRICO HEKTOEN (HEA), GAR
SALMONELLA/SHIGELA (SS), GAR DE FERO COM TRS AUCARES (TSI) E
GAR LISINA FERRO (LIA) OBTIDA DA AMOSTRA DE ALIMENTO. TERESINA-PI,
2014.
TESTES

RESULTADO

HES

(-)

SS

(-)

TSI

(-)

LIA

(-)

FONTE: LABORATRIO DE ALIMENTOS DA UFPI, ALUNOS DE FARMCIA 2014.2.


LEGENDA:( - ) NEGATIVO.

TABELA 5.0 REGISTRO DO TESTE DA COAGULASE E CATALASE DA AMOSTRA


DE ALIMENTO. TERESINA-PI, 2014.
TESTES

RESULTADO

CATALASE

(+)

COAGULASE

(-)

FONTE: LABORATRIO DE ALIMENTOS DA UFPI, ALUNOS DE FARMCIA 2014.2.


LEGENDA: ( + ) POSITIVO; ( - ) NEGATIVO.

TABELA 6.0- REGISTRO DA ANLISE DA PRESENA/AUSNCIA DE Salmonella EM


AMOSTRA DE ALIMENTO OBTIDO NA UFPI E INOCULADAS NOS MEIOS DE
CULTURA LAURIL SULFATO TRIPTOSE. TERESINA, 2014.
MEIO DE CULTURA

CRESCIMENTO NO MEIO DE CULTURA

CALDO RAPPAPORT

(-)

AGAR Salmonella/Shigela

(-)

AGAR ENTRICO HEKTOEN

(-)

FONTE: LABORATRIO DE ALIMENTOS DA UFPI, ALUNOS DE FARMCIA 2014.2


LEGENDA: ( - ) NEGATIVO.

DISCUSSO

Para a contagem padro em placas utilizou-se para a quantificao de grupos


microbianos, como S. aureus; que na inoculao da amostra homogeneizada em um meio
slido, contido em placas de petri, seguida da incubao das placas at crescimento visvel,
cada clula microbiana presente na amostra ir formar uma colnia isolada, no qual se
variando o meio de cultura e as condies de incubao possvel selecionar o grupo, gnero
ou espcie que se deseja contar, ressaltando que essa correlao feita entre o nmero de
colnias e o nmero de Unidades Formadoras de Colnia UFC, que podem ser tanto
clulas individuais como agrupamentos caractersticos de cada microorganismo. (SILVA et
al, 2007).
A diferena de um mtodo para o outro que o mtodo Pour-Plate coloca-se,
primeiramente, a alquota de 1 ml da amostra com os microrganismos em uma Placa de Petri
estril sem, o meio de cultura, pois esse ser colocado por cima dos microrganismos na placa.
E, na tcnica Spread-Plate o meio de cultura j se encontra na placa e os microrganismos
so colocados por cima do meio e so espalhados com o auxlio da Ala. Para o mtodo de
Spread-Plateforam encontrados os seguintes valores: relgio (180 UFC), celular (139 UFC),
mo (incontveis), fone (incontveis). Para o mtodo Pour-Plateforam: relgio (520 UFC),
celular (138 UFC), mo (1570), fone (730).
O mtodo do NMP de contagem de coliformes totais e termotolerantes em gua e
alimentos consiste em trs etapas: 1 (presuntivo)- seria a inoculao da amostra em tubos
contendo caldo lauril sulfato triptose (LST) que contm lactose e a observao de
crescimento com

produo de gs (tabela 2.0) a partir da lactose, aps 24-48 hrs de

incubao a 35C considera suspeita da presena de coliformes; 2 (confirmatria)- a


observao de crescimento com produo de gs nos tubos de VB (verde brilhante bile 2%),
aps 24-48 horas de incubao a 35C considerada confirmativa da presena de coliformes
totais; j a produo e gs nos tubos de EC (caldo E.coli) so considerados positivos para a
presena de coliformes termotolerantes; 3 (confirmatrio para E.coli)- os tubos EC positivos
so suspeitos para a presena de E.coli que so inoculados em meio seletivo diferencial para
E. coli, (L-EMB), e que se houver desenvolvimento de colnias tpicas elas so isoladas para
as provas bioqumicas de indol, VM, VP e citrato (SILVA et al, 2007).

