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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS


DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

Nombre del alumno:

Grupo 5QM2

FUNDAMENTO
El mtodo de Lowry basa en el desarrollo de color, mediante una reaccin que se efecta
en dos etapas. La primera de ellas consiste en la formacin de un complejo colorido entre
el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. Cu2+ se acompleja
con 4 NH. La segunda es la reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteu por el complejo
cobre-protena, dando finalmente un color azul, la intensidad de coloracin es
directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) que se lee a
590nm, la coloracin permanece estable por 2 horas. El color producido depende del
contenido de tirosina y triptfano en la protena.
El mtodo de Bradford para la determinacin de protenas implica la reaccin del azul
brillante de Coomassie G-250 con las protenas, originando un complejo colorido que se
lee a 595 nm, el color desarrollado permanece estable por 1 hora. Esta reaccin es
independiente de la composicin de aminocidos de las protenas. Este mtodo es
sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su
determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones
bsicas.
OBJETIVOS

Elaborar una curva de calibracin para la cuantificacin de protenas empleando un


mtodo fotomtrico.
Determinar si hay diferencia estadsticamente significativa entre la precisin y la
exactitud entre los mtodos de Bradford y Lowry.
Conocer el efecto de sustancias no protenicas, en el desarrollo de color.
Analizar las ventajas y desventajas del mtodo de Lowry, con respecto a otros
mtodos para la cuantificacin de protenas.

RESULTADOS
Lowry Albumina
Curva de calibracin por mtodo de Lowry.
No. Tubo
Cantidad de protena (g)
A 590 nm
Serie "a"
Serie "b"
1
25
0.073
n/a*
2
50
0.111
n/a*
3
75
0.123
0.152
Replicas para el anlisis estadstico
4
100
0.157
0.161
No. Tubo
A 590 nm
Cantidad de protena
5
125
0.199
0.188
(g)
1

0.211

89.037

0.177

76.444

0.179

77.185

0.196

83.481

0.209

88.296

0.192

82.000

0.205

86.815

0.159

69.778

0.165

72.000

10

0.263

108.296

0.073
0.111
0.137
0.159
0.387

83.33

S
S^2

11.014
121.30

% C.V.

13.22
91.211414
7
75.455251
9

Efecto de sustancias no protenicas en el Mtodo de Lowry


No. Tubo

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Sustancia

A
Cantidad de
Tipo de Interferencia
590
protena
nm
(g)
Tris 1 M, pH 7.0
0.08
42.37
Negativa
5
Glicerol al 1%
0.05
31.63
Negativa
(v/v)
6
Detergente
0.01
16.44
Negativa
comercial 1%
5
SDS al 1.0%
0.04
27.93
Negativa
6
TCA al 5%
0.03
25.33
Negativa
9
Fenol al 1%
0.21
91.26
Positiva
7
Mercaptoetanol
0.02
19.41
Negativa
al 0.1%
3
Tris 1 M, pH 10.0
0.05
32.37
Negativa
8
Prueba "t" de Student
Urea al 5%
0.04
27.93
Negativa
61.67
6Hay diferencia significativa
(NH4)2SO4
0.03
22.74
Negativa
2

0.45
0.4
0.35
0.3

f(x)==0.75
R
0x - 0.03

0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
20

40

60

80

100

120

Bradford Albumina
Curva de calibracin por mtodo de Bradford.
No. Tubo
Cantidad de protena (g)
Serie "a"
1
25
0.233
2
50
0.33
3
75
0.471
4
100
0.481
5
125
0.501
Replicas para el anlisis estadstico
No.
Tubo

A 590
nm

Cantidad de
protena (g)

0.444

93.000

174.21

30.415

0.435

172.000

S^2

925.06

0.424

167.926

17.46

0.474

186.444

0.47

184.963

0.507

198.667

0.495

194.222

0.458

180.519

0.432

170.889

10

0.493

193.481

% C.V.

195.96708
9
152.45513
3

A 590 nm
Serie "b"
0.214
0.336
0.415
0.449
0.518

0.224
0.333
0.443
0.465
0.510

No.
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Efecto de sustancias no protenicas en el Mtodo de Bradford


Sustancia
A 590 nm Cantidad de protena
Tipo de Interferencia
Prueba "t" de Student
(g)

158.36
Tris 1 M,
pH 7.0
Glicerol al 1% (v/v)
Detergente comercial
1%
SDS al 1.0%
TCA al 5%
Fenol al 1%
Mercaptoetanol al
0.1%
Tris 1 M, pH 10.0
Urea al 5%
(NH4)2SO4

Hay diferencia354.22
significativa
0.927
0.932
356.07
0.921
352.00
0.324
0.877
1.013
0.967

130.89
335.70
386.07
369.04

Negativa
Positiva
Positiva
Positiva

0.97
0.975
0.908

370.15
372.00
347.19

Positiva
Positiva
Positiva

0.6
0.5

f(x) = 0x + 0.18
R = 0.93

0.4
0.3
0.2
0.1
0
20

40

60

Positiva
Positiva
Positiva

80

100

120

Lowry Hemoglobina

No. Tubo
1
2
3
4
5

Curva de calibracin por mtodo de Lowry.


