AMPLIFICACIN DE UNA REGIN DEL GEN DE LA BETA GLOBINA

MEDIANTE LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

NDICE
Introduccin (Fundamento)_______2
Objetivo___________________________4
Material___________________________5
Metodologa_______________________6
Resultados________________________13
Conclusin________________________15
Bibliografa________________________15

Introduccin
1

Una de las herramientas de biologa molecular ms tiles

en el anlisis de cidos nucleicos es la Reaccin en Cadena
de la Polimerasa (PCR). Es una tcnica in vitro utilizada para
amplificar enzimticamente una regin determinada de
ADN situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se
conoce. Mientras que antes solo podan obtenerse
cantidades mnimas de un gen especfico, ahora incluso un
nico ejemplar de un gen puede amplificarse con la PCR
hasta un milln de ejemplares en tan solo unas pocas
horas.
Las tcnicas de PCR se han hecho indispensables para
muchos procedimientos comunes, como la clonacin de
fragmentos especficos de ADN, la deteccin e
identificacin de genes para diagnstico y medicina legal, y
en la investigacin de modelos de expresin de los genes.
Ms recientemente, la PCR ha permitido la investigacin de
nuevos campos, como el control de la autenticidad de los
alimentos, la presencia de ADN modificado genticamente
y la contaminacin microbiolgica.

Fundamento
Durante la Reaccin en Cadena de la Polimerasa se
multiplica in vitro un fragmento de cido nucleico, y la
reaccin imita un fenmeno de replicacin del DNA que
ocurre en forma natural en la clula. La reaccin necesita la
presencia de:
- Una cadena de DNA blanco donde se encuentra el
fragmento que se desea amplificar.
- Un par de iniciadores (cadenas sencillas de DNA entre
15-30 nucletidos, tambin llamados cebadores o primers,
que son diseados especficamente para secuencia a

amplificar) que limita de forma especfica la longitud del

segmento que se va amplificar.
- Nucletidos que son precursores de las nuevas cadenas
de DNA (adenina, timina, guanina y citosina).
- La enzima Taq DNA polimerasa, la cual una vez que los
iniciadores flanquean la secuencia blanco, va a formar las
cadenas nuevas.
En esta sntesis artificial de segmentos de DNA en ciclos,
las cantidades del segmento a estudiar son producidas en
progresin geomtrica durante el transcurso de 30 ciclos de
sntesis de DNA. Al final se obtienen cientos de millones de
copias del segmento amplificado en un tubo de reaccin.
Los pasos de la sntesis en cada ciclo son los siguientes:
1-. Desnaturalizacin: En este paso, realizado a
las cadenas moldes del DNA se separan.

94C,

2-. Alineamiento: En este paso, los iniciadores se unen

por complementariedad de bases al DNA molde en estudio
en sitios que flanquean el fragmento que se desea
amplificar.
3-. Extensin: La enzima Taq DNA polimerasa, que es una
enzima que resiste altas temperaturas, polimeriza el
segmento de DNA complementario al molde a partir de los
iniciadores.
Estos pasos son llevados a cabo de manera automatizada
por un aparato llamado termociclador, el cual programa los
ciclos de tiempos y temperaturas apropiadas para cada
reaccin de PCR.

 Objetivo
Entender el fundamento de la metodologa de amplificacin
de material gentico mediante la Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR).
En esta prctica se realizar la amplificacin por PCR, a
partir de DNA genmico humano, de un segmento de 268
pb del gen de la -globina que puede analizarse en un gel
de agarosa teido con bromuro de etidio y observado con
luz ultravioleta.

 Material
-

Juego de micropipetas de precisin 10, 20 y 200 L.

Guantes.
Puntillas para micropipetas de 10, 20 y 200 L.
Tubos Eppendorf de 0.2 mL.

Equipo:
-

Termociclador con tapa caliente.

Cmara de electroforesis horizontal.
Fuente de poder.
Transiluminador UV.
Fotodocumentador UVP.

Reactivos:
-

Iniciador BG-1 (5 M).

Iniciador BG-2 (5 M).
Dinucletidos trifosfatados de dNTPs (10 mM).
Solucin de MgCl2 para PCR (25 mM).
Taq DNA polimerasa (5 U/L).
Amortiguador para Taq DNA polimerasa (10X).
Agua ultra pura.
Jugo naranja.
Buffer Tris-Borato-EDTA (TBE) 1X.
Agarosa al 2% en TBE 1X.
Solucin de Bromuro de etidio (0.3 g/mL).

 Metodologa
- Nota: El montaje de la reaccin de amplificacin (PCR)
se deber de hacer con guantes y sin hablar para evitar
la contaminacin con DNA diferente al que se quiere
analizar.
1. Se realizara la mezcla de reaccin con los siguientes
reactivos y medidas (preparacin: ver la tabla 1).
Tabla 1. Mezcla de reaccin para la PCR.
Reactivo
Buffer Taq (10x)
Iniciador BG1 (M)
Iniciador BG2 (M)
dNTPs (0.2 mM)
MgCl2 (2 mM)
Agua ultra pura
Taq DNA polimerasa (5 U/L)

Vol. Por tubo (L)

15 L
15 L
15 L
3 L
12 L
57 L
3 L

Pasos para la mezcla de reaccin (segn la tabla

anterior).