Na amostra de gua foi investigada a presena ou no de coliformes totais e


termotolerantes (fecais); que segundo Franco e Landgraf (2008), os coliformes totais um
grupo composto por bactrias da famlia Enterobacteriaceae, capazes de fermentar a lactose
com produo de gs, quando incubados a 35-37 C, por 48 horas, sendo bacilos gramnegativos e no formadores de esporos possuindo como representante a E. coli; j os
coliformes fecais um grupo que incluem as bactrias dos coliformes totais que tem a
capacidade de continuar fermentando lactose com produo de gs, quando incubadas
temperatura de 44-45,5C. Nessas condies cerca de 90% das culturas de E. coli so
positivas, enquanto entre os demais gneros, apenas algumas cepas de Enterobacter e
Klebsiella mantm essa caracterstica, sendo negativo as amostras conforme pode ser visto na
tabela 2.0 porque no ouve turvao do meio nem produo de gs.
Na amostra do alimento (empada)foram realizados a investigao de Coliformes,
Salmonellac dando negativas conforme pode ser visto nas tabelas 3.0, 4.0 e 6.0 e para
Staphylococcus, sendo positivo para o teste de catalase conforme visto na tabela 5.0.
Para a investigao da Salmonella h primeiro um enriquecimento em caldo seletivo
objetivando inibir a multiplicao da microbiota acompanhante e promover a elevao
preferencial do nmero de clulas de Salmonella, um dos meios utilizados o caldo
Rappaport e sua seletividade baseada na presena de verde de malaquita oxalato, na alta
presso osmtica e no pH relativamente cido (5,1). Em seguida h o plaqueamento seletivo
diferencial que promove o desenvolvimento preferencial de Salmonella, com caractersticas
tpicas que as distinguem dos competidores, um dos exemplos desse meio de cultura o gar
Entrico de Hectoen (HE) que diferencia a bactria atravs da no fermentao da lactose e da
produo de cido sulfdrico (H2S); e por fim tem-se a confirmao que as colnias so, ou
no, de Salmonella atravs de provas bioqumicas (SILVA et al, 2007).
A contagem do S. aureus em alimentos tem como objetivo: confirmar o envolvimento
em surtos de intoxicao alimentar, verificar se o alimento uma fonte potencial ou indicar
contaminao ps-processo (SILVA et al, 2007).
As principais caractersticas seletivas utilizadas no isolamento de S. aureus so a
habilidade de crescer na presena de NaCl (5,5-10%), telurito de potssio (0,0025-0,05%),
cloreto de ltio (0,01-0,05%), glicina (0,12-1,26%) e polimixina (40 mg/l) e as caractersticas
diferenciais so: a capacidade de reduzir o telurito de potssio (produzindo colnias pretas em
meios slidos), a capacidade de hidrolisar a gema de ovo, capacidade de utilizar o manitol e

de crescer a 42-43C em condies seletivas, a atividade de coagulase e atividade de


termonuclease (SILVA et al, 2007).
O meio mais amplamente utilizado o gar Baird- Parker (ABP) que combina o
telurito de potssio, glicina e cloreto de ltio; a presena de colnias aps a incubao a 3537C/45-48hrs formam colnias circulares, pretas ou cinzas escuras, com 2-3 mm de
dimetro, lisas, convexas, com bordas perfeitas, massa de clulas esbranquiadas nas bordas,
rodeadas por uma zona opaca e/ou transparente se estendendo para alm da zona opaca
(SILVA et al, 2007). Sendo positivo para este teste.

CONCLUSO

As aulas prticas realizadas tiveram notvel relevncia no aprendizado das anlises


microbiolgicas e deixou claro sua importncia para a determinao da segurana e
potabilidade das amostras, gua e alimentos. O presente trabalho apontou que os produtos
esto dentro das condies de segurana para o consumo humano, uma vez que no apontam
valores significativos para a presena de microrganismos prejudicais para a sade, no
acarretando na condenao dos produtos.

REFERENCIA BIBLIOGRFICA

BEZERRA, Ilana Nogueira et al. Consumo de alimentos fora do domiclio no Brasil.Rev.


Sade Pblica, So Paulo, v. 47, supl. 1, Feb. 2013.
FRANCO, B.D.G.M. & LANDGRAF, M.; Microbiologia dos Alimentos. 1 ed, So Paulo:
editora Atheneu, 2008.
PELCZAR JR. et al. Microbiologia: conceitos e aplicaes. 2.ed. So Paulo: McGraw-Hill,
1997. v.2. p.372-397.
SILVA, M. C. Avaliao da qualidade microbiolgica de alimentos com a utilizao de
metodologias convencionais e do sistema simplate. 2002. Tese (Mestre em Cincias)
Escola Superior de Agricultura, Universidade de So Paulo, 2002, Piracicaba. Disponvel em
http://www.teses.usp.br/. Acesso em: 12 dezembro 2014.
SILVA, Neusely. et al. Manual de mtodos de anlises microbiolgica de alimentos. 3. ed.
So Paulo: Livraria Varela, 2007.