Cantidad de protena (g)
A 590 nm
Serie "a"
Serie "b"
25
0.098
0.098
50
0.201
0.209
75
0.236
0.266
100
0.347
0.328
125
0.413
0.405

0.098
0.205
0.251
0.337
0.409

Replicas para el anlisis estadstico


No. Tubo A 590 nm
Cantidad de protena
(g)
1
0.287
83.552
2
0.296
86.501
3
0.276
79.948
4
0.266
76.671

80.90
5
0.273
78.965
6
0.264
76.016
S
5.576
S^2
31.10
7
0.305
89.450
8
0.25
%71.429
C.V.
6.89
9
0.296
86.501

84.8866339
10
0.276
79.948
76.90891

No.
Tubo

Efecto de sustancias no protenicas en el Mtodo de Lowry


Sustancia
A 590 nm Cantidad de protena
Tipo de Interferencia
(g)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Tris 1 M, pH 7.0
Glicerol al 1% (v/v)
Detergente comercial
1%
SDS al 1.0%
TCA al 5%
Fenol al 1%
Mercaptoetanol al
0.1%
Tris 1 M, pH 10.0
Urea al 5%
(NH4)2SO4

0.14
0.227
0.198

35.39
63.89
54.39

Negativa
Negativa
Negativa

0.224
0.194
2.033
0.245

62.91
53.08
655.64
69.79

Negativa
Negativa
Positiva
Negativa

0.162
0.267
0.288

42.60
77.00
83.88

Negativa
Negativa
Negativa

Prueba "t" de Student


Hay diferencia significativa

37.28
0.45
0.4

f(x)==0.99
R
0x + 0.03

0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
20

40

60

80

100

120

Bradford Hemoglobina

Curva de calibracin por mtodo de Bradford.


No. Tubo
Cantidad de protena (g)
A 590 nm
Serie "a"
Serie "b"
1
25
0.276
0.222
2
50
0.376
0.382
3
75
0.503
0.477
Prueba "t" de Student
4
100
0.546
0.492
50.94
5
125 Hay diferencia significativa
0.534
0.512

0.249
0.379
0.490
0.519
0.523

96.22
Replicas para el anlisis estadstico
No.
A 590 nm
Cantidad de protena
Tubo
(g)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
No.
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

0.478
91.715
0.492
96.802
0.486
94.622
0.489
95.712
0.5
99.709
0.47
88.808
0.472
89.535
0.479
92.078
0.52
106.977
0.518
106.250
Efecto de sustancias no protenicas en el Mtodo de Bradford

Sustancia
A 590 nm Cantidad de protena
Tipo de Interferencia
S
6.401
(g)
S^2
40.97
Tris 1 M, pH 7.0
0.518
106.25
Positiva
%
C.V.
6.65
Glicerol al 1% (v/v)
0.505
101.53
Positiva

100.79930
Detergente comercial
0.494
97.53
Positiva
9
1%
91.642551
SDS al 1.0%
0.119
-38.74
Negativa
3
TCA al 5%
0.501
100.07
Positiva
Fenol al 1%
0.488
95.35
Positiva
Mercaptoetanol al 0.1%
0.532
111.34
Positiva
Tris 1 M, pH 10.0
0.513
104.43
Positiva
Urea al 5%
0.504
101.16
Positiva
(NH4)2SO4
0.507
102.25
Positiva

0.6
0.5

f(x) = 0x + 0.23
R = 0.85

0.4
0.3
0.2
0.1
0
20

40

60

80

100

120

DISCUSIN DE RESULTADOS DE LOWRY

- Curva de calibracin
La grafica relaciona valores de absorbancia con la concentracin conocida de nuestros
estndares, se observa que hay un aumento en el valor de absorbancia relacionado al
aumento de la concentracin, donde se podra suponer que cumple la Ley de Bouguer y
Beer; sin embargo los lmites establecidos donde el error es mnimo en el estudio
espectrofotomtrico de una sustancia estn entre 0.2 y 0.8 para la absorbancia.
Comparando los datos obtenidos, que sealan que la mxima absorbancia trabajada fue