1.

3.

5.

7.

2. Buffer

Taq.

4.

6.

8.

2. Se le entregar a cada equipo 4 tubos Eppendorf de 0.2

mL y se les agregar 20 L de mezcla de reaccin a cada
uno.

3. Marcar el tubo No. 1 como control +. A este se le agrega

250 ng de DNA control volumen total de 5 L, mismo que
le ser entregado por el responsable a cargo.
4. Marcar 3 tubos como problema 1, 2, y 3. En cada tubo se
colocar 5 L del DNA obtenido mediante la tcnica de
TSNT en la prctica de extraccin de DNA.

5. Marcar el ltimo tubo Eppendorf de 0.2 mL como testigo

negativo y colocar en este 5 L de agua ultra pura.

6. Mezclar y centrifugar
microcentrfuga.

por

segundos

en

la

7. Mantener los tubos en hielo hasta que sean colocados

todos los tubos del grupo en el termociclador
programado con las siguientes temperaturas y tiempos.

Programa del termociclador:

Paso
1

Temperatura
94C

Tiempo
5 min

94C

30 seg

3
4
5

57C
72C
Ir al paso 2,25
ciclos

30 seg
2 min

Observaciones
Desnaturalizaci
n inicial
Desnaturalizaci
n
Alineamiento
Extensin

6
7

72C
Fin

5 min

Extensin final

8. Encender el Termociclador, elegir la opcin Run y

encontrar el programa de la -globina con las
condiciones de temperatura y tiempos correspondientes.

9. Depositar los tubos dentro del Termociclador y cerrar

(verificar que la tapa del Termociclador quede en
contacto con la tapa de los tubos).
10.
Se inicia el programa de PCR seleccionando
Enter.

10

11.
El programa de PCR en el Termociclador dura 2
horas. Cuando termina la amplificacin los tubos se
almacenan a 4 C.
12.
Mezclar 5 L de cada producto amplificado con 1 L
de jugo naranja.
13.
Agregar los 6 L de cada producto en los pocillos
de un gel de agarosa al 2%.

14.
Colocar en un carril 5 L del marcador de peso
molecular pBS cortado con la enzima Msp I.
15.
Activar la electroforesis a 100 V por 40 minutos.

11

16.
Teir el gel con bromuro de etidio por 5 a 10 min y
visualizar con luz ultravioleta en el Transiluminador.
17.
Documentar la imagen en el fotodocumentador
UVP.

12

 Resultados
1. Anexar la imagen del gel con los resultados obtenidos del
PCR, identificando cada carril.
2. Realizar la interpretacin del gel, incluir la descripcin de
cada carril, comparar el tamao del producto amplificado
con el marcador de peso molecular, as como la
descripcin del control negativo.
3. Anotar sus comentarios finales sobre el desarrollo y los
resultados de esta prctica.

13

MPM: Marcador de peso molecular.

C (+): Control positivo de amplificacin.
C (-): Control negativo (agua ultra pura).

En esta prctica se muestra el gen de la -globina y la regin

amplificada por PCR, donde se obtiene un fragmento de 268
pb que se analiz en un gel de agarosa al 2% teido con
bromuro de etidio y fue observado con luz ultravioleta.
Para verificar el resultado de una reaccin de PCR, es
necesario emplear un control negativo al que se le agrega
agua ultra pura en lugar del DNA (por lo cual no debe
amplificar), lo que permite monitorear la presencia de
contaminacin con producto amplificado o DNA que
repercutira en un diagnstico errneo.

14

 Conclusin
El estudio de los cidos nucleicos (DNA y RNA) mediante la
PCR tiene numerosas aplicaciones dentro de la medicina como
el estudio y diagnstico de enfermedades infecciosas, cncer
y enfermedades genticas entre otras.
La PCR es una tcnica poderosa usada para amplificar el ADN
millones de veces, por la repetida rplica de una plantilla, en
un corto perodo de tiempo. El proceso utiliza sistemas de
oligonucletidos sintetizados in vitro especficos para preparar
la sntesis del ADN. La tcnica se realiza durante muchos
ciclos (generalmente 30) para derretir la plantilla de ADN a
alta temperatura, permitiendo que los primers se alineen a las
secuencias complementarias dentro de la plantilla de ADN y
despus la replicacin de la plantilla con la polimerasa de
ADN.

15

En esta prctica se cumpli con el objetivo de la amplificacin

por PCR, a partir de DNA genmico humano, de un segmento
de 268 pb del gen de la -globina que se analiz en un gel de
agarosa y observado con luz ultravioleta.

Bibliografa
http://themedicalbiochemistrypage.org/es/molecularmedicine-sp.php
http://web.udl.es/usuaris/e4650869/docencia/segoncicle/gencl
in98/temes_teoria/diagostic_mol/diagno2.html
http://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/pcr-13299
http://revistas.ucr.ac.cr/index.php/medica/article/view/7869

16