de 0.405; podemos decir que la curva tipo posee un error considerable para la
determinacin de Hemoglobina, ya que el mtodo es poco sensible y es recomendado
para la determinacin de protenas a concentraciones mayores a 100 g/mL.
-Anlisis estadstico
De acuerdo a la tcnica, las replicas eran del tubo numero tres de la curva de calibracin,
la concentracin utilizada de protena fue de 75 g/mL, de acuerdo a las lecturas de
absorbancia las concentraciones utilizadas fueron de 80.90 g/mL en promedio. Esto nos
indica que el mtodo de lowry es menos sensible en comparacin con el mtodo de
Bradford, esto se ve reflejado en los resultados de este anlisis, esto quiere decir que
podemos tener mas margen de error en lowry, esta variacin pudo deberse a una mala
medicin de los volmenes del analista.
El coeficiente de variacin nos dio de 6.89, podemos decir que existe error en cuanto a
precisin en los resultados, pues el valor mximo aceptado es del 5%.
-Interpretacin de los resultados del efecto de las interferencias.
Segn los lmites de confianza calculados, obtenemos que una interferencia positiva es
aquella que aumenta la lectura de absorbancia sobre los intervalos de confianza para la
concentracin y una interferencia negativa aquella que provoca una disminucin en los
valores de absorbancia sobre los lmites de confianza para la concentracin.
Y de acuerdo a la bibliografa consultada los agentes que acidifican la reaccin en este
caso el Tris, el EDTA y los reductores de Cu como el mercaptoetanol, sern interferentes
de la reaccin. El fenol por su estructura dara falsos positivos.
DISCUSION DE RESULTADOS DE BRADFORD

-Curva de calibracin
Al igual que en el mtodo de Lowry, se observa que hay un aumento en el valor de
absorbancia relacionado al aumento de la concentracin de la Hemoglobina, sin embargo
aqu la pendiente es mayor, esto nos indica que la sensibilidad de este mtodo es mayor
que en el mtodo de Lowry, ya que permite trabajar con concentraciones ms bajas de
protena.
-Anlisis estadstico.
A pesar de que el mtodo de Bradford es ms sencillo y rpido, el % de coeficiente de
variacin obtenido fue mayor que en Lowry, que podemos adjudicarlo a la sensibilidad del
mtodo.
-Comparacin entre los dos mtodos para Hemoglobina
Albumina

Diferenci
a
3.963

Di - D-

(Di - D-)2

93

M de
Estndar(L)
89.037

-86.914

172

76.444

95.556

4.679

3
4

167.926
186.444

77.185
83.481

90.741
102.963

-0.136
12.086

5
6
7

184.963
198.667
194.222

88.296
82.000
86.815

96.667
116.667
107.407

5.790
25.790
16.530

180.519

69.778

110.741

19.864

9
10

170.889
193.481

72.000
108.296

98.889
85.185

8.012
-5.692

7554.0498
3
21.888882
1
0.0185464
146.05975
8
33.520669
665.1241
273.24702
2
394.58732
4
64.192144
32.402237
1

No.
Tubo
1

M. de Prueba (B)

90.877
Hemoglobina
No. Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

M. de
Prueba (B)
91.715
96.802
94.622
95.712
99.709
88.808
89.535
92.078
106.977
106.25

M de
Estndar(L)
83.552
86.501
79.948
76.671
78.965
76.016
89.450
71.429
86.501
79.948

Diferencia

Di - D-

(Di - D-)2

8.163
10.301
14.674
19.041
20.744
12.792
0.085
20.649
20.476
26.302

-7.159
-5.021
-0.648
3.719
5.422
-2.530
-15.237
5.327
5.154
10.980

51.2479783
25.2069797
0.41935385
13.8306978
29.4022768
6.39952068
232.15219
28.3814952
26.5672692
120.569725

15.322

n <t tablas
t calculada= D
SD

No hay diferencia significativa en la exactitud.

37.28 > 2.262 Existe diferencia significativa en la exactitud entre los dos mtodos.
50.94 > 2.262 Existe diferencia significativa en la exactitud entre los dos mtodos.

Fcalculada =

S 2 mayor
< F tablas
S 2 menor

No hay diferencia significativa en la precisin.

1.31< 3.78 No existe diferencia significativa en precisin entre los dos mtodos.
Mtodo

Lowry

Bradford

Mtodos colorimtricos
Rango de
Ventajas
sensibilidad
(g)
25-100 a 500 Tiene bastante
nm
Sensibilidad
2-30 a 660 nm
Presenta alta estabilidad
1-2 a 750 nm

1-15

Muy sensible
Rpido
y
desarrollo

de

fcil

Desventajas

No todas las protenas


reaccionan igual.
Muestra
muchas
interferencias como
detergentes
no inicos,
sulfato amnico etc
Muestra interferencias con
detergentes

CONCLUSIONES

Se elaboraron las curvas de calibracin para la cuantificacin de Hemoglobina


empleando el mtodo de Lowry y Bradford.
De acuerdo a los resultados obtenidos experimentalmente existe diferencia
significativa en la exactitud entre ambos mtodos siendo Lowry el ms exacto.
De acuerdo a los resultados obtenidos experimentalmente no existe diferencia
significativa en la precisin entre ambos mtodos.
Las interferencias de sustancias no protenicas pueden ser positivas o negativas.
El glicerol, el detergente comercial, SDS, urea son interferentes negativos.
El tris, fenol, sulfato de amonio, TCA, mercaptoetanol son interferentes positivos.
El mtodo de Lowry no es muy sensible en comparacin con el mtodo de Bradford.

BIBLIOGRAFA
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Proteinas_8075.pdf
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA
%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE%20PROTE%C3%8DNAS.pdf